近年来，实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR)因其灵敏性、精确性及易操作性已被广泛应用于病原检测、单核苷酸多态性检测及基因表达等常规生物学检测中[1].qRT-PCR可以检测基因在不同时期以及不同处理后的基因表达差异，但是对基因进行实时荧光定量检测时，cDNA模板的质量、不同处理间的RNA质量以及酶反应的效率差异会干扰最终结果，因此有必要引入内参基因校正结果.内参基因通常是管家基因(House-Keeping Genes)，理想的内参基因应满足以下4点[2-4]：①在不同组织细胞中表达恒定；②表达水平不受外部因素影响，如重金属胁迫等；③不存在非功能性假基因，以防基因组DNA进行扩增；④基因表达水平较高且与目的基因表达水平相近.目前研究发现，还未有能全部满足上述条件的理想的内参基因，在不同处理条件下、不同组织及细胞中内参基因表达均不恒定.因此，在进行qRT-PCR之前，应对内参基因进行筛选验证，以期获得一种表达较为稳定的内参基因，保证实验结果的可信性及准确性.

金属镍(Ni)是人类在职业及环境中广泛接触的重金属污染物之一，同时也是一种多系统、多器官、多细胞毒物[5,6]已有研究表明长期接触镍及其化合物具有强烈的致癌效应，因此镍污染问题逐渐引起人们的高度关注.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为真核模式生物，与同为模式生物的动物及植物细胞具有相似结构，且体积小、易培养，在研究镍及其化合物的细胞及分子毒理机制、重金属污染防治等方面具有优势.

目前，关于重金属镍胁迫下酿酒酵母内参基因的筛选还没有报道.本文以5 mM Ni2+胁迫下的酿酒酵母BY4741，H4K5R为材料，利用qRT-PCR检测5种候选内参基因β-actin，PDA1，ALG9，TDH3，TAF10的表达水平，并通过GeNorm和NormFinder软件分析上述5种内参基因的稳定性，筛选出了一个重金属镍胁迫下酿酒酵母细胞中表达较为稳定的内参基因，为研究镍胁迫下酿酒酵母细胞内相关基因的表达奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株与培养基

菌株：酿酒酵母菌株BY4741，H4K5R均购买于Fisher Thermo Scientific (Catalog no.YSC5106).

YPD液体培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，加入蒸馏水定容.

YPD固体培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，加入蒸馏水定容.

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂：Yeast RNAiso Kit，PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，rTaq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司.

仪器：高速冷冻离心机(Eppendorf，centrifuge 5424 R)，紫外分光光度计(Thermo，Nano Drop 2000)，PCR仪(ABI，Veriti 96 Well Thermal Cycler)，实时荧光定量PCR仪(Thermo，7500 Real-time PCR System).

1.2 实验方法

1.2.1 酿酒酵母候选内参基因引物设计

根据实时荧光定量PCR引物设计原则，利用Primer Premier 5.0设计了β-actin，PDA1，ALG9，TAF10以及TDH3等5个内参基因所需的Real-time PCR引物，如表1所示.

利用GeNorm和NormFinder软件对候选内参基因的稳定性进行评估.软件输入数据转换公式为：Q=EΔCT，ΔCT=CTmin-CT样品，其中Q为各内参基因相对表达量；E为基因的扩增效率，一般情况下默认理想的E值为2；CTmin为每个内参基因在所有样品中最小的CT值；CT样品为各个样品的CT值.

(3)exp(G)=4时有G=Q8,M2(2,1),M2(2,2),M2(2,1,1)或M2(2,2,1);

 

表1 候选内参基因引物

 

Table 1 Primer sequences of candidate reference genes

  

基因Gene name基因描述Gene description引物序列Primer sequence(5’-3’)β-actinACTinF:ACTTTCAACGTTCCAGCCTTCR:CGTAAATTGGAACGACGACGTGAGTAPDA1PyruvateDehydrogenaseAlphaF:CTGTTGGTCAGGAGGCCATTR:GCATGGAACCACCCTTACCAALG9Asparagine-LinkedGlycosylationF:GCCGTTGCCATGTTGTTGTAR:GTCGAATGCGGTTCTGATGGTAF10TATAbindingprotein-AssociatedFactorF:ATGCTAACAACAGTCAGGCGAR:GAGCCCGTATTCAGCAACAGTDH3Triose-phosphateDeHydrogenaseF:GCTGCTAAGGCTGTCGGTAAR:GTCAGAGGAGACAACAGCGT

1.2.2 RNA提取

将预活化的酿酒酵母BY4741，H4K5R转接至含有5 mM Ni2+ 50 mL YPD液体培养基中，30 ℃，200 r/min恒温培养至对数生长期，按照Yeast RNAiso Kit试剂盒说明书提取酵母细胞RNA.采用Nano Drop 2000分光光度计测定RNA的浓度以及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性.

