大多数化学过敏原(或其代谢物)属于亲电子剂，而蛋白质侧链氨基酸富含电子组，为亲核剂，因此能与亲电过敏原反应。赖氨酸和半胱氨酸是最常被利用的，其他含亲核杂原子的氨基酸，如组氨酸、蛋氨酸和酪氨酸等也可与亲电过敏原反应 [1]。亲电过敏原通过与宿主亲核蛋白中的氨基酸形成非常稳定的共价键(抗原蛋白复合物)，从而引发皮肤过敏反应。

由于蛋白质反应是诱导皮肤过敏的一个关键环节，所以有假设通过这种反应来筛选化学物的致敏能力 [2-5]。 Gerberick等 [5-6]建立了直接肽反应试验(the direct peptide reactivity assay，DPRA)，通过研究肽反应动力学，监测肽的损耗来评价化学物的致敏性。该方法现已经欧洲替代试验验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)验证，作为皮肤致敏替代试验的推荐方法，OECD于2015年公布了DPRA试验指南(TG 442C)[7]。目前国内一些实验室也正在积极开展该方法研究 [8-10]，不久该方法有望纳入化妆品安全技术规范。本研究通过赖氨酸/半胱氨酸肽对20种不同致敏级别化学物的致敏能力进行评估，从而在本实验室建立了该方法，同时对目前市场上化妆品中较易残留或添加的2种风险化学物氯仿、苯进行皮肤致敏性评估。

社会存在决定社会意识。社会主义现代化建设日新月异，党和政府对许多实际问题的认识也在不断深化、扩展和向前推移。与此相对，教材具有相对的稳定性，不能及时地把社会经济生活中的各种问题反映出来。进行时事教育，能有效地弥补教材案例相对滞后的缺陷，增强新鲜感和时代感，调动学生的学习积极性，从而提高课堂效率。总之，进行时政教育，能在坚持教材相对稳定的同时，又能保持政治课教学的科学性。

1　材料与方法

1.1　受试物

邻氨基苯酚、丁子香酚、反式肉桂醛、水杨酸、α-己基肉桂醛、对苯二酚、3-甲基邻苯二酚、香叶醇、水杨酸己酯、2-巯基苯并噻唑、十二烷基硫酸钠、异丁香酚、乙二胺与水杨酸甲酯购自Sigma公司；丙二醇、异丙醇、正己烷、氯仿与苯购自国药集团化学试剂有限公司；2,4-二硝基氯苯购自中国医药总公司北京分公司。

总而言之，自我管理能力对初中学生来说至关重要，学校、教师应从教学实际出发，立足学生发展需求，通过合理的、适当的引导与教育培养学生的自我管理能力，使其养成良好的行为习惯与积极健康的思想作风，帮助学生实现学习与素质的同步发展。

1.2　试剂和仪器

2.3用药护理。向患者讲解口服碘-131前后2小时禁食,服碘-131后24小时后咀嚼酸性食物,刺激唾液腺分泌唾液,避免唾液腺受损,适当多饮水,减少对生殖腺的照射。遵医嘱按时服用口服药泼尼松:预防颈部水肿;每天3次,每次2片;埃索美拉唑肠溶片:保护胃黏膜;每天1次,每次一片。口服碘-131大剂量患者中当日静脉输入注射用泮托拉唑40毫克、地塞米松注射液10毫克,35人输入注射用氨磷汀0.4克,注射用氨磷汀为细胞保护剂,有两名患者输注过程中出现不良反应,恶心、血压下降,收缩压90mm Hg,舒张压50mm Hg,嘱患者平卧休息,15分钟后症状缓解[4]。

美国AKH董事长Dave Caulk先生也就“自冲平头铆钉铆接工艺（SPFR）”进行了讲解，美国BTM产品经理Brian Petit先生针对“无铆钉金属连接技术”做了详细介绍，还有来自清华大学的朱志明教授、天津大学的罗震教授、华南理工大学的王振民教授、哈尔滨工业大学（威海校区）的宋晓国教授以及广东省焊接研究院的董春林院长等都针对先进的焊接技术阐述了看法，这不仅促进了技术间的交流，也为行业发展带来推动作用。

