舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是恶性程度高、预后差的肿瘤之一。临床资料表明，TSCC具有女性多发、早期淋巴结侵犯、多发性原发癌的局部高复发率的临床特征 [1]。相较于唇、颊及口底等部位，TSCC在年轻成人中好发于舌外侧缘，舌背非常罕见，舌背正中的发生率不足1%[2]；目前，早期舌癌的治疗多选择手术部分切除、放射治疗为主，广泛切除和重建手术是帮助晚期舌癌患者延续生命、提高生活质量的治疗方案[3]。

5)与Gumbel(max)(极大值)函数相关系数的计算。生成3 180×1的Gumbel(max)(极大值)函数随机矩阵数据，然后以z=corrcoef(A,F)指令计算相关系数，zGumbel(max)=-0.007 7。

硫氧还蛋白系统(Trx system)是氧化还原调节蛋白，包括硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、NADPH辅酶、Trx家族蛋白和Trx的调节蛋白 [4]。现有研究已证明Trx系统蛋白与癌症密切相关，并与癌症临床病理特征显著相关[5]。本研究用免疫组织化学及Image Pro Plus软件分析技术，研究TSCC组织与癌旁正常上皮组织中Trx和TrxR1 蛋白的表达情况，初步探究Trx系统蛋白与TSCC的潜在关系，以期为TSCC的早诊断、早治疗提供参考。

1　材料与方法

1.1　病理标本和临床资料收集

收集兰州大学第一、第二医院2009年4月—2016年1月病理确诊为TSCC手术切除标本28例，男性17例，女性11例；年龄32～72岁(平均51.25岁)，小于50岁者12例、大于50岁者(含50岁)16例；肿瘤直径在≤2 cm者14例、2 cm＜肿瘤直径≤4 cm者10例、＞4 cm者4例；随访时间24～72个月，平均随访时间43.72个月；局部复发7例；目前存活18例、死亡7例、随访丢失3例。

病理诊断均为鳞状细胞癌，其中高分化14例、中分化9例、低分化5例；按国际抗癌联合会(UICC)口腔癌和口咽癌的TNM分类分期(UICC 2002)标准，其中Ⅰ期8例、Ⅱ期6例、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例；临床及术后病理确诊颈部淋巴结发生转移10例。另选择10例癌旁病理诊断为正常的舌组织作为对照组进行研究，上述标本均经病理科医师对HE染色片进行观察、筛选，作为免疫组织化学实验研究用片。

1.2　主要试剂

采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析，数据以x±s表示，计量资料间的差异采用单因素方差分析。应用Kaplan-Meier和Log Rank检验检测Trx和TrxR1的表达量与患者生存状况的关系。用Pearson相关系数检测Trx和TrxR1在舌鳞癌组织中表达的相关性，以0.8～1.0为极强相关、0.6～0.8为强相关、0.4～0.6为中等程度相关、0.2～0.4为弱相关、0.0～0.2为极弱相关或无相关；α=0.05为检验水准。

1.3　免疫组织化学检测

通过Pearson相关系数和线性回归分析Trx和TrxR1之间表达的相关性，结果显示两者之间存在中等程度的正相关关系(r=0.504，P=0.006)，见图3。

1.4　结果判定

我们对舌鳞癌患者进行了随访，统计结果显示，Trx和TrxR1高表达组与低表达组生存率间的差异均具有统计学意义(P均＜0.05)，见图4。

免疫组化结果如图2显示，Trx和TrxR1的阳性表达主要定位于细胞核及胞质中，呈黄色或棕黄色点状或弥漫分布。Trx和TrxR1在正常癌旁组织中检出的IOD值为(3.91±3.00)×107 和(0.69±0.32)×107 ，而在TSCC组织中IOD值分别为(2.84±0.34)×108 和(1.88±0.29)×108，显著高于正常癌旁组织(p＜0.05或p＜0.01)。

1.5　统计学方法

兔抗人TrxR1多克隆抗体(11117-1-AP)和兔抗人Trx多克隆抗体(14999-1-AP)均购自美国ProteinTech 公司；SP-9000/9001/9002生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒和ZLI-9017/9018/9019浓缩型DAB试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司；粘附载玻片购自江苏世泰实验器材有限公司。

