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维生素D受体基因ApaI、FokI、TaqI、Tru9I位点单核苷酸多态性与桥本氏甲状腺炎的相关性

更新时间:2009-03-28

桥本氏甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis,HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis)[1],是常见的自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD),起病隐匿,进展缓慢,患病率高[2].HT的发生机制未完全阐明,目前国内外关于维生素D及其受体(vitamin D receptor,VDR)基因多态性与AITD关系的研究方兴未艾,研究结论尚未统一.本课题将对本地区(东经 102°54'至 103°25',北纬 23°01'至 23°36')HT患者的25羟维生素D[25-hydroxy-vitamin D,25(OH)D]水平及 VDR ApaI、FokI、TaqI、Tru9I基因多态性与HT的关系进行研究.

据统计,按照郝哲相关技术标准种植的日光温室、塑料大棚和防雨棚枣园,平均亩产分别可达到1320公斤、1210公斤和1130公斤,亩产值分别达到4-6万元、2-3万元和1-2万元,为破解当前困扰榆林红枣产业发展的瓶颈问题探索了出路,创新了榆林红枣种植模式,实现了红枣由山地向沙地延伸、由露天生产向设施栽培的转变,培育了新的农业经济增长点,带动项目区贫困农民脱贫致富。沙地鲜食枣相关项目成果还荣获全国首届沙产业大赛优秀成果奖、陕西省科学技术奖二等奖、陕西省林业科技进步奖一等奖。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究对象选取2014年10月至2017年6月在昆明医科大学第五附属医院内分泌科门诊就诊或住院的临床资料齐全、来自个旧地区新诊断、未治疗的HT患者139例(HT组),汉族,男17例,女122例,年龄 20~84岁,平均(45.04±13.28)岁,彼此间无亲缘关系.正常对照选用同期在我院体检中心体检的个旧地区无血缘关系的健康成年人(NT组)66例,汉族,男13例,女53例,年龄18~79岁,平均(40.47±12.91)岁.本研究通过医院伦理委员会批准并签署知情同意书.

1.2 诊断标准

根据1998年《中国甲状腺防治指南》诊断标准[1]诊断HT:(1)弥漫性甲状腺肿大,质地较韧,特别是伴峡部锥体叶肿大;(2)血清TPO-Ab和TG-Ab阳性;(3)甲状腺细针穿刺提示甲状腺浆细胞和淋巴细胞浸润、纤维化;(4)伴临床甲减或亚甲减.其中(1)、(2)为诊断必须,(3)、(4)可进一步支持诊断.维生素D不足或缺乏诊断参考文献[3]:血清25(OH)D)≥30 ng/mL为充足,≥20 ng/mL但<30 ng/mL为不足,≥10 ng/mL但<20 ng/mL为缺乏.排除标准:(1)发热、妊娠及哺乳期妇女;(2)心、肝、肾功能严重障碍者;(3)合并其他内分泌疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病及全身疾病者;(4)甲状腺癌、单纯性甲状腺肿及其它原因引起的甲状腺功能异常者.取同期在我院体检中心体检,且生化及甲状腺功能正常者作为对照组.

1.3 资料采集

收集研究对象的性别、年龄,采集研究对象的EDTA抗凝血浆,并采用全自动免疫化学发光分析仪(意大利索灵诊断医疗设备集团公司,Diasorin S.p.a)及其配套试剂测定血清25(OH)D及总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3),总甲状腺素(TT4)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺微粒体抗体(TM-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)水平等.正常参考值 : TT3 46.30~220.0 ng/dL,TT4 4.5~13.6 μg/dL,FT3 2.2~4.2 pg/mL,FT4 0.80~1.78 ng/dL,TSH 0.3~3.6 mIU/L,TPO-Ab 1.0~16.0 IU/mL,TG-Ab 5.0~100.0 IU/mL,TM-Ab 1.0~16.0 IU/mL.

1.4 研究方法

VDR基因位于12号染色体长臂(12q13),全长约100kb,共9个外显子和8个内含子[14],其SNP可能是通过干扰VDR基因mRNA选择性剪接或表达来影响VDR蛋白和相对应的靶基因反式作用,诱发生物效应,造成空间结构的变化[15].

