肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，发展速度大，5 a生存率低，是当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一.我国国家癌症中心2015年发布的数据显示，2006年至2011年我国肺癌5 a患病率是130.2（1/10万）.其中男性84.6（1/10万），居恶性肿瘤第2位.女性45.6（1/10万），居恶性肿瘤第4位[1].云南省宣威市与个旧市肺癌发病率仍世界前列，尤其是宣威市女性肺腺癌的发病率高居世界首位.肺癌中80%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）.尽管肺癌的早期诊断和规范化治疗都取得了一定的进步，但5 a生存率仅为8%～10%.探索其生物学特性对于改善NSCLC预后用重要意义.新近发现的CD151基因在多种人类肿瘤中广泛表达，且与肿瘤的恶性进展、预后、治疗等有密切的关系[2].笔者前期研究发现，CD151在腺癌组织中的表达高于鳞癌组织及其他病理类型[3-4].RNAi是双链RNA介导的序列特异性转录后的同源靶基因沉默效应，一种快速关闭基因的新方法.本研究中，笔者构建了针对人CD151基因的RNAi序列，通过体外细胞培养，筛选抑制效应最强的干扰序列.利用裸鼠尾静脉注射干扰前后肺腺癌A549细胞，建立人工肺转移的老鼠动物模型，旨在研究靶向CD151基因干扰对裸鼠肺腺癌A549肺转移的影响，为肺腺癌的发病机制提供理论基础；为肺腺癌的治疗提供可能的新的治疗靶点和思路.

1 材料与方法

1.1 真核表达质粒的构建

根据 Genebank中CD151基因的序列（NM-004357）及相关设计原则，设计3对RNAi序列，构建shRNA，并插入真核表达载体pGPU6/GFP/Neo，构建3个阳性CD151-shRNA表达质粒，分别为pGPU6/GFP/Neo-CD151-271（靶序列：GCCCTCAAGAGTGACTACATC）；pGPU6/G FP/Neo-CD151-450（靶序列：GCTGGAGATCATC GCTGGTAT）；PU6/GFP/Neo-CD151-728（靶序列：GAGACCATGCCTCCAACATCT）.设立无关序列阴性对照pGPU6/GFP/Neo-shNC和空白对照.由上海吉玛制药技术有限公司设计及合成.

1.2 细胞转染

选取选择生长状态好、处于对数生长期的肺腺癌A549细胞，按4×105个细胞/孔接种6孔板，将室温孵育的各组重组质粒2 μg和5 μL脂质体LipofectamineTM 2000混合物，加入各孔中.37℃，5%CO2培养箱中培养4 h，然后弃去各孔中的培养液，换成含10%小牛血清RPMI-1640培养基继续培养并于荧光显微镜下观察转染效率.完全培养基培养24 h后，以加G418 600 μg/mL的完全培养基筛选、培养、扩增，并于荧光显微镜下观察转染效率.

1.3 用荧光定量PCR检测CD151mRNA在转染细胞株中的表达

CD151上游引物为5'-ACTTCATCCTGCTCCTC ATCAT-3'，下游引物为5'-TCCGTGTTCAGCTGCT GGTA-3'，扩增片段长度为 85 kb.内参基因hRPS13，上游引物为5'-GTTGCTGTTCGAAAGCAT CTTG-3'，下游引物为5'-AATATCGAGCCAAACGG TGAA-3'，扩增片段长度为89 kb.Trizol法提取总RNA，按BIO-RAD公司试剂盒说明书逆转录成cDNA并配置PCR反应体系，应用EvaGreen Dye荧光染料扩增待测基因及内参基因.反应体系总体积20 μL.反应条件：预变性95℃，1 min，其后95℃15 s，59℃1 min，40个循环，最后进行溶解、扩增曲线分析.

1.4 Werstern Blot检测CD151蛋白在转染细胞株中细胞株中的表达

转染24 h时后，获取细胞，提取蛋白，按上海碧云天公司生物技术公司提供的Western blot操作步骤进行蛋白电泳.

根据干扰效果，选择pGPU6/GFP/Neo-CD151-450质粒为干扰质粒，做后续实验研究.

1.5 建立裸小鼠荷A549肺癌细胞尾静脉注射肺移植瘤模型

采用SPSS软件进行统计学分析，计量资料且服从正态分布用（±s）表示，多组间的比较用单因素方差分析，如果有差别进一步用q检验两两比较.计数资料用n（%）描述，χ2检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义.

