耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicilineresistant staphylococcus aureus，MRSA）是临床感染的重要致病菌，该菌对多种抗生素都具有耐药性，其重要原因之一是与细菌生物膜（bacterialbiofilm，BF）的形成密切相关[1].细菌生物膜（Bacterial biofilm）是指细菌附着于惰性物体如生物医学材料或机体粘膜表面后，分泌纤维蛋白、糖基质、糖蛋白等多糖蛋白复合物，使得细菌相互粘连并自身缠绕包裹其中形成的膜样物[2].生物膜内的细菌可以是一种，也可以是多种，这些细菌绝大多数处于代谢不活跃的状态即休眠菌，而休眠菌的生物学特征与浮游状态下的细菌存在显著差异，主要表现在环境的变化对细菌的影响大大降低，尤其是对抗生素的敏感性大大下降，因此，感染部位的细菌一旦形成生物膜极易产生耐药性.细菌生物膜的形成是一个动态的过程，共经历了粘附、聚集、分化、成熟、播散五个阶段[3]，这一特点容易导致感染反复发作并且难以控制，也使得传统的糖肽类抗生素（如万古霉素、替考拉宁等）对于MRSA临床感染的治疗逐年下降[4].近年来研究表明，天然药物单体与抗生素联合应用具有协同杀菌作用，并且可以逆转细菌对抗生素的耐药性[5-6].笔者前期研究发现桂皮醛对于MRSA生物膜有较强的破坏作用[7-8]，本次实验在此基础上将桂皮醛与万古霉素联合应用，来观察其体外抗MRSA生物膜的增效作用，以期为临床治疗MRSA生物膜导致的相关感染提供新的方案.

当被告人没有聘请辩护律师时，就不应该召开庭前会议，因为，庭前会议时控辩双方会对证据等问题发表意见，看是否持有异议，并且会确认争议的焦点。像这样专业的法律事项，在缺乏辩护人参与的情况下，庭前会议很难取得预期的效果，也不利于保护被告人的权利。当被告人聘请了辩护律师为其提供充分的法律援助，并且正确理解了在庭审前对证据不表示异议的法律后果和意义的情形下，才能适用庭前会议程序。在这种情况下才能真正做到既提高了诉讼效率又保障了被告人的权利。其次，因为考虑到基层法院案多人少的现实情况，对于那些当事人没有争议并适用简易程序审判的案件，通常无需召开庭前会议。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

5株临床分离的MRSA均来自苏州市立医院检验科，用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统对其鉴定.金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923购自国家微生物资源平台.

1.2 主要试剂与仪器

结晶紫溶液：结晶紫饱和液（结晶紫2 g溶于100 mL 95%乙醇）和10 g/L草酸铵溶液（草酸铵10 g加温溶解于1 L蒸馏水）按体积比1:4配置100 mL，混匀过滤后置棕色瓶中备用.桂皮醛（Sigma公司，纯度99%）；万古霉素（Sigma公司）；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB培养基）购自杭州天和微生物试剂有限公司；96孔细胞培养板（美国Coming／Coster公司）；全自动恒温震荡仪SHA—B（金坛市国华仪器厂）；Thermo自动酶联仪（美国Thermo公司）.

1.3 金黄色葡萄球菌生物膜模型建立

挑取金黄色葡萄球菌单个菌落于4mLTSB培养基中，37℃120 r/min培养24 h，用分光光度计调整菌液吸光度值OD600≈0.1，即0.5麦氏浊度单位，菌落数为（1-2）×108cfu/mL.实验前用TSB培养基稀释100倍，取100 μL加入96孔板中，再加入100 μL TSB培养基，以不加菌液孔作为空白对照，37℃恒温培养72 h，每24 h更换一次培养基.所有检测组均设3个复孔.

采用结晶紫半定量法，参照文献[9-10]进行.首先用96孔板建立金黄色葡萄球菌体外生物膜模型，参照1.3.待生物膜形成后，移去96孔板内的培养液，加入200 μL2%结晶紫溶液染色15 min，弃去染液并用PBS冲洗3次，将浮游菌洗去，待干后加入200 μL 95%乙醇溶解结晶紫，用酶标仪测定590 nm处吸光度（OD590 nm）值.以OD590 nm空白对照+3SD作为cut off值（ODC）.若实验组的OD590nm≤ODC，则成膜能力阴性；若实验组的OD590nm＞ODC，则成膜能力阳性.

