神经胶质细胞又称胶质细胞，广泛分布于中枢神经系统和周围神经系统中，占人脑细胞总数的50%左右，对大脑疾病的预防、治疗和愈后修复起到了重要的作用[1].小胶质细胞的过度活化作为神经炎症的特征，其功能伴随神经元、星形胶质细胞、血脑屏障和中枢神经系统浸润的T细胞之间的相互作用以及血脑屏障的通透性改变，外周免疫细胞进入中枢神经系统，激活后产生并释放炎性因子导致神经元损伤死亡实现的[2].越来越多的研究证明中枢神经系统的小胶质细胞作为中枢神经系统中的免疫细胞，参与维持神经系统内环境稳态、调控神经信号传导等多项功能[3-5].小胶质细胞约占胶质细胞的5%～10%[1].小胶质细胞虽少，但其功能得到越来越多的关注.在阿尔茨海默症等神经退行性疾病中小胶质细胞的激活参与病情的发生发展生理过程.

依达拉奉作为自由基清除剂，主要应用于临床急性脑梗死和脑缺血疾病，可以显著减小脑梗塞体积，减少ROS的产生，具有保护神经元的作用[6].炎症反应是机体抵御感染和损伤的复杂过程，可使脑部疾病加重[7-8].前期研究发现小胶质细胞参与了AD的发生，合成小分子化合物或ApoE3可以减少NO、iNOS和IL-1β，对减轻AD病症有积极作用[9-12].鉴于依达拉奉在肾病研究或脑缺血神经元研究中有抗氧化抗炎作用，然而对原代小胶质细胞激活有抑制作用尚未报道.因此，笔者推测依达拉奉单独应用或依达拉奉与其他物质联合可能对原代培养的小胶质细胞激活产生的NO有抑制作用，为验证这一构想，本研究作依达拉奉干预LPS介异原代子胶质细胞的激活实验报道如下.

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：新生2～3 d的SD大鼠购自昆明医科大学动物实验中心；实验试剂：LPS、Griess试剂购自Sigma公司，SB203580、胰酶和GFAP购自MIllipore公司，CD68、RabbitIgG antibody（DyLight 594）购自Gene Tex公司，a-MEM、FBS、青霉素/链霉素 购自Hyclone公司，SP600125、U0126购自Cell signal technology公司.

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 实验分为4组：空白对照组、LPS组（10 ng/mL和 100 ng/mL）、EDA单独组+LPS、EDA+MAPKinhibitor+LPS组.

1.2.2 混合胶质细胞的原代培养 根据Tatiana V等[13]实验方法改进，取新生SD大鼠的乳鼠，麻醉后75%酒精消毒，断头取脑，分离血管和脑膜，取大脑皮层，均匀切碎约1 mm3小块.0.25%胰酶（含EDTA）消化25 min，加等量完全培养基终止消化.100 μm细胞筛过滤，2 000 r/min，离心2 min，弃上清；加完全培养基，吹打细胞均匀成悬浮状，40 μm过滤.接种到T75培养瓶中，倒置显微镜观察状态，37℃、5%CO2培养箱中培养7～10 d.

刚接种时的细胞呈圆形，3～4 d细胞完全贴壁，开始伸出细小突起，胞体变大变长呈梭形、多边形等形态.上层圆形、折光性强的小胶质细胞依附底层的星形胶质细胞存在.接种10 d左右，混合胶质细胞达到融合状态，见图1.

采用SPSS统计软件处理数据，2组之间的比较采用独立样本t检验，多组计量资料之间的比较采用单因素方差分析，如果有差别进一步进行两两比较的q检验，P＜0.05为差异有统计学意义.

经摇床分离原代小胶质细胞不同时间点的形态学，刚接种的小胶质细胞呈圆形胞体较小发亮.接种20 min时小胶质细胞贴壁，开始伸出细长突起，胞体呈较小的卵圆形、圆形等形状；而接种13 h的原代小胶质细胞多为倒三角形，卵圆形，突起伸长，分枝增加等典型状态；接种2 d，细胞呈圆形、分枝状、梭形等状态，见图2.星形胶质细胞和小胶质细胞的鉴定见图3.

1.3 统计学处理

1.2.4 胶质细胞的鉴定 接种到0.01 mg/mL多聚赖氨酸包被过夜的细胞培养玻片中的细胞，5%CO2、37℃继续培养过夜，进行免疫荧光实验.待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出.0.01MPBS洗3次，每次3min；4%多聚甲醛室温固定 20 min，0.01 M PBS洗 3次，每次 3 min；0.1%Triton-100透化30 min；0.01 MPBS洗3次，每次3 min；1%BSA室温封闭1 h；一抗：CD68（1:500），GFAP（1:400）室温孵育2h，0.01MPBS洗3次，每次3 min；二抗：DyLight594-conjugated Goat anti-Rabbit IgG Polyclonal antibody（1:1 000），goat-anti mouse（1:1 000）室温避光孵育1 h；DAPI（1:1 000）染细胞核20 min；50%甘油封片，显微镜下观察.