1.6 移植瘤的病理学检测

30 d脱颈处死处死裸鼠后，取出肺脏移植瘤及内脏器官.用Bouin's液浸泡24 h后，再用4%多聚甲醛固定大于24 h、拍照，常规制作病理切片，HE染色，在光学显微镜下观察组织的形态学变化.

1.7 统计学处理

SPF级BALB/c-nu/nu裸小鼠，鼠龄7～8周，体重20～24 g，雌性.购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXX（京）2012-000.将前一部分稳定转染了阳性干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-CD151-450的 A549细 胞（A549-shRNA）和转染了阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC的A549细胞（A549-shNC）继续传代培养.随机分为3个组，每组8只.每组一次性顺序接种A549-shRNA、A549-shNC、A549-Blank（空白对照）.用1 μL注射器吸取100 μL浓度约1×106/100 μL的细胞悬液，每只裸鼠通过尾静脉接种量为1×106个细胞.定期观察裸小鼠的精神、饮食、排便、体重和活动等情况，当小鼠出现明显体重下降、食欲不振、饮水量减少、精神萎靡、皮肤干燥及呼吸困难等现象时，根据实验动物伦理法，脱颈处死并解剖小鼠.

2 结果

2.1 重组质粒测序结果

将重组质粒 pGPU6/GFP/Neo-CD151-271，pGPU6/GFP/Neo-CD151-450，pGPU6/GFP/Neo-CD151-728，pGPU6/GFP/Neo-shNC送DNA测序，测序结果完全符合设计要求.附pGPU6/GFP/Neo-CD151-271部分测序结果图（图1）.

本研究结果显示，该地区海勤女性人员的总体健康状况和情感职能等维度的得分均高于国内同性别同年龄段人群，其他维度得分差异无统计学意义，提示女性海勤人员具备良好的身体素质和心理素质，适应环境能力强。但是，男性海勤人员生理功能、生理职能、躯体疼痛、一般健康状况、社会功能、情感职能等维度得分均低于国内同年龄段同性别人员，提示由于特殊的生存环境，男性身体和心理可能受到了一定的影响，因此需加强海勤特殊工作环境下男性海勤人员身体健康和心理健康防护，提高男性海勤人员健康生命质量。

A549荷瘤鼠肺转移病灶，镜下HE染色可见：转移瘤组织呈腺癌样改变，呈巢样分布，部分可见癌巢内出血.与来源细胞系特征吻合.巢样分布的肺转移瘤在肺内和胸膜均分布不均且大小不均，肿瘤细胞胞浆丰富，大小不等，核有不规则的深染，可见多核细胞，层明显异型性，转移瘤边界不甚清楚，部分肺组织结构被破坏，肺泡结构消失（图7）.

  

图1 pGPU6/GFP/Neo-CD151-271部分测序结果图谱Fig.1 Sequencing map of pGPU6/GFP/Neo-CD151-271 recombinant plasmids

2.2 荧光定量PCR和检测细胞转染后CD151mRNA的表达

教学目标是教学活动的出发点和依据，也是教学达成的归宿。好的教学目标应该紧扣课程标准、教材内容、学情等因素进行综合性的考虑和设计，让学生“跳得起，够得着”，增强学习欲望，挖掘学习潜能，引导学生深度学习。同时，教学目标更要明确、具体、简约，不能含混笼统，模糊教学方向，造成教学目标难以达成，课堂成效将大打折扣。如《楞次定律》的教学设计中的过程与方法目标设计：培养学生总结、概括、抽象思维的能力，这一目标就显得空洞笼统，可以将此目标设计得更明确，如：通过实验体验，引导学生分析现象，寻找现象共性，归纳内在规律，培养学生的总结概括和思维能力。

2.3 Werstern Blot检测细胞转染后CD151蛋白的表达

其矩阵形式表达为对于式(10)，规定同时，当t∈(tk-1,tk]时，系统式 (3) 的误差系统矩阵形式可表达为⊗E0e(t)，其中

2.4 裸鼠一般情况

实验终点各组小鼠均存活，小鼠一般情况、活动及饮食等指标的观察无明显差别（图4）.

结果显示，A549细胞系中，pGPU6/GFP/Neo-CD151-450的干扰效果最理想（表2，图3）.

2.5 动物模型的观察及测量

定期观察裸小鼠的精神、饮食、排便、体重和活动等情况.在即刻取出的新鲜肺组织标本上，A549荷瘤鼠，无论在胸膜还是肺实质，可见白色点状肺转移病灶，肉眼较难分辨（图5）.经过Bouin's液浸泡24 h后的肺组织标本上，肺组织呈棕黄色，可清晰可见黑色点状肺转移病灶（图6）.

