蜜蜂作为重要的社会性昆虫，具有巨大的生态价值和经济价值[1]。全球的87种粮食作物（占粮食总产量的35%）依靠昆虫来授粉[2]，蜜蜂占授粉昆虫总数的80%[3]，是最为主要的授粉昆虫，是农业实现绿色发展的重要一环。西方蜜蜂出现大规模蜂群崩溃的现象（Colony Collapse Disorder，CCD），引起各界广泛的关注，调查其原因时发现化学农药乱用是重要因素之一，并指出新烟碱类杀虫剂对蜜蜂具有很大影响力[4]。

在收到的104份统计结果中，有64.8%的志愿者为在校研究生，其余本科生各个年级均有分布。被调查者所学的专业种类丰富，涵盖英语、通信、材料、机械、电气、法律、电子、旅游管理、港航等十余个专业。志愿者们英语水平总体较高，73.8%通过了英语专业八级或大学英语六级，37.7%通过专业英语四级或大学英语四级，另有通过上海中口、BEC中级或人事部翻译资格考试三级口译等。

新型烟碱类杀虫剂对鞘翅目、半翅目、鳞翅目等多种农业害虫具有较高的杀灭作用，广泛应用于水稻、玉米、小麦、蔬菜、果树等农作物的害虫防治，已成为当前普遍使用的杀虫剂之一[5]。吡虫啉是新烟碱类农药的代表品种，至1991年上市以来，连续多年成为全球销量最大的杀虫剂[6]。其杀虫机制是通过阻止昆虫中枢神经系统传导使其麻痹甚至死亡。蜜蜂采集施用了吡虫啉杀虫剂植物的花蜜和花粉时，可引起蜜蜂的慢性中毒[7]，影响蜜蜂的嗅觉能力[8]，导致学习记忆能力降低[9]，并引起行为异常，例如采集积极性下降[10]、方向迷失等[11]，不仅如此，还对蜜蜂幼虫的生长发育产生影响[12]。蜜蜂体内存在一系列重要的酶，是参与外源物代谢排解的重要成员。

细胞色素单加氧酶系（Cytochrome P450 Monooxygenses,P450 s） 是广泛存在于动物、植物的代谢酶系[13]。细胞色素P450 s在昆虫的生命活动中担任重要的角色，涉及生长、发育、代谢、取食等过程。迄今为止，发现昆虫的细胞色素P450功能主要有两类：一是对外源物进行活化、代谢、解毒；二是对内源物质进行降解和合成[14]。蜜蜂同其他昆虫一样，依赖体内一系列解毒酶来分解环境中的有毒物质，其中最重要的是细胞色素P450 s[15]，如能降解拟除虫菊酯类农药[16]、一些真菌毒素以及其他人工合成的杀虫剂[17]。蜜蜂体内细胞色素P450 s有一系列的解毒基因，其中最为重要的就是CYP9家族基因[18]，有研究表明蜜蜂CYP9E2基因参与溴氰菊酯、拟除虫菊酯等代谢解毒过程[19]。乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE） 是一种丝氨酸水解酶，在昆虫神经传导过程中起关键作用的一种酶[20]。AChE不仅参与昆虫体内激素合成，还与抗药性有关以及神经系统对生理行为的调控[21]，在蜜蜂生命活动中具有重要影响。有研究证明编码蜜蜂AChE的基因有Ace1和Ace2[22]。吡虫啉主要作用于蜜蜂神经系统的乙酰胆碱受体，与乙酰胆碱竞争受体结合部位[23]，阻断蜜蜂的正常神经传递。

以上研究主要针对杀虫剂对蜜蜂成蜂的影响，鲜有研究探讨杀虫剂对蜜蜂幼虫发育阶段的影响。本试验探究蜜蜂幼虫、蛹、成蜂阶段，饲喂含有3种浓度的吡虫啉饲料，利用RT-qPCR方法分析CYP9e2、Ace1、Ace2 3种基因的表达量，从而了解吡虫啉对不同发育时期的蜜蜂解毒酶的表达情况。