转化生长因子 β(transforming growth factor β,TGF-β)是细胞生长抑制因子,可促进细胞外基质形成,促进新生血管形成[2],调节细胞增殖与分化,在肿瘤的发生发展中起重要作用。TGF-β1是一种分子质量为25KD的多肽,是TGF-β在人体内的主要存在形式。我们从病理学的角度,对TGF-β1进行检测分析,探讨TGF-β1在卵巢浆液性腺癌中的表达及其临床意义,为卵巢癌临床诊断及治疗提供重要参考价值。

1.5 统计学处理

资料用IBMSPSS软件包进行统计学分析。正态分布的计量资料以(±s)表示,两组间比较用两独立样本t检验;偏态分布的计量资料以中位数M(P25,P75)表示,组间比较采用非参数检验。计数资料用n(%)描述,率的比较采用卡方检验;等级资料用秩和检验.应用多因素Logistic回归分析HT发生的影响因素.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 检测到的3种基因型

VDRApaI位点有2个等位基因C和A,检测到3种基因型CC,CA,AA,VDR FokI有2个等位基因T和C,检测到3种基因型TT、CC、TC,、VDR TaqI有2个等位基因G和A,检测到3种基因型 GG,GA,AA,VDR Tru9I有2个等位基因G和A,检测到3种基因型GG,GA,AA,见图1~图4.

  

图1 VDR基因ApaI位点单核苷酸多态性分型结果Fig.1 The classification of VDR gene ApaI SNP

  

图2 VDR基因FokI位点单核苷酸多态性分型结果Fig.2 The classification of VDR gene FokI SNP

  

图3 VDR基因TaqI位点单核苷酸多态性分型结果Fig.3 The classification of VDR gene TaqI SNP

  

图4 VDR基因Tru9I位点单核苷酸多态性分型结果Fig.4 The classification of VDR gene Tru9I SNP

2.2 2组临床资料的比较

205例研究对象 25(OH)D水平为(18.45±7.60)ng/mL,其中25(OH)D充足、不足和缺乏的比例分别为 6.83%(14/205)、28.78%(59/205)、64.39%(132/205).2组间25(OH)D充足的比例比较差异均无统计学意义(P=0.764),NT组25(OH)D不足的比例高于HT组(P=0.003),HT组25(OH)D缺乏的比例高于NT组(P=0.008),见表2.

 

表1 2组间临床资料的比较(±s)(1)Tab.1 The comparison of clinical characteristics between two groups(±s)(1)

  

与NT组比较,*P<0.05.

 

组别 n 66 13 9 FT4(ng/dL)NT组HT组男年龄(岁)25(OH)D(ng/mL)TT3(ng/dL)TT4(μg/dL)FT3(pg/mL)13 17性别(n)女53 122 40.47±12.91 20.13±6.65 104.22±26.99 7.93±1.97 2.82±0.36 1.18±0.18 45.04±13.28* 17.66±7.91* 105.58±36.49 7.41±3.07 2.69±0.68 1.02±0.39

2.3 2组25(OH)D状况比较

HT组的年龄、PTH、TSH、TPO-Ab、TG-Ab、TM-Ab高于 NT组,25(OH)D(P=0.029)、FT4(P=0.002)低于NT组,性别、TT3、TT4、FT3、FT42组间差异无统计学意义(P>0.05),见表1.

坚持早中晚三巡塘制度,尤其是台风、暴雨、连续阴雨等极端天气,更应全天候坚持巡塘,观察鱼池水质变化及鱼的活动情况,发现问题及时采取处置措施。通常采用的鱼病防治方法有泼洒法、悬挂法和内服法。坚持定期泼洒药物,按时挂篓挂袋,间隔投喂药饵,防治结合,严格管控,坚决杜绝病害发生。一般每间隔15~20d,全池泼洒氯制剂一次,鱼病高发时期每间隔15d用出血宁、五黄粉等药物拌饵或制成药饵投喂,用量一般为投饵量的0.5%左右。同时打扫好池塘卫生,及时清除残饵及池中杂物,渔具使用后应放在阳光下曝晒,并药浴消毒,保持池塘环境卫生,消除治病因子。

 

表1 2组间临床资料的比较(±s)(2)Tab.1 The comparison of clinical characteristics between two groups(±s)(2)

  

与NT组比较,*P<0.05.

