性别决定和分化是种族得以繁衍延续的物质基础，性别作为生物的重要而又复杂的表型，由基因和环境因素共同调控，其中基因扮演关键的作用[1].自从发现Y性别决定区（sex determining region of the Y chromosome，SRY）基因在哺乳动物雄性别决定与分化中的调控功能以来，SOX（SRY-related HMG box）基因一直被认为与性别分化和生殖腺发育最密切[2-3].SRY是哺乳动物Y染色体指导雄性性别分化的基因，SRY的突变会导致人类XY型性腺发育不全[4-5].SRY的开放阅读框（ORF）包括一个外显子，而没有内含子，负责编码一个204个氨基酸的蛋白，其中包括3个区域：N端区域，HMG（high mobility group，HMG）区域以及C端区域.HMG区域在各个物种间高度保守，包含有3个Alpha螺旋区域，中间由线圈隔开，能够识别DNA的小沟，引发构型变化，从而影响下游基因的表达[6-8].实验中通过软件预测发现了在WD重复蛋白5（WD repeat-containing protein 5，WDR5）的启动子上存在SRY结合位点，提示SRY很可能作为转录因子结合其上.为了深入了解SRY的功能及与WDR5的相互作用关系，本研究采用基因重组技术构建了pGEX-6p-1-SRY重组质粒后，将其转化到大肠杆菌中以IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白，并对GST-SRY融合蛋白进行纯化，为后续的研究提供前期支持.

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞由本室保存；BamHⅠ、XhoⅠ和T4连接酶试剂盒购自TaKaRa；2×SuperStar PCR Mix With Loading Dye、快速质粒小提试剂盒和蛋白分子质量标准为GenStar产品；DNA胶回收试剂盒购自 Qiagen；载体 pGEX-6P-1以及 Glutathione Sepharose 4B亲和树脂购自GE；TRIZOLReagent购自Invitrogen；感受态细胞DH5α和RosettaDE3购自TIANGEN;BugBuster Protein Extraction Reagent购于Novagen；IPTG购自 Amresco；1kb DNA Ladder Marker购自Solarbio；1640培养液购于 HyClone；胎牛血清购于BI公司；其他试剂为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 293T细胞用含10%FBS的DMEM的培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养.

1.2.2 引物设计 根据NCBI上SRY基因序列利用Primer5软件设计SRY基因的引物.上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAATCATATGCTTCTGCTATG-3'；下游引物：5'-CCGCTCGAGCTACAGCTTTGTCCAGTGGCT-3'.

1.2.3 PCR扩增SRY目的片段和回收 在293T细胞中提取RNA逆转录合成cDNA为模板，PCR扩增SRY的条件为：预变性95℃5 min，变性95℃40 s，退火 55℃40 s，延伸72℃2 min，2～4步骤重复35个循环，延伸72℃10 min，取5 μL PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段.

提取293T细胞总RNA，样品经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，可见28S rRNA、18S rRNA及5S rRNA条带，且28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍，提示得到了高质量的总RNA（图1）.

选取本院于2017年9月—2018年9月收治的88例行膀胱肿瘤电切术后的膀胱癌患者作为研究对象，将其随机分为常规组、研究组，两组各有44例。研究组中，男24例，女20例，年龄46～70岁，平均（54.3±10.5）岁；常规组中，男 25例，女19例，年龄44～70岁，平均（54.5±10.6）岁。两组患者的一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者均在知情的前提下，签署研究知情书；通过医学伦理委员会审查；在本院行膀胱肿瘤电切术治疗；随访资料完整。排除临床资料不全、依从性欠佳、精神异常的患者。

传统课堂课堂中，教师对学生的影响其实仅仅出现在课堂内，下课之后基本上学生都是以自主学习为主。学生需要完成教师布置的家庭作业，但是这个过程基本处于教学真空状态，如果遇到问题只能自己想办法解决。从图中可以看出，传统课堂的教学模式中，师生互动基本处于真空状态，教学过程也仅仅停留于课堂之中。

目的片段SRY和质粒pGEX-6P-1经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，T4连接酶连接后转化到感受态细胞DH5α，获得重组表达质粒.重组质粒双酶切检测得到与预期结果一致的615bp目的片段和4900bp的载体片段（图3），提示目的片段已插入到pGEX-6P-1中.测序列结果也证实了重组质粒中目的片段序列与报道的SRY序列一致，表明重组质粒pGEX-6p-1-SRY构建成功.