著名数学家波利亚指出，一个完整的解题步骤包括：弄清问题、拟订解题计划、实现解题计划和解题回顾四个环节.在解题回顾环节中，学生们可以对解题过程进行总结和反思，回顾每一个步骤的合理性和必要性，对比联想相关的解题思想，长期坚持下去，就有可能升华为解题策略([12])．对于懒于做题后回顾的同学，我们强制要求他们写“数学作文”，将自己的解题探究过程中遇到的挫折和后来的听课体会如实记叙下来.

Performance analysis of new intelligent door and window insulation performance testing machine

A549-shRNA、A549-shNC、A549-Blank各组裸鼠肺转移率及肺组织上的转移病灶数依次是：62.5%（5/8）与（4.7±1.5），100%（7/7）与（9.3±0.8），75%（6/8）与（8.2±1.5）.转移病灶率各组比较无意义.转移病灶数相比较，A549-shNC与A549-Blank比较差异无统计学意义（P=0.121），A549-shRNA 与 A549-shNC（P=0.000），A549-shRNA 与 A549-Blank（P=0.006）比较，差异有统计学意义.其他器官，如肝脏、肾脏等，均未发现肿瘤性病灶.

RT-PCR检测结果显示，转染pGPU6/GFP/Neo-CD151-271，450，728均能不同程度下调A549中CD151mRNA的表达（P＜0.05）.pGPU6/GFP/Neo-CD151-450的干扰效果最理想（表1，图2）.

  

图2 pGPU6/GFP/Neo-CD151-450转染A549细胞的普通显微镜和荧光显微镜同一视野下的照片（×200）Fig.2 Imagesofordinary microscope and fluorescence microscope afterA549 wastransfected with pGPU6/GFP/Neo-CD151-450 under the same vision（×200）

 

A:普通显微镜；B:荧光显微镜.

 

表1 实时荧光定量PCR检测A549细胞系CD151基因的干扰效果（±s）Tab.1 Relative expression of CD151 mRNA in A549 cell after transfection tested by qPCR（±s）

  

与Blank组比较，*P＜0.05.

 

A549 CD151 mRNA相对表量pGPU6/GFP/Neo-CD151-271 0.53±0.06*pGPU6/GFP/Neo-CD151-450 0.37±0.06*pGPU6/GFP/Neo-CD151-728 0.6±0.1*pGPU6/GFP/Neo-shNC 0.96±0.06*空白组 1

 

表2 Werstern Blot检测各组细胞CD151蛋白表达水平灰度值（±s）Tab.2 Gray value comparison of CD151 protein in cells detected by Werstern Blot（±s）

  

与Blank组比较，*P＜0.05.

 

项目 A549 pGPU6/GFP/Neo-CD151-271 0.50±0.05*pGPU6/GFP/Neo-CD151-450 0.45±0.05*pGPU6/GFP/Neo-CD151-728 0.64±0.06*pGPU6/GFP/Neo-shNC 0.91±0.02空白组 0.94±0.04

  

图3 Blank，pGPU6/GFP/Neo-CD151-271，450，728，shNC转染A549后，CD151蛋白的变化Fig.3 The expression of CD151 protein in A549 was measured by Werstern Blot after transfected by Blank，pGPU6/GFP/Neo -CD151 -271，450，728，shNC

  

图4 部分小鼠照片Fig.4 Photos of nude BALB/c-nude mice

  

图5 术后新鲜肺组织标本Fig.5 Lungs after surgery

 

A:A549-shRNA组；B:未见转移病灶的肺组织（箭头所指为转移灶）.

  

图6 Bouin's液浸泡24 h后肺组织标本Fig.6 Lungs soaked in Bouin's for 24 hours

 

A:A549-shRNA组；B.未见转移病灶的肺组织（箭头所指为转移灶）.

  

图7 肺组织标HE染色典型图片（×200）Fig.7 Representative HE staining pictures of lungs（×200）

 

A:A549-shRNA组；B:未见转移病灶的肺组织（箭头所指为转移灶）.

3 讨论

CD151是四跨膜蛋白TM4SF（Transmembrane 4 superfamily）成员之一，在人体全身多个组织、多个细胞中广泛表达，分布范围包括上皮细胞、内皮细胞、Schwann细胞、树突细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、雪旺氏细胞、巨核细胞、血小板等.TM4SF参与调控信号传导，细胞的激活、发展、增殖和运动、肿瘤侵袭与转移等多种生物学功能.研究证实，CD151在人类多种肿瘤细胞和组织中广泛表达，并参与肿瘤侵袭和转移过程，如信号传导、肿瘤细胞与细胞外基质的粘附，细胞外基质的降解，肿瘤血管新生等[5-8].本实验中，笔者构建了重组质粒提取并鉴定后，用脂质体转染A549，建立稳定转染的细胞株；利用尾静脉注射法建立人工肺转移的老鼠动物模型进一步研究CD151基因表达对裸鼠肺腺癌A549细胞肺转移的影响.

