在中国，肺癌是一种最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率逐年升高[1]。流行病学研究发现，在我国每年肺癌死亡病例约占全部恶性肿瘤死亡病例的四分之一[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占全部肺癌的85%[3]，并且在我国大部分NSCLC病例发现时已是中晚期，其5年生存率仅为17%[4]。因此，如何提高NSCLC的早期诊断、发现评估预后的新指标和靶向治疗的新靶点成为当前NSCLC研究的热点领域。已有研究发现，肿瘤组织普遍存在缺氧微环境，其中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)在多种恶性肿瘤中高表达[5]。最新的证据表明，上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是胚胎期正常发育过程，与肿瘤的进展和治疗的抵抗密切相关[6]。 EMT是上皮细胞失去细胞黏附和细胞极性，获得间充质表型，降低E-钙黏蛋白等上皮细胞标志物表达，增加波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白等间充质细胞标志物表达的可逆过程，从而表达较强的侵袭能力，最终引起肿瘤的转移。Vimentin是EMT的一种重要标志物，与肿瘤侵袭转移密切相关。本研究采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase,SP法)检测HIF-1α和Vimentin在60例NSCLC组织和20例癌旁组织中的表达情况及其与临床病理参数之间的关系，探讨二者在NSCLC发生发展中的作用，旨在为临床诊断、治疗NSCLC和预后评估提供实验依据。

1 资 料 与 方 法

1.1 一般资料 收集2010年1月—2015年12月河北省人民医院肿瘤科和胸外科经病理学确诊为NSCLC的蜡块标本60例，男性34例，女性26例；年龄39～85岁，中位年龄62岁。同时选择同期20例癌旁正常组织(距肿瘤组织切缘>5 cm)作为对照组，男性11例 ，女性9例，年龄38～85岁，中位年龄61岁。2组性别、年龄差异无统计学意义，具有可比性。

研究方案获得患者或其家属知情同意。

席间，阿甘拘谨少话，而张盈盈则多话热情甘愿为阿甘献着殷勤，一副恋爱中女人的忘我状态。蒲琳一句话也没说，不平不甘不解占据了她的思维。

1.2 主要试剂 兔抗人HIF-1α单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人Vimentin单克隆抗体购自美国Abcam公司，SP检测试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

经验定性法是根据区域的地貌特征、气候差异特点、水资源分布状况等客观存在的区域表现，主要考虑的是自然因素，常用来进行高级分区。本研究在用该方法时，主要考虑上述干旱分区指标体系中的地貌、降雨量和受灾率等3个自然因素，同时兼顾流域内干旱指数的因素，由于海拔较高的山区和丘陵区蓄水能力较弱，降雨量可能不能准确地反映当地的干旱程度，因此在这些地区以受灾率指标为主，降雨量指标为辅，而在海拔较低的丘陵和平原地区则以降雨量因素为主，受灾率指标为辅助指标，最后完成区域的一级干旱分区。

2.1 NSCLC组织及癌旁正常组织中HIF-1α、Vimentin的表达 HIF-1α蛋白阳性表达主要位于细胞核，胞核染成棕黄色颗粒；Vimentin蛋白阳性表达主要位于细胞质，胞质呈现棕黄色颗粒。HIF-1α在NSCLC组织(图1)和癌旁正常组织(图2)中的阳性表达率分别为80.0%(48/60)和5.0%(1/20)，二者差异有统计学意义。Vimentin在NSCLC组织(图3)和癌旁正常组织(图4)中的阳性表达率分别为66.7%(40/60)和10.0%(2/20)，二者差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2000年上海市水务局成立以来，水务信息化在整合原有水利、供水、排水三大行业信息资源的基础上，开始了支撑综合管理应用的水务公共信息平台建设，通过数据汇聚整合、共享交换、规范流程，实现支撑电子政务、防汛指挥、水资源管理等多任务应用。2005年开始，上海市作为水利部“城市水资源实时监控与管理系统”试点城市之一，开始在水务公共信息平台的基础上建设 “上海市水资源实时监控与管理信息系统”。系统初步实现了已有水资源管理信息的汇聚及整合，并基于网络地理信息系统对水资源信息进行综合发布和统计分析。

电压暂降的严重程度主要由以下条件制约：各网络节点和故障点的远近、各种变压器组的事故发生位置、连接方式、故障点周围有无电源、整个线路的阻抗情况、电压暂降前后故障点的电压情况、断路器通断的快慢、保险丝的熔断时间长短、各变压器组的失效率，还有系统规定的自动重合闸的重置次数等。