将测序正确的pGEX-6p-1-SRY转化到感受态细胞RosettaDE3中，收集IPTG诱导前、诱导后的菌液经超声裂解的上清，SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色检测，结合GST及SRY的分子量大小，融合蛋白的分子量与理论值相符，表明表达载体转化宿主菌后诱导出大量GST-SRY融合蛋白（图4）.

2 结果

2.1 提取293T细胞总RNA的检测

米非司酮为孕激素拮抗剂,抗孕酮效果显著,能影响孕激素作用,导致胚囊变性坏死,进而流产。治疗异位妊娠时,其给药方式多为空腹口服,25~100 mg/次,1~2次/d,3日为1疗程。初期未破裂异位妊娠者空腹治疗的用药频次为一天两次,100 mg/次,连用3日,有效率可达85%。单独给予米非司酮治疗异位妊娠的情况较少见,临床上主要采用米非司酮和活血化瘀中药联合应用,但最常用经是米非司酮和甲氨蝶呤合用。有研究表明,采用米非司酮联用甲氨蝶呤治疗早期异位妊娠的效果确切,可明显缩短患者包块消失时间和β-HCG恢复正常时间,改善异位妊娠症状,且安全性好,值得临床推广应用[4]。

  

图1 293T细胞总RNA的提取Fig.1 Extraction of total RNA extracted from 293T cells

2.2 目的基因的扩增

以上述总RNA逆转录的cDNA为模板，经PCR扩增，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，得到约615 bp的目的片段，其大小与预期值相符（图2）.

  

图2 PCR扩增SRYFig.2 PCR products of SRY

 

1:DNA Marker；2:PCR扩增产物.

2.3 pGEX-6P-1-SRY原核表达的构建和鉴定

1.2.5 GST-SRY融合蛋白诱导表达 参照TIANGEN公司的感受态RosettaDE3细胞使用说明书，将pGEX-6P-1-SRY转化到RosettaDE3感受态细胞中，37℃过夜培养后以5%的比例接种于相同的培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导剂，于21℃条件下诱导目标蛋白的表达.5 h后离心收集菌体，再用预冷的PBS重悬，之后在冰浴下超声波破碎菌体（参数：功率400 W，超声3 s，停2 s，共25 min），离心收集上清蛋白液，同时设置未诱导全菌液作为阴性对照，SDS-PAGE电泳分析GST-SRY融合蛋白表达情况.

1.2.4 SRY目的片段与pGEX-6P-1载体重组及鉴定 胶回收后的SRY目的片段和pGEX-6P-1载体，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，用T4连接酶连接，其产物转化到感受态细胞E.coli DH5α，挑选阳性克隆，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切初步鉴定重组质粒，将鉴定正确的质粒寄往昆明硕擎公司测序验证后得到重组表达质粒pGEX-6P-1-SRY.

  

图3 重组质粒pGEX-6P-1-SRY酶切鉴定Fig.3 BamHI/XhoI digestion of recombinant plasmidpGEX-6P-1-SRY

 

1:DNA Marker；2:重组质粒 pGEX-6P-1-SRY.

2.4 pGEX-6P-1-SRY融合蛋白的诱导表达

1.2.6 GST-SRY融合蛋白的纯化 0.5mmol/L的IPTG在21℃条件下大量诱导表达GST-SRY融合蛋白5 h，按GE提供的方法进行蛋白的纯化，即首先加入裂解液，进行超声破碎菌体，4℃下离心收集上清，加入适量Glutathione sephamse 4B，4℃下过夜结合后离心收集GST-SRY融合蛋白珠子，加入谷胱甘肽洗脱缓冲液充分洗脱，最后离心收集蛋白上清，并使用SDS-PAGE电泳进行分析.

  

图4 IPTG诱导融合蛋白GST-SRY表达SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of GST-SRY fusion protein expression with induction of IPTG

 

M:蛋白Marker；1:未经IPTG诱导上清；2:IPTG诱导的上清.

2.5 GST-SRY融合蛋白的纯化

GST-Sepharose 4B亲和柱纯化得到融合蛋白，经还原型谷胱甘肽洗脱液缓冲液少量多次洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，与纯化前GST-SRY融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果相比较得到纯度较高的GST-SRY（图5）.

  

图5 纯化后GST-SRY融和蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purification of GST-SRYfusion protein expression

 

M:蛋白Marker；1:纯化后的GST-SRY融合蛋白.