1.3　方法

1.3.1　受试物与肽反应体系 [5-7]　受试物用乙腈配制成100 mmol/L，赖氨酸/半胱氨酸肽分别用100 mmol/L乙酸铵缓冲液(pH=10.2)/磷酸缓冲液(pH=7.5)配制成1.25 mmol/L肽储备液。每个受试物测试3份平行样，其中含0.5 mmol/L肽(400 μL)、5或25 mmol/L受试物(50或250 μL)及缓冲液(350 μL)。肽/受试物比例为1∶10(半胱氨酸)或1：50(赖氨酸)，1∶10比例反应样本中需另加200 μL乙腈；同时设置空白对照(400 μL肽储备液、350 μL缓冲液和250 μL乙腈)和共洗脱对照(赖氨酸肽：750 μL乙酸铵缓冲液和250 μL受试物；半胱氨酸肽：750 μL磷酸缓冲液、50 μL受试物和200 μL乙腈)。每个样本管密封、混匀、室温反应24 h，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱检测分析。

1.3.2　标准曲线绘制 [6] 　用25%乙腈乙酸铵/磷酸缓冲液分别配制赖氨酸/半胱氨酸肽系列标准溶液，浓度为0.015 6、0.031 3、0.062 5、0.125、0.25、0.50、1.0 mmol/L，过滤后进行高效液相色谱检测，用系统EmpowerTM 3软件绘制标准曲线。

高效液相色谱检测结果显示20种受试物均未与半胱氨酸/赖氨酸肽发生共洗脱，选用两种肽损耗率均值判断受试物致敏性及其反应活性级别(表1)，两种肽对受试物致敏性的预测结果见表2。

根据赖氨酸/半胱氨酸肽与18种已知致敏性化学物反应损耗确定两种肽的灵敏度、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确度，从而综合评价两种肽的预测能力。

1.3.4　受试物与两种肽反应时间优化 　为了解化学物与两种肽反应动力学过程，即不同时间点肽损耗，从而确定试验反应最佳时间，我们测定了5种不同致敏级别受试物与两种肽分别反应5、15、30 h 时的肽损耗。

赖氨酸肽(Ac-RFAAKAA-COOH)、半胱氨酸肽(Ac-RFAACAA-COOH)由吉尔生化(上海)有限公司合成，纯度≥98%。醋酸铵、氨水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氟乙酸为分析纯，购自Sigma公司。乙腈为色谱纯，购自赛默飞世尔科技有限公司，高效液相色谱为Waters e2695 Alliance。

1.4　数据处理

5种受试物分别与赖氨酸/半胱氨酸肽反应5、15、30 h，结果表明：2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、水杨酸和邻苯氨基苯酚均随着时间增加肽损耗率也相应增加；反式肉桂醛与半胱氨酸肽反应肽损耗率较为稳定，而与赖氨酸肽反应随时间增加肽损耗率递减，但反应15～30 h时间段肽损耗率递减缓慢，趋于稳定。鉴于Gerberick等 [5-6]有关报道和OECD指南中推荐受试物与肽反应时间分别为24 h和(24±2) h，所以我们后续试验各受试物与肽反应时间均为24～28 h。

1.5　预测模型[7]

若受试物与赖氨酸/半胱氨酸肽均不发生共洗脱，则用两种肽损耗率的均值判断，0%≤均值≤6.38%，微反应，为致敏阴性；6.38%＜均值≤22.62%、22.62%＜均值≤42.47%、42.47%＜均值≤100%，均为致敏阳性，反应级别依次为低、中、高。当受试物与赖氨酸肽发生共洗脱，则用半胱氨酸肽损耗率判断，0%≤均值≤13.89%，微反应，为致敏阴性；13.89% ＜均值≤23.09%、 23.09%＜均 值 ≤ 98.24%、 98.24%＜均 值 ≤100%， 均为致敏阳性，反应级别依次为低、中、高。当受试物与赖氨酸/半胱氨酸肽均发生共洗脱，则该方法不适用判定受试物致敏性。