 

组别NT组HT组n 66 139 PTH(pg/mL)TSH(mIU/L)TPO-Ab(IU/mL) TG-Ab/(IU/mL) TM-Ab(IU/mL)58.67±31.28 1.92(1.41,2.66)3.53(1.90,7.47)13.33(10.05,24.76)3.65(2.00,7.54)73.33±36.55* 5.12(2.44,15.10)* 273.3(33.68,1638.68)* 315.2(78.83,1152.1)* 273.5(33.4,1638.5)*

2.4 2组人群VDR各等位基因及基因型的频率

在整体、NT组、HT组人群中分别VDR ApaI、FokI、Tru9I位点各基因型亚组25(OH)D水平进行比较未发现统计学差异(P>0.05).以是否发生HT为因变量,年龄、性别、25(OH)D、VDR ApaI、FokI、Tru9I位点等位基因作为协变量,采用二分类Logistic回归分析结果提示,25(OH)D缺乏(OR=1.429,P=0.033)可能为HT的危险因素,ApaI-A等位基因进入回归方程,但未显示有统计学意义(OR=1.836,P=0.051),见表4.

 

表2 2组25(OH)D状况比较[n(%)]Tab.2 The comparison of 25(OH)D level between two groups[n(%)]

  

组别 n NT组 66 HT组 139 χ2 P充足 不足 缺乏4(6.06)28(42.42)34(51.52)10(7.19)31(22.30)98(70.51)0.090 8.84 7.037 0.764 0.003 0.008

2.5 VDR ApaI、VDR FokI、VDR Tru9I位点多态性与HT的关系

对研究样本的VDR各等位基因及基因型进行哈迪温伯格平衡检验,VDR ApaI、VDR FokI、VDR Tru9I位点基因型分布符合哈迪温伯格平衡(P>0.05),VDR TaqI位点基因型分布不符合哈迪温伯格平衡(P<0.001),故未将该位点数据纳入进一步研究.研究对象中VDR ApaI CC、AC、AA基因型分布频率分别为51%、40%及9%,C、A等位基因分布频率分别为71%及29%.VDR FokI CC、TC、TT基因型分布频率分别为28%、50%及22%,C、T等位基因分布频率分别为47%及53%.VDR Tru9I位点GG、GA、AA基因型分布频率分别为61%、33%及6%,G、A等位基因分布频率分别为 77%及 23%.VDR ApaI、FokI、Tru9I位点各等位基因及基因型分布频率在2组间均不存在统计学差异(P>0.05),见表3.

 

表3 2组VDR各等位基因及基因型的频率分布[n(%)]Tab.3 Comparison of the distribution of VDR genotype and allele frequency between two groups[n(%)]

  

SNP位点 基因型 Total组 NT组 HT组 χ2 P ApaI 基因型 CC 105(51)28(42)77(56)0.909 0.360 AC 82(40)33(50)49(35)AA 18(09)5(08)13(09)等位基因 C 292(71)89(67)203(73)0.688 0.406 A 118(29)43(33)75(27)FokI 基因型 CC 58(28)19(29)39(28)0.544 0.586 TC 102(50)35(53)67(48)TT 45(22)12(18)33(24)等位基因 T 192(47)59(45)133(48)0.183 0.669 C 218(53)73(55)145(52)Tru9I基因型 GG 124(61)37(56)87(63)0.421 0.674 GA 68(33)26(39)42(30)AA 13(06)3(15)10(07)等位基因 G 316(77)100(76)216(78)0.097 0.755 94(23)32(24)62(22)

 

表4 HT发生危险因素的Logistic回归分析Tab.4 The analysis of Logistic regression related to HT occurrence

  

注:*表示P<0.05.

