农业产业化的发展使农产品的生产越来越依赖于农药等外源物质。我国农药的用量居高不下，随着过去使用的许多农药被检测出具有致突变、致畸和致癌性，新上市的农药品种也越来越多，对这些品种农药的快速评价成为目前亟待解决的问题。目前已建立的短期遗传毒理学试验较多，这些试验方法耗时短、价廉、灵敏度高，在农药、化学品暴露的生物学效应评价中取得了较好的评价效果。农药哌虫啶是一种新烟碱类杀虫剂，具有高效、广谱等特点，本研究采用哌虫啶进行体外CHO-K1细胞HGPRT基因突变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，旨在短期内分析农药哌虫啶是否具有遗传毒性。

1　材料与方法

1.1　HGPRT基因突变试验[1]

1.1.1　试剂及仪器 　细胞株及来源：中国地鼠卵巢(CHO-K1)细胞株，购于中国典型培养物保藏中心，采用DMEM/F12培养基(含10 %胎牛血清及1%双抗)，37.0℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。代谢活化系统：代谢活化剂为哺乳动物肝微粒体酶活化系统(S9)，购自美国Moltox公司，批号4027。每毫升S9 mix的成分为S9 1.25 mL，MgCl2 (0.4 mol/L) 0.2 mL，KCl(1.65 mol/L) 0.2 mL，葡萄糖-6-磷酸17.91 mg，辅酶Ⅱ(氧化型，NADP)30.615 mg，用无血清DMEM/F12 培养液补足至10 mL。主要仪器：SANYO MCO-18AIC 二氧化碳培养箱，SW-CJ-2F超净工作台。主要试剂：95%哌虫啶原药，江苏克胜公司提供；3-甲基胆蒽(methylcholanthrene，MCA，2.0 μL/mL)，美国Sigma 公司生产，批号LB83414V；甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS，0.25 μL/mL)美国Sigma公司生产，批号BCBC4573V；以上试剂均用0.5%二甲基亚砜(DMSO，国药集团生产)溶解，批号20121130；6-巯基鸟嘌呤(6-mercaptopurine，6-TG)，美国Sigma公司生产。

1.1.2　剂量设计与分组 　根据预实验结果以625.0 μg/mL作为最高剂量(无细胞毒性，有可见沉淀)，以下剂量依次为312.5、156.3、78.1 μg/mL，同时作阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组给予无菌DMSO(+S9/-S9)；阳性对照组给予3-甲基胆蒽(+S9)、甲基磺酸乙酯(-S9)。

名词用作使动时，与其后的名词一起构成了动宾短语。这种情况，在成语中比较少见。如:“汗牛充栋”是指书籍太多了，放在家里的时候可以一直堆到屋顶上，搬运的时候可以使牛和马累得满身大汗。后来大多用该成语形容著作或藏书极多。“汗牛充栋 ”中的“汗”就是名词的使动用法，意思是使牛流汗。

1.1.3　突变试验 　将经6-硫代鸟嘌呤筛选，选择生长良好的CHO-K1细胞用0.25%胰酶消化处理，用含10%胎牛血清的培养基制成细胞悬液(1.5×106/mL)，每个培养瓶(25 cm2)接种细胞悬液1.0 mL，另加含10%胎牛血清的培养基4 mL(3.0×105/mL)，置37 ℃、CO体积

2分数为5%的培养箱中培养48 h后，弃其培养液，加入4.5 mL含有阴性、阳性物或不同浓度受试物的培养液(不含血清)，+S9每培养瓶加S9混合液0.5 mL，-S9加入0.5 mL培养液。混匀后，置CO2培养箱培养4 h，弃上清，用D-Hanks液洗涤3次，加入5 mL含10%胎牛血清的培养液，培养20 h。培养7 d后进行突变体的选择及集落形成率的测定，同时，每个培养皿接种200个细胞，每个剂量组设5个培养皿，7 d后，甲醇固定，Giemsa染色，观察细胞集落数，计算细胞存活率。培养7 d后，以2×105/皿接种，细胞贴壁后加入6-TG(终浓度为5 μg/mL)，每剂量设5个培养皿。同时另按200/皿接种，每剂量组设5个培养皿。与上述平皿同时放入培养箱7 d，固定、染色，计数集落并计算集落数、存活率(CFE)和突变频率(mutation frequency，MF)。计算公式为：

相对CFE=试验组绝对CFE/溶剂对照组绝对CFE×100%；

1.2.4　试验方法 　分两次灌胃给予受试物，间隔24 h，受试样品各组每次小鼠灌胃容量均为20 mL/kg。于末次给予受试物后22 h处死动物，取股骨做骨髓涂片，自然干燥后用甲醇固定，Giemsa染色。每只动物油镜下观察1 000个嗜多染红细胞，记录出现微核的嗜多染红细胞数，其微核发生率以含微核的PCE千分率计；计数200个嗜多染红细胞数(PCE)，同时计数成熟红细胞数(NCE)，并计算PCE占红细胞总数(PCE+NCE)的百分比。