研究结果发现，Trx的表达在肿瘤直径≤2 cm和＞4 cm两组间、分化程度好和差之间的差异具有统计学意义(p＜0.05)；TrxR1的表达在不同年龄、临床分期、肿瘤直径、分化程度之间差异具有统计学意义(p＜ 0.05或p＜ 0.01)，见表1。

2　结果　

2.1　Trx和TrxR1在TSCC和癌旁正常组织中的表达

式中：α和β分别为价值函数收益区域和损失区域的凹凸系数[24]，表示X方主体对待收益和损失的风险态度，α,β∈(0,1);λ为损失规避系数[25]，表示X方主体的损失规避程度，λ>1。

2.2　Trx和TrxR1表达与舌鳞状细胞癌临床病理特征之间的关系

5.猪疫病预防与预报机制不健全。缺乏有效的快速诊断技术、疫病防治技术和根除计划，疫病已经成为影响养猪产业顺利发展的障碍。随着规模养猪的发展和大量的国外引种，国内本身旧病重现，新病未去，我国猪病日益复杂，传统疫病非典型化、新的遗传病、非典型、亚临床病症增多、多病原混合感染及继发感染已成为困扰养猪生产发展、影响生产力水平提高的基本障碍，严重制约着养猪业的健康发展。

图1　应用IPP软件选取表达阳性区域

图2　Trx和TrxR1在不同分化程度的舌鳞状细胞癌组织中的表达

2.3　Trx和TrxR1之间表达的相关性分析

采用免疫组织化学SP三步法对组织石蜡切片进行染色，实验步骤如下：切取4 μm石蜡切片烤片后二甲苯、酒精梯度下行脱蜡，3%双氧水去除内源性过氧化物酶，抗原修复后滴加正常山羊非免疫血清封闭抗原，滴加Trx和TrxR1一抗，阴性对照切片滴加PBS，用作代替一抗，用乳腺癌石蜡切片作为阳性对照。滴加生物素标记工作液孵育，洗片后滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液孵育，DAB显色，苏木素复染，酒精依梯度上行脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

三北在哪里？三北是西北、华北及东北的统称。三北防护林体系建设工程，涵盖了三北地区风沙危害和水土流失严重的区域，是与中国改革开放同步进行的生态修复工程，被称为“改造大自然的伟大壮举”。邓小平为其写下四个字：绿色长城。

表1　舌鳞状细胞癌患者临床病理特征与Trx、TrxR1表达的关系

TrxR1的P值年龄 ＜50岁 12(42.9%) 0.139 0.010≥50岁 16(57.1%)性别 男 17(60.7%) 0.098 0.279女11(39.3%)肿瘤直径 ①≤2 cm 14(50.0%) ①-② 0.957 0.032②＞2 cm，≤4 cm 10(35.7%) ①-③ 0.027 0.001③＞4 cm 4(14.3%) ②-③ 0.053 0.110临床分期 Ⅰ+Ⅱ 14(50.0%) 0.066 0.031Ⅲ+Ⅳ 14(50.0%)分化程度 好 14(50.0%)好-中等 0.075 0.354中等 9(32.1%) 好-差 0.015 0.037差5(17.9%) 中等-差 0.554 0.369淋巴转移 无 18(64.3%) 0.528 0.059有10(35.7%)局部复发 无 21(75.0%) 0.425 0.450有7(25.0%)患者状况 存活 18(64.3%)存活-死亡 0.071 0.140死亡 7(25.0%)丢失 3(10.7%)临床病理特征 例数(%) 两两对比Trx的P值

图3　Trx和TrxR1之间表达的相关性分析

2.4　Trx和TrxR1表达与舌鳞状细胞癌患者生存率的关系

染色后的组织切片通过Olympus显微镜采集图片，经有长期组织病理学研究经验的研究员对图片进行筛选，确定舌鳞状细胞癌和癌旁正常上皮组织的组织学特性，使用Image Pro Plus 6.0(IPP 6.0 )软件对图片进行光密度值检测，记录阳性面积(area)和平均光密度(mean density)，单个标本的阳性指标用累计光密度值(integrated optical density，IOD)判定，IOD=阳性面积×平均光密度(如图1)。

A：Trx高表达组与低表达组生存率分析；B：TrxR1高表达组与低表达组生存率分析.