 

自变量 B S.E.Wals df P OR 95%CI下限 上限常量 -1.453 0.692 4.416 1 0.036* 0.234 25(OH)D缺乏 0.357 0.168 4.522 1 0.033* 1.429 1.028 1.985 ApaI-A等位基因 0.607 0.311 3.805 1 0.051 1.836 0.997 3.379

3 讨论

1,25-二羟维生素D3属于类固醇类激素超家族.VDR包括一类功能多样的甲状腺激素/维甲酸核受体家族成员及细胞膜受体.研究发现VDR的表达十分广泛,除表达于小肠、肾和骨细胞这些常见的组织细胞外,还表达于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、T/B淋巴细胞及甲状腺细胞[6].参与多种细胞的增殖、分化、凋亡、免疫反应及代谢等[7-8].其参与固有及适应性免疫过程呈非常复杂的网络状结构,通过调节相关细胞因子可抑制Th1/Th17细胞、树突细胞等的成熟分化,促进Th2及相关调节性T细胞的优势表达.通过以上淋巴细胞参与自身免疫炎症形成[9-10].同时,维生素D亦通过抑制B淋巴细胞增殖、诱导B淋巴细胞凋亡对自身抗体的产生发挥一定调节作用[11].另外,活性维生素D可通过降低甲状腺细胞凋亡而对AITD产生治疗作用.这种作用已在动物模型和体外实验得到证实[12-13].

中国骨转换生化指标研究 (Chinese BoneTurn-over Marker Study,CBTMS)纳入我国北京、上海、武汉、广州、重庆五大城市健康居民1436人,结果表明57.0%和31.3%的受试者分别存在维生素D缺乏或不足,仅11.7%受试者维生素D充足[4].通过对个旧地区205例研究对象进行调查发现,其25(OH)D水平仅为(18.45±7.60)ng/mL,其中25(OH)D充足、不足和缺乏的比例分别为6.83%(14/205)、28.78%(59/205)、64.39%(132/205),HT组25(OH)D水平[(17.66±7.91)ng/mL]较NT组[(20.13±6.65)ng/mL]低,虽然NT组(42.42%)25(OH)D不足的比例高于HT组(22.30%,P=0.003),但HT组 (70.51%)25(OH)D缺乏的比例高于NT组(51.52%,P=0.008),提示本地区人群普遍存在25(OH)D不足或缺乏,25(OH)D缺乏可能与HT发生有关,与美国研究[5]结果类似.

1.4.1 血样DNA提取 所有入选对象取外周空腹静脉血2 mL分别置于乙二胺四乙酸钠(EDTA)抗凝管,2 000 r/min离心5 min,将沉淀的血细胞暂时贮存于-20℃的冰箱中冷冻.按DNA提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)说明提取血细胞DNA.

1.4.2 VDR基因多态性的检测 选取的位点在NCBI SNP库中的编号为ApaI(rs7975232)、TaqI( rs731236)、 FokI( 2228570))Tru9I(rs757343).采用TaqMan荧光探针技术检测以上2位点SNP.引物和Taqman SNP assay及Premix Ex TaqTM(Probe q PCR)试剂均购自美国ABI公司,在ABI7500实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪上检测.反应完成后,读取样品孔中的终点荧光,利用分析软件确定各个样本的基因分型结果.

ApaI位点位于第8和第9外显子之间的第8内含子内,其SNP多态性与VDRmRNA转录稳定性相关,可能影响下游VDR蛋白的翻译与修饰.本地区人群VDR基因ApaI位点CC、CA、AA基因型频率分别0.51、0.40、0.09,等位基因C和A频率分别为0.71、0.29,其SNP在NT组及HT组间分布无统计学差异(P>0.05),与J.Diurovic等在塞尔维亚人群中的研究[16]结果类似.

FokI位点位于VDR基因的5'端第2外显子的起始区,不与基因的3'端多态性不平衡连锁[8],是VDR基因上唯一能够影响蛋白肽链结构的功能性位点[9],被视为VDR基因的独立标志[17].FokI一旦发生T(ATG)→C(ACG)突变,可导致第1个起始密码子ATG缺失,VDR基因转录只能从下游的第2个ATG开始,结果引起翻译产生的VDR蛋白氨基端少了3个氨基酸.这种肽链缩短的蛋白与基础转录因子IIb的亲和力较高,因此调节靶基因转录的能力增强[17].本地区人群中VDR基因FokI位点CC、TC、TT基因型频率分别为0.28、0.50、0.22,等位基因T和C频率分别为0.47和0.53,其SNP在NT组及HT组间分布无统计学差异(P>0.05),与上海研究结果[18]类似,与日本研究结果[19]不同.