绝对CFE=形成集落数/接种细胞数；

突变频率=突变型细胞克隆数/(接种细胞数×克隆形成率)×100%

“总是横跨两种文化，却并不属于任何一种。”（Cisneros,1987:23）塞利亚对墨西哥的态度是复杂的：一方面，她称之为“故土”；另一方面，她称之为“我们最近的南方邻居”。这种认知上的双重性，体现了其身份的双重性。作为出生在美国的第二代移民，她以美国公民的身份审视着作为邻居的墨西哥；她的家庭又使她与墨西哥有着牵连不断的联系。

实验数据用Microsoft Excel软件建立数据库，计量资料采用t检验，计数资料采用非参数统计法。

1.2　小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验[1]

1.2.3　剂量设计和分组 　根据资料该受试物对雌、雄性大鼠的LD50均 大于5 000 mg/kg。按LD50的1/8、1/4、1/2设置低、中、高3个剂量组，分别为625、1 250、2 500 mg/kg，另设阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组给予纯水，阳性对照组按40 mg/kg给予环磷酰胺(CP)。动物按体质量随机分为5组，每组小鼠雌性5只，雄性5只。

实验数据用Microsoft Excel软件建立数据库，计量资料采用t检验，计数资料采用非参数统计法。

1.2.1　试验动物 　SPF级昆明小鼠购自湖北省实验动物研究中心，雌雄各25只。体质量25～30 g。SPF级屏障系统内进行。实验动物饲养于塑料饲育盒内，每笼5只，笼具、食盒每周更换一次并进行清洗消毒。环境条件：温度(23±3)℃，湿度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，噪音在60 dB以下；换气次数每小时10～18次。

麻疹是由麻疹病毒引起的以皮丘疹、发热为主要症状的呼吸道传染病，有非常强的传染性，儿童成人均能感染，多数预后良好，在人口密集和人口流动频繁的地区很容易发生流行，2～3年一次大流行。麻疹病毒只有一个血清型，麻疹疫苗接种能有效控制麻疹病毒在人群中的传播。自广东省2009年实行麻疹强化疫苗活动后，河源市人群疫苗接种率有了明显的提高，但是随着外来人口的频繁流动，感染麻疹的风险依然存在。现对河源市2012-2017年麻疹监测情况进行分析，了解其流行特点和易感人群，为及时制定科学的麻疹防控策略提供依据。

1.3　统计学方法

1.2.2　主要仪器和试剂 　主要仪器有Olympus CX21显微镜。主要试剂有甲醇(国药集团生产)、吉姆萨染液(美国Sigma公司生产)

抗胃癌植物类中药药味以苦、甘、辛为主，丰度分别为0.612、0.518、0.271；主要涉及品种包括白花蛇舌草、丹参、缬草、柴胡等，详见表3。临床在选择组方入药时应结合患者临床症状及个体特征充分考虑上述药味特点。

2　结果　

2.1　HGPRT基因突变试验结果

如表1所示，细胞毒性测试表明各组细胞相对存活率均大于50%。如图1所示，与阴性对照组比较，在活化系统和非活化系统条件下，受试样品各剂量组细胞基因突变频率差异均无统计学意义(P＞0.05)，阳性对照组细胞基因突变频率差异有统计学意义(p＜0.01)。

温聪在《中国特色社会主义之特色——对中国特色社会主义内涵特色性的认识》［24］一文中通过区分中国特色社会主义与封建主义、资本主义来明确其内涵；于金富《“中国模式”与中国特色社会主义》［25］通过研究“中国模式”与中国特色社会主义的关系来深化对中国特色社会主义内涵的理解；吴恩远《“中国特色社会主义”和“苏联模式”关系析论》［26］通过区分中国特色社会主义与苏联模式的来界定中国特色社会主义的内涵。

表1　细胞毒性测试和集落形成率(n=200)

DMSO(二甲基亚砜)为阴性对照；3-甲基胆蒽为阳性对照.

S9 组别 终浓度(%，x±s)+ DMSO 5.0 μL/mL 191±4 95.3±2.0 100.0 188±3 93.8±1.6 3-甲基胆蒽 2.0 μL/mL 133±6 66.3±3.2 69.6 120±3 59.9±1.3哌虫啶 625.0 μg/mL 156±9 78.2±4.6 82.1 154±8 76.9±4.0 312.5 μg/mL 165±11 82.6±5.4 86.7 160±5 80.2±2.7 156.3 μg/mL 165±10 82.4±4.9 86.5 165±8 82.5±4.0 78.1 μg/mL 179±10 89.7±4.8 94.1 171±11 85.5±5.6- DMSO 5.0 μL/mL 192±5 96.0±2.7 100.0 189±5 94.7±2.7甲基磺乙酯 0.25 μL/mL 135±8 67.7±4.2 70.5 118±3 59.1±1.6哌虫啶 625.0 μg/mL 159±12 79.7±5.8 83.0 150±8 74.9±3.8 312.5 μg/mL 164±7 81.9±3.3 85.3 158±10 78.9±5.1 156.3 μg/mL 173±11 86.4±5.7 90.0 169±11 84.5±5.4 78.1 μg/mL 175±12 87.7±6.1 91.4 172±10 86.2±5.1细胞毒性测试结果 集落形成率平均集落数-(个)(x±s)绝对集落形成率-(%，x±s)相对集落形成率(%)平均集落数-(个，x±s)集落形成率-