1.5 统计学方法 应用SPSS 21.0软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

1.3 免疫组织化学染色 所有组织标本经4%甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片。将蜡块标本切片常规脱蜡至水，抗原修复，3%H2O2室温孵育15 min去内源性氧化酶，滴加一抗HIF-1α(1∶300稀释，Abcam公司)、Vimentin(1∶200稀释，Abcam公司)，置于试剂盒中4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加聚合酶辅助剂，37 ℃孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加DAB试剂显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗终止反应，常规脱水，中性树胶封片，镜下观察。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

  

图1 NSCLC组织HIF-1α阳性表达(SP ×100)Figure 1 NSCLC positive expression of HIF-1α(SP ×100)

图2 癌旁正常组织HIF-1α阳性表达(SP ×100)Figure 2 Positive expression of HIF-1α in adjacent normal tissues (SP ×100)

图3 NSCLC组织Vimentin阳性表达(SP ×100)Figure 3 Vimentin positive expression in NSCLC tissue (SP ×100)

图4 癌旁正常组织Vimentin阳性表达(SP ×100)Figure 4 Vimentin positive expression in adjacent normal tissues(SP ×100)

 

表1 HIF-1α和Vimentin在NSCLC组织及癌旁正常组织中的表达Table 1 Expression of HIF-1α and Vimentin in NSCLCtissues and adjacent normal tissues (例数，%)

  

组别例数HIF-1α表达阳性阴性Vimentin表达阳性阴性NSCLC组织 6048(80.0)12(20.0)40(66.7)20(33.3)癌旁正常组织201(5.0)19(95.0)2(10.0)18(90.0)χ235.55019.315P0.0000.000

2.3 NSCLC组织中HIF-1α与Vimentin表达的相关性 免疫组织化学结果显示，60例NSCLC患者组织中HIF-1α与Vimentin表达均阳性的表达率为60.0%(36/60)；Spearman等级相关分析显示，HIF-1α与Vimentin表达呈正相关(rs=0.354，P=0.006)，表明HIF-1α的表达与EMT的发生密切相关。见表3。

 

表2 NSCLC患者不同病理参数HIF-1α与Vimentin表达阳性率比较Table 2 The positive rates of HIF-1α and Vimentin in different pathological parameters of NSCLC patients were compared (例数，%)

  

病理参数例数HIF-1α表达阳性阴性χ2PVimentin表达阳性阴性χ2P性别 男性 女性342627(79.4)21(80.8)7(20.6)5(19.2)0.0170.89623(67.6)17(65.4)11(32.4)9(34.6)0.0340.854 年龄 ≤60岁 >60岁283222(78.6)26(81.3)6(21.4)6(18.7)0.0670.09616(57.1)24(75.0)12(42.9)8(25.0)2.1430.143 分化程度 高中分化 低未分化352532(91.4)16(64.0)3(8.6) 9(36.0)6.8570.00927(77.1)14(56.0)8(22.9)11(44.0)3.0130.083 TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期 Ⅲ+Ⅳ期293119(65.5)29(93.5)10(34.5) 2(6.5) 7.3580.00715(51.7)25(80.6)14(48.3)6(19.4)5.6400.018 淋巴结转移 有 无421835(83.3)13(72.2)7(16.7)5(27.8)0.9720.32437(88.1) 3(16.7)5(11.9)15(83.3)28.9290.000

2.2 NSCLC组织中不同病理参数HIF-1α、Vimentin表达 不同性别、年龄、是否有淋巴结转移者之间HIF-1α表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；高中分化者较低未分化者、TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期者较Ⅰ+Ⅱ期者HIF-1α表达阳性率高，差异有统计学意义(P<0.05)。不同性别、年龄、分化程度者之间Vimentin蛋白表达阳性率差异无统计学意义；TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期者较Ⅰ+Ⅱ期者、有淋巴结转移者较无淋巴结转移者Vimentin表达阳性率高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

 

表3 NSCLC组织中HIF-1α与Vimentin蛋白表达的相关性Table 3 Correlation between expression ofHIF-1α and Vimentin in NSCLC tissues (例数)

  