Tru9I位点位于VDR基因第8内含子上,G→A碱基变异虽然不改变VDR基因蛋白序列,但转录的m RNA3'末端区域可影响mRNA表达和稳定性,影响增强子对靶部位的亲和力,改变翻译效率从而改变VDR表达.本地区人群中VDR基因Tru9I位点GG、GA、AA基因型频率分别为0.61、0.33和0.06,等位基因G和A频率分别为0.77和0.23,其SNP在NT组及HT组间分布无统计学差异(P>0.05).

本研究分别对整体、NT组及HT组人群ApaI、FokI、Tru9I位点各基因型亚组25(OH)D 水平进行了分组比较,未发现组间存在统计学差异(P>0.05).进(OH)D、VDR ApaI、FokI、Tru9I位点等位基因作为协变量,采用二分类Logistic回归分析结果提示,25(OH)D缺乏(OR=1.429,P=0.033)作为环境因素可能与本地区人群HT的发生有关,而VDR ApaI、FokI、Tru9I位点SNP可能与HT的发生无关.与美国[5]、塞尔维亚[16]、上海[18]、XiaofeiWang[20]等荟萃研究(6项来自于亚洲,5项来自于高加索)人群中ApaI、FokI基因多态性与HT发生无关研究结果类似,但研究亚洲人群中FokI等位基因F和FF基因型显著增加HT发生风险结论不一致(Fvsf:OR=1.45,95%CI=1.07~1.95,P=0.016;FFvsff:OR=1,64,95%CI=1.03~2.59,P=0.036; FF+ffvsff: OR =1.34,95%CI 1.00~1.80,P=0.047;FFvsFf+ff:OR1.64,95%CI=1.03~2.64,P=0.039).

2018年,《草原与草坪》承蒙以下审稿专家认真审阅稿件,付出辛勤工作,使刊物的学术质量和影响力又上了一个新台阶。在此,编辑部向为我刊审理稿件的专家致以诚挚的谢意,感谢您愿意挤出宝贵的时间,对我们的稿件给予悉心指导! 祝各位审稿专家在新的一年里身体安康,万事如意!

为全面提升养殖场的经济效益,部分养殖户会独自饲养生猪,自己屠宰并销售,通常为家庭分工协作饲养、共同负责产销,这种自产自销模式在一定程度上有利于稳定生猪市场,但受到经济利益的限制,部分养殖户在生猪养殖中,存在供不应求的现象。为解决这一问题,养殖户从外地引入肉质,屠宰并兼顾销售,使疫情因素转变,一旦消毒不彻底,将会导致外来疫病的传入,不利于生猪自产自销事业的发展。另外,不能定期消毒、接种疫苗,也增加了各类疾病发生的几率,且呈大面积扩散趋势,不利于生猪养殖事业的发展。

综上,中国云南个旧汉族人群普遍存在25(OH)D不足或缺乏,HT组25(OH)D缺乏的程度明显高于NT组,25(OH)D缺乏可能与HT的发生、发展有关.本地区人群VDR ApaI、TaqI、FokI、Tru9I位点存在SNP,但其SNP多态性未显示与HT的发生有关。我国地域辽阔,跨越纬度广,不同地域人群维生素D水平及VDR基因多态性与HT的相关性可能不同.限于本研究样本量及地域,今后尚需在更大样本及更多人群中研究以验证.

选取2014年2-10月在中山大学中山眼科中心海南省眼科医院屈光中心接受全飞秒激光手术的近视散光患者。按患者选择的手术方式将他们分为FLEx组28例(56眼)和SMILE组33例(66眼)。本研究获得中山眼科中心海南省眼科医院伦理委员会的批准(批号:2014-005),所有患者术前均签署手术知情同意书。

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向茜,王玉明,杨艳润,李万碧,张弦,杨才,刘华
《昆明医科大学学报》2018年第04期文献

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