图1　各受试物对基因位点突变频率的影响

2.2　小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果数据见表2。结果表明，受试物各组未成熟红细胞占红细胞总数的比例[PCE/(PCE+NCE)总数]均不少于阴性对照组的20%；与阴性对照组比较，阳性对照组雌雄小鼠微核率明显增加(p＜0.01)，而受试样品各剂量组雌雄小鼠微核率差异均无统计学意义(P＞0.05)，表明该受试样品骨髓细胞微核试验结果为阴性。

3　讨论　

农药哌虫啶HGPRT基因突变试验与小鼠微核试验结果均为阴性，在本实验条件下未发现致突变性。化学有害物质导致的DNA损伤后主要表现为体细胞基因突变，此突变可导致发生多种疾病，并和肿瘤的发生关系密切，在化学物质导致基因突变作用中占有特殊地位 [2]。在检测体细胞基因突变体系中，HGPRT基因突变是一种常用的方法，在有关化学物质遗传毒性检测策略的文献中也提到，为有效鉴定物质是否具有致突变性，一组小型试验中应当含有哺乳动物细胞突变试验 [3]。因此，在评价农药哌虫啶遗传毒性的体外试验中，能够对体细胞的基因突变进行准确检测分析的方法常作为必选方法。有研究显示，应用中国仓鼠卵巢细胞CHO/ HGPRT基因突变试验方法，43种已知的具有致癌性化学物质中的40种化学物质在该试验结果中为阳性 [4]。并且哌虫啶HGPRT基因突变试验结果还可为后续致癌性评价试验提供剂量参考。有几项研究中提到，微核试验在敏感性、准确性和特异性方面与染色体畸变试验方法几乎相当 [5-6]。由于微核试验方法具有简便、快速、试验结果可信度高 [7]、可在较短时间内检出染色体损伤效应、背景清楚、影响因素少、易重复等特点，故可被应用于哌虫啶的遗传毒理学中的染色体损伤的检测之前。此外，体内微核试验往往采用适合浓度的化合物处理，符合体内的正常生理状态，故在哌虫啶的安全性评价上更具生理学意义。

表2　哌虫啶原药试验结果(n=5)

环磷酰胺为阳性对照；与阴性对照组比较，**p＜0.01；PCE：嗜多染红细胞；NCE：成熟红细胞.

性别 组别(mg/kg)微 核观察PCE(个) 含微核PCE数(个) 微核率(‰)雌 阴性对照组 1 000 815 55.1 5 000 16 3.2±1.3哌虫啶625 mg/kg 1 000 793 55.8 5 000 17 3.4±0.5 1 250 mg/kg 1 000 814 55.1 5 000 16 3.2±0.8 2 500 mg/kg 1 000 845 54.2 5 000 19 3.8±1.3环磷酰胺40 mg/kg 1 000 929 51.8 5 000 87 17.4±1.8**雄 阴性对照组 1 000 883 53.1 5 000 17 3.4±0.5哌虫啶625 mg/kg 1 000 852 54.0 5 000 19 3.8±0.8 1 250 mg/kg 1 000 909 52.4 5 000 18 3.6±1.1 2 500 mg/kg 1 000 858 53.8 5 000 22 4.4±0.9环磷酰胺40 mg/kg 1 000 1 008 49.8 5 000 96 19.2±2.6**PCE(个)NCE(个)PCE/(PCE+NCE)(%)

参考文献

[1] 中华人民共和国农业部. GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法[S]. 北京：中国标准出版社，1995：8.

[2] JAMES T M，DANIEL C，LUTZ M. Strategies and testing methods for identifying mutagenic risks[J]. Mutat Res，2000，455(1)：3-20.

[3] THYBAUD V，AARDEMA M，CLEMENTS J，et al. Strategy for genotoxicity testing：hazard identification and risk assessment in relation to in vitro testing[J]. Mutat Res，2007，627(1)：40-58.

[4] KARGALIOGLU Y，MCMILLAN B J，MINEAR R A，et al.Analysis of the cytotoxicity and mutagenicity of dringking water disinfection by-products in Salmonella typhimurium[J]. Teratog Carcinog Mutagen，2002，22：112-128.

[5] GALLOWAY S M，MILLER J E，ARMSTRONG M J，et al.DNA synthesis inhibition as an indirect mechanism of chromosome aberrations：comparison of DNA-reactive and non-DNA-reactive clastogens[J]. Mutat Res，1998，400(1)：168-186 .

[6] AMES B N， MCCANN J， YAMASAKI E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test[J]. Mutat Res，1975，31(6)：346-364.

[7] 王心如. 毒理学实验方法与技术[M]. 北京：人民卫生出版社，2003.