1.6　预测能力评价

1.3.3　检测系统及条件[6-7]　高效液相色谱检测系统由Waters Alliance e2695和Waters 2489 紫外/可见光检测器组成。色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18 4.6 mm×250 mm×5 μm；柱温30 ℃；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.085%三氟乙酸乙腈溶液；流速0.3 mL/min；进样量10 μL。梯度洗脱条件为：90%(A) 到60%(A)，25 min，流速0.8 mL/min。二极管阵列探测器扫描波长210～400 nm，色谱图检测波长是220 nm。

2　结果　

2.1　受试物与两种肽反应时间的优化

用EmpowerTM 3软件分析反应前后的峰面积，计算肽的损耗率，≥10%则认为受试物与肽有反应[5]。损耗率=[1-(肽与受试物反应的峰面积均值/空白对照的肽峰面积均值)]×100。

图1　赖氨酸肽与不同受试物反应动力学图

2.2　20种受试物与两种肽反应结果

图2　半胱氨酸肽与不同受试物反应动力学图

“我由此猜想李卫中同志一定是与党有关系的人，便向他提出找到并加入中国共产党组织的请求。他当即答应帮助我。” 1947年 8月2日，李卫中正式介绍汤甲真加入中共地下党，并嘱咐他如何保守党的秘密等。

表1　20种受试物与半胱氨酸/赖氨酸肽反应活性(肽损耗率，%)

*：local lymph node assay，局部淋巴结试验。

致敏级别(LLNA*) 化学物 半胱氨酸(1∶10) 赖氨酸(1∶50) 半胱氨酸/赖氨酸均值 致敏性 反应活性级别强/极强致敏物 3-甲基邻苯二酚 99.60±0.33 71.51±1.75 85.56±0.71 + 高邻氨基苯酚 99.80±0.14 27.64±2.23 63.72±1.17 + 高对苯二酚 99.84±0.23 67.25±2.87 83.54±1.51 + 高2，4-二硝基氯苯 99.92±0.09 24.20±1.64 62.06±0.83 + 高水杨酸己酯 11.75±1.32 1.46±0.38 6.61±0.50 + 低中等致敏物 异丁香酚 78.64±0.76 1.32±0.69 39.98±0.20 + 中2-巯基苯并噻唑 67.43±1.85 1.30±0.56 34.36±0.92 + 中反式肉桂醛 79.41±1.10 1.20±0.54 40.31±0.50 + 中乙二胺 18.57±0.69 1.54±1.36 10.05±0.58 + 低弱致敏物 己基肉桂醛 21.84±1.49 1.32±0.92 11.58±0.31 + 低丁子香酚 51.88±1.01 1.25±1.00 26.56±1.00 + 中香叶醇 21.50±0.99 0.53±2.67 11.02±1.66 + 低非致敏物 正己烷 1.18±0.78 1.75±0.79 1.47±0.73 - 微异丙醇 1.24±0.90 1.62±1.01 1.43±0.51 - 微十二烷基硫酸钠 1.05±0.60 8.94±1.92 4.99±1.12 - 微水杨酸甲酯 1.28±0.07 1.19±0.30 1.24±0.18 - 微水杨酸 1.65±0.39 3.07±0.28 2.36±0.17 - 微乳酸 2.14±0.72 1.58±0.44 1.86±0.51 - 微未知致敏物 氯仿 1.14±0.28 1.02±0.39 1.08±0.26 - 微苯1.02±0.30 0.96±0.34 0.99±0.17 - 微

半胱氨酸肽 赖氨酸肽 半胱氨酸/赖氨酸肽灵敏度 100.00% 33.30% 100.00%特异性 100.00% 100.00% 100.00%阳性预测率 100.00% 100.00% 100.00%阴性预测率 100.00% 42.90% 100.00%准确度 100.00% 55.60% 100.00%