VimentinHIF-1α+-rsP+-3612480.3540.006

3 讨 论

缺氧是实体肿瘤的重要特征，其中缺氧微环境在肿瘤发生发展和侵袭转移中发挥着重要作用。HIF-1是调节细胞对缺氧反应的主要转录因子，是由α和β 2个亚基构成的异源二聚体，其中HIF-1α是肿瘤适应缺氧的核心蛋白[9]。在常氧情况下HIF-1α被泛素化而不表达，HIF-1α在低氧条件下高表达，被认为是肿瘤诊断和复发的预测指标，故HIF-1α是监测肿瘤侵袭和转移的重要标志[10]。本研究结果显示，NSCLC组织中HIF-1α阳性表达率80.0%，显著高于癌旁正常组织阳性表达率5.0%，差异有统计学意义(P<0.05)。Badowska-Kozakiewicz等[11]在研究多药耐药蛋白P糖蛋白(P-gp)与缺氧标志物(HIF-1α)在浸润性乳腺癌转移淋巴结中的表达，通过从58例患有淋巴结转移的浸润性乳腺癌诊断的患者收集组织样品，采用免疫组织化学方法检测P-gp和HIF-1α的表达，结果发现HIF-1α的表达与浸润性乳腺癌伴有淋巴结转移的P-gp表达显著相关，提示HIF-1α可能与多药耐药有关。Isobe等[12]研究发现，HIF-1α的表达与组织学分级、浸润深度、血管内皮生长因子和微血管密度密切相关，Cox多因素分析显示HIF-1α过表达的胃癌患者预后差。Ttrai等[13]研究发现，肿瘤缺氧促进新生血管生成并有助于癌细胞的放疗和化疗的抵抗，缺氧促进肿瘤细胞迁移，HIF-1α的低表达可以降低肿瘤细胞增殖和转移能力。本研究结果显示，高中分化者较低未分化者、Ⅲ+Ⅳ期者较Ⅰ+Ⅱ期者HIF-1α表达阳性率高，而与性别、年龄和淋巴结转移情况无关。与吴友亮等[7]报道相一致。

1.4 免疫组织化学结果判定 染色后切片结果由2位病理科医师采用双盲法进行读片并判定结果。HIF-1α阳性表达主要定位于细胞核染成棕黄色颗粒，按染色强度计分[7]：细胞无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；按阳性细胞数百分比评分：阳性细胞数无着色为0分，≤25%细胞着色为1分，26%～74%细胞着色为2分，≥75%细胞着色为3分。2项积分之和≤2分为阴性，>2分为阳性。Vimentin阳性表达于细胞质染成棕黄色颗粒，判定标准[8]：随机计数4个高倍视野，>10%的细胞胞质着色出现棕黄色判定为阳性，≤10%则为阴性。

EMT是指上皮细胞向间质细胞转变从而形成间充质细胞的过程，是胚胎时期一个正常的发育过程，在其发生中往往有上皮细胞标志E-cadherin的下调和间质标志物Vimentin的上调[14]。研究发现，Vimentin的阳性表达与多种实体肿瘤(如肝癌等)预后不良有关[15]。有学者在宫颈癌研究中发现，Vimentin的蛋白表达水平与年龄、淋巴结转移、淋巴管浸润有关，多因素分析也提示Vimentin是宫颈癌患者生存的独立预后危险因素[16]。Shirahata等[17]在研究结直肠癌患者血清中Vimentin的甲基化可行性检测，通过采用定量甲基化特异性聚合酶链反应测定242例结直肠癌患者血清DNA中的甲基化，结果发现0、Ⅰ、Ⅱ期患者Vimentin甲基化阳性率显着高于癌胚抗原和CA19-9。因此，血清Vimentin甲基化可以作为结直肠癌的潜在标志物。Zhang等[18]在研究四氢姜黄素通过靶向HIF-1α和自噬抑制人骨肉瘤诱导EMT并抑制血管生成时发现，HIF-1α在四氢姜黄素的抗转移作用中起关键作用；主要通过抑制Akt/mTOR和p38MAPK途径，四氢姜黄素下调HIF-1α的表达；此外，四氢姜黄素在低氧条件下对HIF-1α表达和血管生成显示出显着的抑制作用；四氢姜黄素激活自噬并诱导EMT，并以HIF-1α相关方式抑制血管生成。本研究结果显示，Vimentin在NSCLC组织中的阳性表达率为66.7%，显著高于癌旁正常组织，并且Vimentin蛋白的阳性表达与TNM分期和淋巴结转移有关。说明Vimentin在NSCLC进展中扮演着重要角色，Vimentin表达越高，肿瘤细胞增殖越快，肿瘤分期越晚，越易发生肿瘤侵袭转移。

本研究还初步探索了HIF-1α与Vimentin二者在NSCLC表达的相关性，结果发现HIF-1α与Vimentin二者呈正相关(r=0.354，P=0.006)。原因可能是因为肿瘤发生过程中导致局部缺氧引起HIF-1α高表达，进而上调Vimentin的表达，导致EMT的发生，最终引起肿瘤的进展、侵袭和转移。本研究通过联合检测HIF-1α与Vimentin在NSCLC表达情况，可结果发现HIF-1α与Vimentin均过表达的患者预后最差。因此，联合检测比单独检测更能预测患者的预后情况，可为判断NSCLC的预后提供新的参考依据。

当前，肿瘤研究的热点领域是精准化治疗和靶向治疗。HIF-1α与Vimentin在NSCLC中高表达，并且在NSCLC进展中发挥重要作用，二者联合检测有助于判断患者的预后，为NSCLC的精准化治疗提供理论依据。

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