全置组的术中用时、术中出血量和住院时间与半置组的相比较,有一定的不同,存有统计学意义(P<0.05)。具体数据对比见表1所示:

本实验以CT值来指征基因的表达量，CT越小，基因的表达量越高即基因的表达丰度越高.5个内参基因在不同酿酒酵母中的表达都有一定的变化，其中，β-actin，TDH3以及PDA1表达丰度较高，CT值均在19～26之间，而ALG9和TAF10表达丰度较低，CT值在22～26之间如图3所示，说明β-actin，TDH3以及PDA1可优先作为本实验中的内参基因.

GeNorm软件通过比较内参基因稳定性系数M评估其稳定性.M值越小，说明内参基因越稳定.本实验中内参基因稳定性系数M从小到大依次为β-actin(0.808)<TDH3(0.876)<PDA1(1.006)<ALG9(1.008)<TAF10(1.308)，说明β-actin表达最为稳定，可作为本实验的内参基因，结果如图4所示.

1.2.3 候选内参基因的筛选

以酿酒酵母野生型菌株BY4741 cDNA为模板，采用普通PCR检测5种候选内参基因引物质量，由图2可知，电泳条带明亮清晰，无非特异性条带及引物二聚体，可用于后续实验.

1.2.4 数据分析

由此可以看出，我国的煤矿主要分布情况比较复杂，对于如此复杂的煤矿分布的地理情况，地质勘测工作可以有效降低复杂的煤矿分布情况带来的不利影响。煤矿

2 结果与分析

2.1 总RNA提取及电泳鉴定

迭代次数epochs对模型的泛化精度有一定的影响,若迭代次数太多,模型出现过拟合,太少又会欠拟合.本文设置了4个epochs值:10、20、30和40,预测单节点对间的链路,以确定节点数与epochs之间的关系.模型训练过程中的实际效果分别如图8和图9所示.

  

图1 RNA电泳Fig.1 RNA electrophoretogram

2.2 候选内参基因引物质量评估

以上述反转录获得的cDNA为模板进行荧光定量分析.Real-time PCR体系为20 μl，加入cDNA 2 μl，SYBR premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μl，PrimerF/R 0.4 μl，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μl，加入RNase-free H2O 6.8 μl.反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40个循环；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s.

qRT-PCR实验中RNA的质量至关重要.本实验检测了RNA的纯度与完整性，采用Nano Drop 2000紫外分光光度计检测RNA质量，0D260/OD280均在1.8～2.0之间，0D260/OD230均大于2.0，说明RNA提取纯度较好，无蛋白质、盐离子污染.5，18，28 s电泳条带清晰，且28 s条带亮度约为18 s 2倍，说明RNA未降解，完整性较好，可用于后续实验如图1所示.

  

图2 候选内参基因引物质量评估Fig.2 Primer quality assessments of 5 candidate genesNote:M: DL 1 000 Marker; 1: β-actin; 2: PDA1;3: ALG9; 4: TDH3; 5: TAF10

2.3 候选内参基因表达丰度检测

除基因组DNA反应体系为10 μL，即提取的RNA 1 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μl，加入RNase-free H2O 6 μl，混匀后42 ℃水浴2 min.

  

图3 5个候选内参基因在酿酒酵母中的表达丰度Fig.3 qRT-PCR CT values of 5 candidate referencegenes in Saccharomyces cerevisiae

2.4 内参基因稳定性分析

2.4.1 GeNorm软件分析内参基因稳定性

反转录反应体系为20 μl，即上述反应液10 μl，5×PrimeScript Buffer24 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，RT Primer Mix 4 μl，加入RNase-free H2O 1 μl，反应在PCR仪上进行，程序为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃反应结束.

  

图4 GeNorm软件分析获得的5个内参基因在酿酒酵母中的表达稳定值(M)Fig.4 The expression stability of 5 candidate referencegenes in Saccharomyces cerevisiae analyzed by GeNorm(M)

2.4.2 NormFinder软件分析内参基因稳定性

NormFinder软件通过分析各个内参基因表达的稳定值S评价内参基因的质量，其中S值越小，基因表达越稳定(表2).基因的稳定性参数S按照从小到大的顺序依次为：从小到大依次为β-actin(0.203)<TDH3(0.250)<ALG9(0.538)<PDA1(0.557)<TAF10(0.856)，其中β-actin的S值最小，表达最为稳定，与GeNorm软件分析相符，因此本实验选用β-actin作为内参基因.