1.4 金黄色葡萄球菌生物膜成膜能力检测

观察组-男、女占比各为28:22;年龄范围上限值86岁,下限值61岁,年龄平均值(73.56±1.66)岁。

1.5 桂皮醛与万古霉素单药及联用对强成膜菌株和标准菌株的MIC测定

实验结果显示：两种药物联用时对两株细菌的sMIC50（与阴性对照相比，抑制生物膜菌活性50%的药物浓度）和sMIC90（与阴性对照相比，抑制生物膜菌活性90%的药物浓度）较单用时均有所降低，其中MRSA16187在桂皮醛和万古霉素联用与单独用药后sMIC50相比差别有显著性（P＜0.05和P＜0.05），sMIC90相比差别有显著性（P＜0.05和P＜0.05）；ATCC25923在桂皮醛和万古霉素联用与单独用药后sMIC50相比差别有显著性（P＜0.05和P＜0.05），sMIC90相比差别有显著性（P＜0.05和P＜0.01），这说明桂皮醛可以增强万古霉素抗金黄色葡萄球菌生物膜的作用，可能与桂皮醛瓦解生物膜结构后抗生素直接作用于细菌，使其药效明显增强有关，见表2.

1.6 金黄色葡萄球菌生物膜抑制试验

金黄色葡萄球菌成膜能力5株MRSA临床菌株和1株标准菌株均可形成生物膜，其中编号为16187的临床菌株成膜能力最强（表1）.因此，本文将采用MRSA16187和ATCC25923两株菌进行后续研究.

 

1.7 统计学处理

3.1.1 穿刺静脉的选择 首选右侧锁骨下静脉，一是其比颈内静脉置管容易固定和护理，术后患者也比较舒适，但应避免在同一部位反复多次穿刺，以免造成局部血肿或纵隔血肿。左侧锁骨下静脉穿刺置管时还应注意避免误穿胸导管造成乳糜胸。患者需特殊体位或是穿刺困难时，也可以选择颈内静脉置管，但气管切开患者则不宜，因其可能形成血肿而压迫气管，且容易被痰液、分泌物所污染，不便于护理。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌成膜能力检测

取0.5麦氏浊度的金黄色葡萄球菌TSB菌悬液100 μL接种到96孔板中，37℃恒温培养24 h，用PBS清洗3次，采用微量棋盘稀释法进行联合抑菌实验（桂皮醛浓度为1 024 μg/mL到2 μg/mL，万古霉素浓度从64 μg/mL到0.125 μg/mL）.另设阴性对照孔（只加菌液不加药物）和空白对照孔（只加培养基），37℃恒温培养48 h，采用结晶紫染色法检测细菌生物膜的OD590值.生物膜抑制率计算公式为：

 

表1 5株MRSA临床菌株和1株标准菌株生物膜形成能力比较（±s）Tab.1 Comparison of biofilm formation ability of 5 MRSA clinical strains and 1 standard strain（±s）

  

菌株 吸光度值（590nm）MRSA16187 1.77±0.32 MRSA16223 1.32±0.75 MRSA16243 1.57±0.57 MRSA16034 1.12±0.94 MRSA16151 1.40±0.56 ATCC25923 1.46±0.85空白对照组 0.36±0.31

2.2 桂皮醛与万古霉素单药及联用对MRSA16187和ATCC25923的MIC单药

桂皮醛对MRSA16187和ATCC25923的MIC为 128 μg/mL 和 256 μg/mL，万古霉素为 0.5 μg/mL和1 μg/mL；2药联用：对MRSA16187的MIC桂皮醛和万古霉素浓度分别为16 μg/mL和0.03 μg/m，对 ATCC25923 的 MIC为 16 μg/mL和 0.06 μg/mL.从结果可以看出两药联用时桂皮醛和万古霉素对两株菌的MIC值均有所下降，并通过计算抑菌浓度指数（FIC）发现2种药物有协同抑菌作用.

 

判断标准：FIC≤0.5协同作用；0.5＜FIC＜1相加作用；I＜FIC≤2无关作用；FIC＞2拮抗作用.