1 材料

1.1 试验样品

试验使用的蜜蜂为吉林省养蜂科学研究所饲养的意大利蜜蜂蜂群 （N 43°43’6”，E 126°39’46”）。

吡虫啉原药（97%）、蜂王浆、花粉、D-果糖、D-葡萄糖、UNIQ-10柱式总RNA提取试剂盒、One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II(Perfect Real Time)等。

1.2 试验试剂

针对临床小儿内科经由规范化确诊收治的维生素D缺乏性小儿手足搐搦症患者实施钙剂缓慢静脉滴注补钙给药治疗,与为其实施钙剂快速静脉滴注给药治疗干预相对照,能够有效且显著地改善提升患者的治疗有效率指标,促进患者的血钙浓度生理指标快速且充分地恢复正常状态,在支持和确保患者的生存质量状态不断改善优化条件之下,为我国小儿内科临床医学事业的良好发展创造支持条件。

1.3 试验仪器

幼虫基础日粮配方：50%的新鲜王浆和50%的水溶液（含6%葡萄糖、6%果糖和1%的酵母提取物）。

1.4 引物

荧光PCR采用的引物中，CYP9e2的引物（A21/A22） 采用Primer 3 Plus软件进行设计；Ace1(J1/J2)、Ace2(K1/K2)、β-action(B1/B2、L1/L2)内参基因的引物，参考自文献[1]。具体见表1。

 

表1 试验中使用的引物

  

引物 序列 参考序列 引物位置 目的片段/b p 产物A 2 1 A A C G T T C G A G G C T C T C A A G G X M_0 0 1 1 1 9 9 8 1.4 9 6 2～9 8 1 2 8 7 C Y P 9 e 2 A 2 2 C G A A C G G A A T G A A C G C C A T C 1 2 2 9～1 2 4 8 B 1 G G C T C C C G A A G A A C A T C C X M_0 1 7 0 5 9 0 6 8.1 4 3 9～4 5 6 1 9 5 β-a c t i n-5 C B 2 T G C G A A A C A C C G T C A C C C 6 1 6～6 3 3 J 1 C A A G T T C G A G G T G C T G A T G G K U 5 3 2 2 8 8.1 2 7～4 6 9 2 A c e 1 J 2 C G T G A T G T C T G C T T C T G T G G 9 9～1 1 8 K 1 C T C G A T C T G T T G A G G G A A G C K U 5 3 2 2 8 9.1 1 0 8 1～1 1 0 0 2 3 5 A c e 2 K 2 T G T A C A C C T C C T C C C A G T C C 1 2 9 6～1 3 1 5*L 1 T G C C A A C A C T G T C C T T T C T G A B 0 2 3 0 2 5.1 2 0 8～2 2 7 1 5 6 β-a c t i n L 2 A G A A T T G A C C C A C C A A T C C A 3 4 4～3 6 3

2 方法

2.1 饲料配置

MGC-H人工气候箱、Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System、Thermo Scientific Sorvall Stratos低温高速离心机等。

幼虫日粮中添加的吡虫啉如下：1×10-3μg/μL的吡虫啉为高浓度剂量，以此为基础稀释10倍和100倍为中浓度吡虫啉添加剂量(1×10-4μg/μL)和低浓度吡虫啉添加剂量(1×10-5μg/μL)。

诺氟沙星-固体脂质纳米粒的制备及体外释药特性研究…………………………………………………… 郭 杰等（22）：3068

2.2 幼虫饲养

试验前4天，利用限王产卵器限制蜂王产卵，24 h后把蜂王放出。试验时选取1日龄后期幼虫，置于24孔培养板中，饲喂等量的饲料在温度34～35℃、湿度90%的恒温箱中培养。试验设置1个空白对照组和低浓度吡虫啉处理组a、中浓度吡虫啉处理组b、高浓度吡虫啉处理组c，每组48只幼虫，3个重复。试验后的第7天，将幼虫转移至铺有灭菌纸的24孔细胞培养板中准备化蛹。2天后观察记录并移出死虫，等至羽化出房时记录存活率并取样品放于试管中，液氮冷冻。

2.3 总RNA提取

应用Excel 2010对试验数据进行初步整理，使用SPSS 16.0对试验数据进行方差分析，处理组和对照组之间利用t检验进行差异性分析，P＜0.05为差异显著。