2.2.2　赖氨酸肽损耗率 　5种强或极强致敏物中4种肽损耗率大于20%(24%～72%)，水杨酸己酯未与肽反应(肽损耗率小于2%)；4种中等致敏物、3种弱致敏物和6种非致敏物均未与肽反应(肽损耗率＜10%)；致敏性未知的氯仿和苯也未与肽反应(肽损耗率＜2%)。预测化学物致敏性灵敏度、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确度分别为33.3%、100.0%、100.0%、42.9%、55.6%。

2.2.1　半胱氨酸肽损耗率 　5种强或极强致敏物肽损耗率均大于10%(4种大于99%)，4种中等致敏物肽损耗率均大于10%(3种大于67%)，3种弱致敏物肽损耗率均大于20%(21%～52%)，6种非致敏物肽损耗率均小于3%，致敏性未知的氯仿与苯均未与肽反应(肽损耗率＜2%)。预测化学物致敏性灵敏度、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确度均为100%。

左小龙骑着他的摩托车绕着亭林镇开了三圈，因为这个下午没有任何事情可以做。昨天他听说燃油将要涨价，于是在加油站加满了汽油，结果今天一看，涨价的是柴油，于是心情有些郁闷。他首先觉得自己是做大事的人，不应该去贪图这些小便宜，这不是他的性格，但是最郁闷的是，既然决定义无反顾的去贪了，结果一如既往的没有贪着。

2.2.3　半胱氨酸/赖氨酸肽损耗率均值 　18种已知致敏性受试物中12种肽损耗率均值大于6.38%，为致敏阳性；6种肽损耗率均值小于6.38%，为致敏阴性，与LLNA致敏分类一致。致敏性未知的氯仿和苯肽损耗率均值均小于6.38%，为致敏阴性，与我们前期研究中LLNA法评估结果一致。5种强或极强致敏物中4种为高反应活性，1种为低反应活性；4种中等致敏物中3种为中反应活性，1种为低反应活性；3种弱致敏物中2种为低反应活性，1种为中反应活性；6种非致敏物均为微反应活性；致敏性未知的氯仿与苯均为微反应活性。预测化学物致敏性灵敏度、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确度均为100.0%。

3　讨论　

目前化学物致敏性评价替代方法较多，如LLNA法 [11-15]、 细胞法 [16-19]、 化学法 [5-6]、 计算机法 [20]等，其中LLNA法较成熟，可较好地评价化学物的致敏性及其致敏强度。由于动物福利及欧盟化妆品条例要求逐步废除动物实验，因此发展高效、全面、安全的体外替代方法迫在眉睫。

本研究建立的化学法DPRA，简单快捷、易操作。但该方法要求测试化学物应溶于适当的溶剂制成终浓度100 mmol/L，同时需要测试化学物与肽间确定的物质的量比值，因此不能用于测试未知组成的复杂混合物、未知或可变组成的物质、复杂的反应产物或生物材料，所以开发基于重量法的新的预测模型很有必要 [7]。此外该方法不适用于测试金属化合物，因为已知金属化合物与蛋白质反应形成非共价键[7]。

DPRA方法是化学反应，不涵盖代谢系统，对于需要酶促生物活化反应的非亲电性致敏原易出现假阴性 [7，21]。 Gerberick等 [22-23]对该方法进行了改良，即在致敏原与赖氨酸/半胱氨酸肽酶促反应中加入辣根过氧化物酶-过氧化氢(HRP /P)，使抗原前体转变为抗原，从而使该方法也适用于抗原前体物(属非亲电物质)的检测。该改良法提高了检测的灵敏度，发展前景较好。

有关研究表明该方法实验内重现性为85%，实验室间重现性为80%[24]。 已发表文献 [25]和 验证结果 [26]表明：与LLNA结果比较，DPRA方法鉴别致敏剂与非致敏剂的准确性为80%，灵敏度为80%，特异性为77%；而本研究中DPRA方法对18种已知致敏性化学物进行鉴别，其准确性、灵敏度、特异性均为100%；表明该方法适宜高通量对化学物致敏性进行筛选，可将该方法在国内进一步推广应用。

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