2.3 桂皮醛与万古霉素单药及联用对MRSA16187和ATCC25923最低抑膜浓度（sMIC）的测定结果

采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定最低抑菌浓度（minimnm inhibitory concentration，MIC）.于96孔板中加入100 μL用0.5%葡萄糖的TSB培养基培养至对数期的菌悬液（约106 cfu/ml），再加入10 μL不同浓度的药液，2种药液浓度分别为桂皮醛（1024 μg/mL，512 μg/mL，256 μg/mL，128 μg/mL，64 μg/mL，32 μg/mL，16 μg/mL，8 μg/mL，4 μg/mL，2 μg/mL）； 万 古 霉 素（64 μg/mL，32 μg/mL，16 μg/mL，8 μg/mL，4 μg/mL，2 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25 μg/mL，0.125 μg/mL）37℃培养24 h后，于各孔中加入20 μL 0.2%的TTC，避光培养4 h，观察每孔颜色变化，以不加药物组为空白对照.MIC为没有红色还原物甲臢产生的最低药物浓度.

采用SPSS软件进行分析.所有实验组均设3个复孔取平均值，以均值±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验.P＜0.05为差异有统计学意义.

 

表2 桂皮醛和万古霉素单药及联用对两株菌的最低抑膜浓度（sMIC）（μg/mL）Tab.2The minimum inhibitory concentration(sMIC)of cinnamaldehyde and vancomycin on two bacteria strains（μg/mL）

  

与桂皮醛+万古霉素比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

 

药物ATCC25923 sMIC50 sMIC50 sMIC90桂皮醛 512* ＞1 024* 512* 1 024*万古霉素 4* 16* 4* 32**桂皮醛+万古霉素 128+1 512+4 128+1 256+2 MRSA16187 sMIC90

3 讨论

MRSA是引起医院和社区感染的重要致病菌.自从1961年英国学者Jevons首次发现MRSA至今，其检出率不断上升，治疗棘手，死亡率高，并且呈现出多重耐药及泛耐药的趋势，而细菌生物膜的产生是导致MRSA耐药的主要原因.细菌生物膜（Bacterial biofilm）是指附着于惰性物体如生物医学材料或机体粘膜表面后，分泌纤维蛋白、糖基质、糖蛋白等多糖蛋白复合物，使得细菌相互粘连并自身缠绕包裹其中形成的膜样物[12].由于生物膜内细菌多数处于休眠状态使其对抗生素的敏感性大大降低，因此，感染部位的细菌一旦形成生物膜极易产生耐药性，并且导致感染反复发作，难以控制.

创业工作坊模式的前提是成立创业团队，然后以工作坊的形式完成课内课外的学习。在每个项目的教学中，教师会根据工作过程、岗位技能需求，将理论与实践技能融合到每一个任务中。下面以“市场调研”模块为例，表述完整项目教学流程。

目前，临床上将糖肽类抗生素（如万古霉素、替考拉宁等）作为治疗MRSA感染最有效的药物.但随着万古霉素耐药菌株的出现，选择新型有效的药物来清除生物膜才能为临床解决MRSA耐药找到出路.笔者通过查阅文献发现了一种植物来源的单体成分——桂皮醛，并对其进行了抗菌、抗生物膜实验的相关研究，结果发现桂皮醛在体外可以通过破坏生物膜基质使其结构瓦解来有效清除MRSA形成的生物膜[13-17].

鉴于长期使用抗生素具有一定的毒副作用，并且会加速耐药菌株的出现，所以我们本次实验尝试使用桂皮醛与万古霉素联合用药，发挥中西医结合优势互补的作用来治疗MRSA生物膜.实验结果表明：桂皮醛与万古霉素有很好的协同杀菌功效，两药联用后万古霉素的MIC和sMIC均较单药作用时大大降低，这可能与桂皮醛破坏MRSA生物膜结构后万古霉素可以直接作用于细菌有关.由于本次实验只进行了体外抗生物膜的研究，这与体内环境有一定差异，还有待建立动物模型来确定疗效.同时有关桂皮醛与其他抗生素联用效果如何以及桂皮醛抗MRSA生物膜的分子机制还有待进一步研究.

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