2.4 目的基因相对表达量的测定

根据本实验室建立的RT-qPCR检测方法，对提取的RNA，使用一步法RT-qPCR进行扩增。扩增体系：RNase free ddH2O 5.2μL，2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 4 10.0μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 0.8μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ROX Reference Dye I(50×)0.4μL，RNA 2.0μL。扩增程序：反转录42℃，5 min；灭火与预变性95℃，10 s；变性95℃，5 s；退火60℃，34 s；40个循环；熔融 60--＞95℃，0.3℃/min。

2.5 数据处理

取3日龄幼虫、6日龄幼虫、3日龄蛹、出房幼蜂4个时期蜜蜂样本，使用UNIQ-10柱式总RNA提取试剂盒提取总RNA，所提取的RNA使用RNase-Free水溶解，液氮冷冻短暂保存备用。

3 结果

3.1 吡虫啉对不同发育期的蜜蜂成活率影响

对照组蜜蜂各个时期的成活率均在90%以上，具体不同处理组的小幼虫存活率、大幼虫存活率、化蛹率、羽化率见表2。

2.证券业、保险业持续健康发展。截至2017年12月底，证券机构数量都有所增加，证券公司代理买卖证券总额达到 968,961.55 亿元，证券公司股票账户数达到8052.08万户，比2016年的6461.52万户增加了1590.56万户，同比增长24.62%。同时，在2017年末，据深圳保监局统计数据，深圳保险市场保费收入首次突破千亿大关，达到1029.75亿元，25家保险法人机构在2017年末资产总额达到5.15万亿元，比2016年的3.6万亿元增加了1.55万亿元，同比增长43.06%；保险分公司73 家，专业保险中介法人机构129 家。

 

表2 各时期蜜蜂的存活率

  

成活率/% 化蛹率/% 羽化率/%对照组 9 9.3 0±1.2 0 9 7.2 2±2.1 0 9 4.4 4±2.4 1 9 3.0 6±2.4 1处理组a 9 8.6 1±1.2 0 9 6.5 2±2.1 0 9 2.3 6±2.4 1 9 0.9 7±2.4 1处理组b 9 8.6 1±1.2 0 9 2.8 3±2.1 0 7 3.9 6±3.1 9 7 1.8 8±2.9 8处理组c 9 6.5 2±1.2 0 8 6.5 4±2.1 0 3 8.8 9±3.1 9 3 8.1 9±3.6 7小幼虫成活率/%大幼虫

饲喂含高中低3种浓度的吡虫啉的饲料，利用RT-qPCR技术分析CYP9e2基因对蜜蜂小幼虫、大幼虫、蛹、成蜂4个时期表达情况（如图2）。无论处理组还是对照组蛹期CYP9e2相对表达量最低，成蜂CYP9e2相对表达量最高。随着吡虫啉的浓度增加，小幼虫、大幼虫、蛹、成蜂各个时期的CYP9e2相对表达量整体呈增加趋势，且1日龄成蜂高剂量吡虫啉处理组表达量是对照组的1.97倍。

  

图1 吡虫啉对不同发育期蜜蜂存活率的影响

3.2 吡虫啉对蜜蜂CYP9e2表达量的影响

统计分析试验结果(如图1)可知，处理组和对照组的小幼虫时期存活率无显著差异。处理组和对照组的大幼虫时期存活率也无显著差异。处理组a和对照组的化蛹率无显著差异，处理组b和处理组c的化蛹率均和对照组的化蛹率差异显著，且处理组b和处理组c化蛹率和羽化率差异不显著，说明蜜蜂蛹期死亡量大，高、中剂量的吡虫啉对蜜蜂蛹期生长发育影响最大。

3.3 吡虫啉对蜜蜂Ace1、Ace2表达量的影响

饲喂含高中低3种浓度的吡虫啉的饲料，利用RT-qPCR技术分析Ace1基因对蜜蜂小幼虫、大幼虫、蛹、成蜂4个时期表达情况（如图3）。无论高中低剂量吡虫啉添加，小幼虫、大幼虫、蛹、成蜂4个时期Ace1相对表达量依次升高，1日龄成蜂时期Ace1相对表达量最大。随着吡虫啉剂量的增加，各个时期Ace1相对表达量呈下降趋势。在整个蜜蜂发育过程中羽化成蜂时Ace2相对表达量最高，是3日龄幼虫期相对表达量的4.75～28.45倍。