具体来看，一方面要在保证产品安全有效、质量可控的前提下，改革审评审批机制，简化特殊食品变更注册和延续注册程序；另一方面，监管部门要严格执行特殊食品生产经营许可相关规定，督促企业按照良好生产规范要求，建立生产质量管理体系。

 

表2 通过NormFinder软件分析获得的

 

各个内参基因的表达稳定值(S)

 

Table 2 The expression stability of 5 candidate reference

 

genes in Saccharomyces cerevisiae analyzed by NormFinder

  

基因Gene nameS值Stability value稳定性排名Ranking order最优基因Best geneβ-actin0.2031TDH30.2502β-actinALG90.5383PDA10.5574TAF100.8565

3 讨论

由于实时荧光定量PCR具有特异性、灵敏性等诸多优点，已被普遍应用于检测基因差异表达的过程中.然而，qRT-PCR实验的准确性也受限于RNA质量、反转录效率及操作方法是否得当等因素中，其中内参基因的稳定性是关键的影响因素.内参基因通常为在不同组织细胞中表达恒定的管家基因且不受外界环境因素的影响[7]，但经研究发现，目前还没有任何一种管家基因可以完全满足上述条件，说明内参基因在不同的实验条件下表达存在差异且影响后期目的基因数据分析，因此应根据实验具体环境条件筛选最适内参基因.

目前关于重金属镍胁迫下酿酒酵母实时荧光定量PCR内参基因的筛选还未见报道.本实验以5 mM Ni2+镍胁迫下的酿酒酵母BY4741，H4K5R为研究对象，利用qRT-PCR检测5种候选内参基因β-actin，PDA1，ALG9，TDH3，TAF10的表达水平，结果表明β-actin，TDH3以及PDA1表达丰度较高，并通过GeNorm和NormFinder软件分析上述5种内参基因的稳定性，结果β-actin在镍胁迫下表达最为稳定，可作为本实验理想的内参基因.

2）高职生就业的岗位是在一线，而在具体处理事情的过程中经常会遇到各种各样的设备和仪器，要求高职生具备很宽泛的、相关联的专业知识。特别是在“中国制造2025”背景下，机械制造向智能化方向发展，学生所需要具备的知识更为广泛。

β-actin即肌动蛋白，作为细胞内重要的骨架蛋白，在不同物种间高度保守.李天丽[8]等在法夫酵母中检测了β-actin，gpd，18SrRNA内参基因的稳定性，发现β-actin稳定性最佳，适合作为内参基因.Anders[9]等在利用葡萄糖短时间刺激酿酒酵母中心碳代谢实验中，发现ACT1可用作内参基因校正目的基因数据的有效性.Vaudano[11]等人发现在给具有活性的干酵母进行补液的实验中，ACT1是最适内参基因.马小英[12]等人检测了干旱和盐胁迫条件下大麦中内参基因的稳定性，发现ubiquitin，Actin和ARF1在不同的胁迫处理下均有较为稳定的表达.综上，β-actin在不同物种间及同物种不同处理间表达均较为稳定，适合作为qRT-PCR实验的内参基因，这与本实验结果相一致.本研究为镍胁迫下酿酒酵母细胞内基因表达的实时荧光定量PCR分析奠定了基础.

参考文献：

[1] Teste M A, Duquenne M, François J M, et al. Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in Saccharomyces cerevisiae[J]. Bmc Molecular Biology, 2009, 10(1): 99-113.

[2] 张玉芳, 赵丽娟, 曾幼玲. 基因表达研究中内参基因的选择与应用[J]. 植物生理学报, 2014，(8): 1119-1125.

[3] 董晓丽, 王加启, 卜登攀, 等. 内参基因在实时定量PCR中应用的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(9): 83-85.

[4] 王 艳，刘 瑜.番茄实时定量PCR内参基因选择的研究进展[J]. 北方园艺, 2015，(23): 198-201.

[5] Doll R. Nickel exposure: a human health hazard[J]. Iarc Sci Publ, 1984, 17(53):3-21.

[6] 曹翠萍, 王雪莉. 重金属-镍对人体健康的危害及预防[J]. 中国现代药物应用, 2013,7(9):78-79.

[7] Kozera B, Rapacz M. Reference genes in real-time PCR[J]. Journal of Applied Genetics, 2013, 54(4): 391-406.

[8] 李天丽, 郑晨华, 李利君, 等. 实时定量PCR构建法夫酵母内参基因β-actin，gpd，18S rRNA标准品质粒和标准曲线[J]. 激光生物学报, 2013, 22(4): 379-384.

[9] Sthlberg A, Elbing K, Andrade-Garda J M, et al. Multiway real-time PCR gene expression profiling in yeast Saccharomyces cerevisiae, reveals altered transcriptional response of ADH-genes to glucose stimuli[J]. Bmc Genomics, 2008, 9(1): 170-184.

[10] Vaudano E, Costantini A, Cersosimo M, et al. Application of real-time RT-PCR to study gene expression in active dry yeast (ADY) during the rehydration phase[J]. Int J Food Microbiol 2009, 129(1): 30-36.

[11] 马小英, 贾方兴, 赵颖岚, 等. 干旱和盐胁迫中大麦实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 分子植物育种, 2016,(11): 3093-3101.