浸润和转移是肿瘤细胞最主要的生物学特性之一，也是临床治疗恶性肿瘤常常失败的重要原因之一.其中，肿瘤的转移是指肿瘤细胞通过血道、淋巴道等途径，在远离原发肿瘤部位的器官内形成继发肿瘤的过程[9].肿瘤转移是一个多阶段、多步骤、多因素、多基因相互作用的一系列连续的、相互关联的复杂过程.在细胞转换和生成的初期，如果肿块直径大于1 mm，就会出现血管化.这时由肿瘤和宿主细胞合成和分泌的一系列促血管生成因子协同抗血管生成因子的缺失，导致肿瘤所在的周围宿主组织产生微血管化.然后，随着一系列酶的表达，肿瘤突破宿主基质.待肿瘤细胞侵入淋巴管或血管，他们就能随着血循环种植.期间瘤栓必须逃逸机体免疫系统和非免疫系统的防范，最后在被转移器官局部停留并从循环系统中溢出至被转移器官实质细胞中继续增殖并最终建立一个微小转移灶[10].

由心电图结果发现，FHCM亲属中G+/P-组Ⅰ、aVR、aVF导联QRS时限及V1、V2导联R波振幅均显著大于对照组(G-/P-组)，差异有统计学意义(P<0.05)；V4～V6导联R波振幅均小于对照组(G-/P-组)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。T波改变(T波低平、T波倒置、T波双向)发生率在两组中差异有统计学意义(P<0.05)，左室肥厚、异常Q波、碎裂QRS波发生率两组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。两组的心率、PR间期、QRS电轴、QTc间期比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

综合有关D151基因研究的体内动物实验，CD151基因缺陷的老鼠，在基质胶栓（Natrigelplug）模型、角膜新生血管实验、肿瘤种植实验等体内外试验中均观察到病理性血管生成[10].CD151基因敲除的老鼠模型中，Takeda将黑色素瘤细胞B16F10和肺癌细胞Lewis通过尾静脉注射导入CD151基因敲除的裸鼠中，由于CD151基因的敲除导致肿瘤细胞-宿主内皮细胞间黏附功能和跨内皮迁移功能缺陷，从而明显降低了肺转移灶的形成[11].在CD151基因敲除小鼠前列腺癌动物模型上发现，CD151基因的敲除不影响原发肿瘤的生长、凋亡和血管形成，但肺转移病灶减少[12].

本研究利用尾静脉注射法建立人工肺转移的老鼠动物模型，一定程度体现了肿瘤细胞进入血液循环以后发生转移的步骤和环节.结果显示干扰组较阴性对照组和空白对照组，肺转移阳性率比较无差异，但肺转移病灶数目比较有差异，干扰组较阴性对照组和空白对照组肺转移病灶减少；阴性对照组和空白组之间无论肺转移阳性率比较还是病灶数均无差别，同Takeda等的研究结果类似[11].肺转移病灶数比较有差异而肺转移阳性率比较无差异，考虑是样本量偏小所致可能.通过本实验，说明干扰CD151表达能减少裸鼠体内肺癌肺转移.在其他器官，如肝脏、肾脏等，均未发现肿瘤性病灶.如果适当延长裸鼠饲养时间，可能在其他器官也有转移性病灶，这需要在后续工作中进一步完善.

本实验证实RNA干扰抑制CD151基因表达可能抑制肺腺癌A549细胞的肺转移，为肺腺癌提供可能的新的治疗靶点和思路.

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［2］SADEJ R，GRUDOWSKA A，TURCZYK L，et al.CD151 in cancer progression and metastasis:A complex scenario［J］.Lab Invest，2014，94（1）:41-51.

［3］李科，洪志鹏，李云霞，等.非小细胞肺癌组织CD151蛋白表达临床意义探讨［J］.中华肿瘤防治杂志，2014，22（01）:34-38.

［4］李科，洪志鹏，沈丽达，等.CD_（151）及整合素α_3β_1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义［J］.中国全科医学，2014，16（05）:531-535.

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［9］AZNAVOORIAN S，MURPHY A N，STETLERSTEVENSON W G，et al.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis ［J］.Cancer，1993，71（4）:1368-1383.

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