  

图2 CYP9e2基因相对表达量

饲喂含高中低3种浓度的吡虫啉的饲料，利用RT-qPCR技术分析Ace1基因对蜜蜂小幼虫、大幼虫、蛹、成蜂4个时期表达情况（如图4）。各个时期Ace2相对表达量随着吡虫啉浓度增加整体呈现下降趋势。在整个蜜蜂发育过程中羽化成蜂时Ace2相对表达量最高，是3日龄幼虫期相对表达量的1.99～5.86倍。

4 讨论

细色素p450s对杀虫剂和植物毒素的代谢是昆虫产生抗药性的重要机制。CYP9e2是细色素p450家族中的重要的一个基因，CYP9e2利用NADH、NADH辅酶催化体内毒物产生氧化还原反应，以达到解毒的作用[18]。试验中，不同时期的CYP9e2相对表达变化趋势，与不同时期的存活率的变化趋势接近，这表明CYP9e2是西方蜜蜂抗药性基因。但CYP9e2对吡虫啉解毒的机制仍不明确。蛹期的死亡率明显高于其他时期，而试验结果中蛹期CYP9e2基因相对表达量是最低。这可能是由于蛹期时，在蜜蜂解毒过程中起到重要作用的CYP9e2表达量过低，使得蜜蜂抵御杀虫剂的能力降低，因此蛹期的蜜蜂更易遭受农药毒害。蛹期的死亡率与饲喂吡虫啉的浓度呈现出一定程度的相关性，这可能是蛹期CYP9e2表达量较低，蜜蜂呈现出了急性中毒的特性。而其他时期，由于CYP9e2相对表达量较高，死亡率也较低，死亡率与饲喂吡虫啉的浓度相关性不高，这与一些研究中的慢性中毒特性接近[16]。

由试验结果可知，饲喂不同浓度的吡虫啉后，蜜蜂在从小幼虫到蛹这一发育过程中，CYP9e2基因的相对表达量略显升高，而到出房时迅速升高。随着发育时间的增加，CYP9e2相对表达量呈现逐步升高的趋势。这与一些研究成年蜜蜂在不同时间CYP9e2基因相对表达量变化趋势的研究结果类似[15]。

留学生在校园形成的地方感，可以让其更好地融入校园，成为高校的一份子，即身份认同与融合是校园尺度地方感作用于留学生的1个结果(图1)。

饲喂不同浓度的吡虫啉后，Ace1、Ace2相对表达量均有上升，由此表明，吡虫啉可在蜜蜂发育的不同时期诱导Ace1、Ace2表达。研究表明，吡虫啉会严重降低乙酰胆碱酶的活性[21]。诱导相对表达量升高，可能是蜜蜂为了弥补乙酰胆碱酶活性不足而代偿性升高表达量。对照组、低浓度处理组、中等浓度处理组Ace2相对表达量大体呈现先升高，再降低再升高的趋势，这和一些成年蜜蜂在不同时间Ace基因相对表量变化趋势的研究结果类似[22]。

该试验中，Ace1相对表达量高于Ace2。根据研究显示，Ace2的活性为Ace1的2 500倍，Ace1活性较弱[22]，这可能是Ace1高表达的原因。但不同发育时期中Ace1表达量趋势，与在成蜂不同时间Ace1表达量趋势的研究报道不太相同。这可能与蜜蜂不同发育期的生理特性相关，其诱导表达差异的机制还需要进一步深入研究。

逻辑推理能力是一种迅速掌握问题核心的能力，而鼓励学生自主归纳就是要锻炼学生独立的思维，使学生有意识进行自主学习、独立思考。所以，在小学数学基本知识的教学过程中，教师要鼓励学生对教材所学的内容进行自主归纳，继而为学生形成一定的逻辑推理能力打好基础。

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