3　讨论　

口腔恶性肿瘤中，舌鳞状细胞癌最为多见，每年造成约14.5万人死亡 [6]，临床因素是评估患者预后的重要指标之一，如是否有颈部淋巴结转移、年龄等，已有的研究发现小于40岁者较多出现远处转移且预后较差 [7-9]。研究发现硫氧还蛋白(Trx)系统蛋白在胃癌、宫颈癌、乳腺癌等恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的恶性程度相关，下调其表达可抑制肿瘤细胞的生长 [10-12]。我们试图探索Trx和TrxR1蛋白在舌鳞状细胞癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系。

结果显示，Trx和TrxR1相较于癌旁正常组织，在TSCC组织中显著高表达，并在不同分化程度的TSCC组织中高度表达。Peng等 [13]研究表明TrxR1在胃癌细胞系和胃癌组织中过度表达。Hasan等 [14]采用RT-PCR、免疫组化染色检测TrxR1在脑膜瘤细胞和组织中的表达，结果发现与正常脑膜组织和细胞相比，TrxR1表现出高表达并随肿瘤等级增强而增加。这些结果均显示，TrxR1 在多种肿瘤组织中高表达，并且随肿瘤病理级别升高而升高，同时在正常组织中呈现较低的表达水平，其具有较好的表达特异性。朱晓杰等 [15]研究证实Trx和TrxR1在舌鳞状细胞癌组织中的表达明显高于正常人群颊黏膜上皮组织，我们的研究结果显示Trx和TrxR1 在舌鳞状细胞癌组织中高表达，正常癌旁组织中低表达，综上结果说明Trx和TrxR1在舌鳞状细胞癌组织中也具有上述表达特异性，可作为较好的药物靶点。

国内外文献报道Trx和TrxR1的表达程度与年龄、病理分级、有无淋巴转移、肿瘤大小等临床病理特征显著相关，预示肿瘤复发和进展 [16-18]。本研究发现，Trx和TrxR1蛋白在不同肿瘤大小、病理分化程度之间表达存在差异；且TrxR1的表达在不同年龄、临床分期组间亦存在差异，提示Trx和TrxR1的高表达影响着舌鳞状细胞癌的形成与进展。Trx自身的功能受TrxR1调控，我们使用Pearson相关系数分析发现Trx与TrxR1表达呈中等程度正相关(r=0.504，p＜0.05)，提示Trx与TrxR1在舌鳞状细胞癌形成和进展过程中起着协同作用，其共同调节氧化还原反应可保护细胞存活 [19]。参照于萍等 [20]对计算机图像分析进行等级划分的方法，我们根据测得免疫组化的IOD值(10倍镜)，发现其表达量介于1.0×107和1.0×109之间，故我们将≥1.0×108分为高表达组，＜1.0×108分为低表达组，分组后通过单因素方差分析结果显示两组的IOD值差异具有统计学意义(p＜0.05)。对舌鳞状细胞癌患者进行随访的结果显示，Trx与TrxR1高表达组和低表达组患者生存率存在显著差异，提示Trx和TrxR1的过表达可能与舌鳞状细胞癌的预后有关，目前已有研究报道将血浆作为样本进行Trx和TrxR1检测可作为新型肿瘤标志物应用于肿瘤诊断[21-22]。

根据以上研究结果表明，Trx和TrxR1具有在舌鳞状细胞癌组织中过表达的特性，并且与临床病理特征、生存率相关，其可作为药物治疗靶点和早期诊断、肿瘤筛查的重要临床指标应用舌鳞状细胞癌的诊断与治疗。

“三农”问题的形成具有其历史根源与现实因素。建国初期，重工业优先发展战略是我国“三农”问题形成的历史根源；改革开放后，农村资本和劳动力两种生产要素的单向双边流动是“三农”问题不断加深的现实经济根源。[2]庞绍堂认为，“三农”问题源自传统模式下国家优先发展重工业，其核心制度安排是二元财政体制，必须通过“经济——政治”改革才能根除。[3]赵忠升认为农民权益问题和农民能力问题是“三农”问题的核心。[4]这些学者对“三农”问题的形成进行追根溯源，有利于把握其本质，寻找破解之策。

参考文献

[1] LI Y D，MA X，HAN Y L，et al. Clinical features of multiple primary carcinomas of the oral cavity[J]. Exp Ther Med，2017，13(2)：634-638.