3 讨论

SRY基因定位于Y染色体上，是睾丸分化发育中起着开关式的重要调节作用的基因之一.SRY是SOX家族的首个成员与其它所有成员的共同特点一样含有一个高度保守的HMG的DNA结合域[9]，迄今为止已发现 SRY、SOX3、SOX8、SOX9、MIS、WT-1、SF-1、DAX-1等基因参与了胚胎性别决定中从未分化原始生殖嵴开始到两性内生殖器官形成的过程[10-12]，其中最重要的基因是SOX9，该基因表达的蛋白和SRY蛋白具有相似的功能.笔者在前期的研究中发现SRY与WDR5共定位在SOX9的启动子上，SRY可上调WDR5的表达，两者共同作用提高SOX9的表达，提示WDR5在性别决定中起着重要的调节作用[13].但是，这些基因的相互作用及下游区的目的基因尚无法确定.

农业科技的发展是推进农业现代化的源源动力。加强与农业机械生产单位之间的合作：一方面，由玉米种植农户为农业机械生产单位提供更多的基础数据，使之在农业科技发展、农业机械生产方面获得更多的实践经验；另一方面，农业机械生产单位也要充分考虑到玉米种植农户的实际需求，严把农业机械设备的质量关，提高农业机械与北地区农业生产的匹配度，扩大农业机械的适用范围，确保农业机械应用效果，进而引导农户改良自身的玉米种植习惯，加速玉米生产全程机械化的进程。

在本课题采用的pGEX-6p-1载体含有S-D序列、Trp-lac（Tac）启动子，lac P操纵基因、多克隆位点、lac I调节基因、氨苄青霉素的抗性基因[14]，故利用IPTG能诱导Tac启动子使其在E.coli.中高水平的表达GST-SRY融合蛋白，以及pGEX-6p-1载体所诱导表达的蛋白在N端带有GST标签的特性，方便了GST融合蛋白的纯化，为抗体的制备提供了有利的条件，并为进一步S RY蛋白功能的研究奠定了基础[15].

［参考文献］

［1］李萌，贺竹梅.遗传学教学中性别决定关键基因的阐述［J］.遗传，2014，36（6）:611-617.

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［3］VETRO A，DEHGHANI M R，KRAOUA L，et al.Testis development in the absence of SRY:Chromosomal rearrangements at SOX9 and SOX3 ［J］.European Journal of Human Genetics，2015，23（8）:1025-1032.

［4］LARNEYC，BAILEYTL，KOOPMANP.Switchingon sex:transcriptional regulation ofthe testis-determining gene Sry［J］.Development，2014，141（11）:2195-2205.

［5］BERTA P，HAWKINSJR，SINCLAIR A H，et al.Genetic evidence equating SRY and the testis-determining factor［J］.Nature，1990，348（6300）:448-450.

［6］THOMASJO.HMG1AND2:architectural DNA-binding proteins.［J］.BiochemSoc Trans，2001，29（4）:395-401.

［7］FERRARIS，HARLEY V R，PONTIGGIA A，et al.SRY，like HMG1，recognizes sharp angles in DNA ［J］.Embo Journal，1992，11（12）:4497-4506.

［8］CONNORF，CARYPD，READCM，et al.DNA bindingand bending propertiesof the post-meiotically expressed Sry-related protein Sox-5.［J］.Nucleic Acids Res，1994，22（16）:3339-3346.

［9］PONTIGGIA A，RIMINI R，HARLEY V R，et al.Sex reversingmutations affect the architecture ofSRY DNA complexes［J］.The EMBO Journal，1994，13（24）:6115-6124.

［10］HARLEY V R，ClARKSONMA.The molecular action and regulation of the testis-determining factors，SRY（sex-determining region on the Y chromosome）and SOX9（SRY-related high-mobility group（HMG）box 9）［J］.Endocrine Reviews，2003，24（4）:466-487.

［11］CHABOISSIER M C，KOBAYASHI A，VIDALVI，et al.Functional analysis of Sox8 and Sox9 during sex determination in the mouse［J］.Development（Cambridge，England），2004，131（9）:1891-1901.

［12］SEKIDO R，LOVELLBADGE R.Sex determination involves synergistic action ofSRY and SF1 on a specific Sox9 enhancer［J］.Nature，2008，453（7197）:930-934.

［13］XU Z，GAO X，HE Y，et al.Synergistic Effect ofSRY and Its Direct Target，WDR5，on Sox9 Expression ［J］.PLoS ONE，2012，7（4）:e34327.

［14］SAMBROOK J，RUSSELL D W.分子克隆实验指南［M］.第3版.北京：科技出版社，2002：1228-1232.

［15］赵瑜，胡月新，卢敏南，等.人血管内皮生长因子A（VEGFA）的原核载体构建、蛋白表达及鉴定［J］.昆明医科大学学报，2015，36（06）:31-34.