[2] CUSUMANO R J，PERSKY M S. Squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx in young adults[J]. Head Neck Surg，1988，10(4)：229.

[3] OKUBO M，IWAI T，NAKASHIMA H，et al. Squamous cell carcinoma of the tongue dorsum：incidence and treatment considerations[J]. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg，2017：1-5.

[4] MATSUZAWA A. Thioredoxin and redox signaling：roles of the thioredoxin system in control of cell fate[J]. Arch Biochem Biophys，2016，617：101-105.

[5] ARNER E S，HOLMGREN A. The thioredoxin system in cancer[J]. Semin Cancer Biol，2006，16(6)：420-426.

[6] GHANTOUS Y，ABU E I. Global incidence and risk factors of oral cancer[J]. Harefuah，2017，156(10)：645-649.

[7] JEON J H，KIM M G，PARK J Y，et al. Analysis of the outcome of young age tongue squamous cell carcinoma[J].Maxillofac Plast Reconstr Surg，2017，39 (1) ：41.

[8] DHANUTHAI K，ROJANAWATSIRIVEJ S，THOSAPORN W，et al. Oral cancer：A multicenter study[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal，2018，23 (1) ：23.

[9] CARIATI P，CABELLO A S， FERNANDEZ J S，et al.Distribution of cervical metastasis in tongue cancer：Are occult metastases predictable? A retrospective study of 117 oral tongue carcinomas[J]. J Craniomaxillofac Surg，2018，46(1)：155-161.

[10] 吴怡春，禇美芬，郭剑民，等. 硫氧还蛋白-1在胃癌中表达及意义[J]. 中国卫生检验杂志，2011(10)：2460-2462.

[11] 兰康云，陈小燕，刘琴，等. 硫氧还蛋白与β-联蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织高表达与恶性程度相关[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2017，33(3)：376-379.

[12] HUANG W，NIE W，ZHANG W，et al. The expression status of TRX，AR，and cyclin D1 correlates with clinicopathological characteristics and ER status in breast cancer[J]. Oncol Targets Ther，2016，9(1)：4377.

[13] ZOU P，XIA Y，JI J，et al. Piperlongumine as a direct TrxR1 inhibitor with suppressive activity against gastric cancer[J].Cancer Lett，2016，375(1)：114-126.

[14] ESEN H，FEYZIOGLU B，ERDI F，et al. High thioredoxin reductase 1 expression in meningiomas undergoing malignant progression[J]. Brain Tumor Pathol，2015，32(3)：195-201.

[15] ZHU X，HUANG C，PENG B. Overexpression of thioredoxin system proteins predicts poor prognosis in patients with squamous cell carcinoma of the tongue[J]. Oral Oncol，2011，47(7)：609-614.

[16] HAN M. Oral health status and behavior among cancer survivors in Korea using nationwide survey[J]. Int J Environ Res Public Health，2017，15(1)：14.

[17] ERDI F，KAYA B，ESEN H，et al. New clues in the malignant progression of glioblastoma：can the thioredoxin system play a role?[J]. Turk Neurosurg，2018，28(1)：7-12.

[18] ESEN H，ERDI F，KAYA B，et al. Tissue thioredoxin reductase-1 expression in astrocytomas of different grades[J]. J Neurooncol，2015，121(3)：451-458.

[19] JIN R，GAO Y，ZHANG S，et al. Trx1/TrxR1 system regulates post-selected DP thymocytes survival by modulating ASK1-JNK/p38 MAPK activities[J]. Immunol Cell Biol，2015，93(8)：744.

[20] 于萍，步宏，王华，等. 免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究[J]. 生物医学工程学杂志，2003，20(2)：288-290.

[21] 刘保魁，杨玉秀，韩双印，等. 血浆硫氧还蛋白对肝癌的诊断价值研究[J]. 中国全科医学，2013，16(18)：1578-1580.

[22] FU Y，YANG N，LI Y，et al. Evaluation of thioredoxin reductase as a novel biomarker in the diagnosis and treatment of breast cancer[J]. J Chin Pharm Sci，2014，23(10)：711-715.