由此可见，山水画历史之悠久，作品之丰富，同时也包含了我们中华民族的传统文化和美学思想，丰富了我们的现实生活，可以说是我们中华民族的“瑰宝”。

2 结果

2.1 不同时间点培养SD大鼠新生鼠的原代混合胶质细胞的形态学变化

1.2.3 小胶质细胞的分离、纯化 小胶质细胞的分离与纯化：封口膜密封培养瓶；37℃摇床（250 r/min，2 h）分离混合胶质细胞上层的小胶质细胞；收集含小胶质细胞的培养基到15 mL离心管中；完全培养基冲洗培养瓶1～2次尽可能多的收集小胶质细胞；1 500 r/min 2～3 min，弃上清；完全培养基重悬小胶质细胞，40 μm过滤；细胞计数，调整细胞密度接种到不同实验培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养20 min，0.01 M PBS清洗1次，含M-CSF的完全培养基继续培养，完成不同实验.

4.企业文化方面。一号煤矿围绕安全生产中心，在文化建设方面做了大量尝试与探索，使企业文化在一号煤矿落地生根、开花结果，初步实现了预期目标。在全矿范围内开展人的安全行为治理工作，通过“双述”活动与“五小”活动，以公开竞赛的形式催生了一批岗位描述能手、技术业务骨干与科技创新人才；结合矿情，广泛集合职工智慧，认真总结近年来在企业文化建设中积累的经验和好的做法，提炼出独具一号煤矿特色的品牌文化，企业文化的建设与全力推广，在凝聚人心，统一思想，以促进企业生产、经营、管理良性运转等方面发挥了巨大作用。

震级是地震大小的度量，是地震的基本参数之一，广泛应用在地震监测、预报、新闻报道、信息发布、科学研究中[1]。减小震级测量的误差、保持其的一致性与稳定性是西藏测震台网工作的重要内容。

  

图1 混合胶质细胞的原代培养（×10）Fig.1 Primary culture of mixed glial cells（×10）

 

A:培养第4天融合前；B：培养第7天融合.

2.2 分离纯化后小胶质细胞不同时间的形态学变化

1.2.5 检测NO 培养的小胶质细胞24 h，0.01 M PBS清洗1次，换用含M-CSF和N2的无血清培养基继续于37℃、5%CO2的条件下培养24 h.按照实验分组进行加药，LPS诱导小胶质细胞16 h后，通过Griess法检测NO含量[14].

  

图2 小胶质细胞的原代培养（×10）Fig.2 Primary culture of microglia（×10）

 

A:小胶质细胞培养13 h；B:小胶质细胞培养48 h.

  

图3 星形胶质细胞和小胶质细胞的鉴定（×10）Fig.3 Identification of astrocytes and microglia（×10）

 

A:GFAP/Astrocyte；B:DAPI/Astrocyte；C:GFAP/DAPI/Astrocyte；D:CD68/Microglia；E:DAPI/Microglia；F:CD68/DAPI/Microglia.

2.4 LPS介导小胶质细胞的激活

脂多糖介导小胶质细胞激活后，小胶质细胞胞体变大、突起缩短变粗，突起上的小棘似“毛刺”状.10 ng/mL LPS和100 ng/mL LPS分别处理小胶质细胞16 h后，检测NO释放量.结果显示，与对照组相比，经LPS处理后，随着LPS浓度升高，NO产量也随之上调，100 ng/mL LPS比10 ng/mL LPS增加NO释放量（见图4）.

  

图4 LPS 100 ng/mL激活小胶质细胞（×10）Fig.4 Lipopolysaccharide induced microglia（×10）

 

A:正常状态下小胶质细胞的状态（20x）；B:100 ng/mLLPS激活小胶质细胞的状态（20x）；B：100 ng/mLLPS和10 ng/mLLPS诱导小胶质细胞激活后NO的表达，与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.001，n＝5.

2.5 依达拉奉对LPS介导小胶质细胞激活后NO释放的影响

40 μm/LEDA预处理24 h，加用10 ng/mL LPS到小胶质细胞16 h.结果显示，与10 ng/mL LPS单独处理小胶质细胞16 h相比，40 μm/L EDA预处理后，NO下调（见图5）.

2.6 依达拉奉与MAPK inhibitor共同作用对LPS诱导小胶质细胞激活后NO释放的影响

40 μm/L EDA 预处理 24 h，10 μm/L MAPK inhibitor（SP600125、SB203580、U0126）预处理30 min，用10 ng/mL LPS介导小胶质细胞激活16 h.结果显示，与10 ng/mL LPS单独处理小胶质细胞组相比，依达拉奉与MAPK inhibitor预处理，经过10 ng/mL LPS介导小胶质细胞，NO释放量显著降低（见图6）.

2)掘进机截割头模型建立。利用CATIA软件建立带有吸尘孔的掘进机截割头模型，保存相应的igs仿真模型导入到EDEM软件中，设置其材料为钢铁，设置截割部截割转速50 r/min，行进速度80 mm/min。仿真模型如图3所示。

  

图5 依达拉奉对10 ng/mL LPS诱导小胶质细胞激活NO释放的影响（n＝3）Fig.5 Effect of edaravone on the NO release after 10ng/ml LPS induced microglia（n＝3）

 

与对照组比较，**P＜0.001.与 LPS组比较，△P＜0.001.

  

图6 依达拉奉和MAPK inhibitor预处理，对LPS诱导小胶质细胞激活后NO释放的影响（n＝3）Fig.6 Effect of edaravone and MAPK inhibitor pretreatment on NO release after microglial activation induced by LPS（n＝3）

 

与对照组比较，***P＜0.001；与LPS组相比，△P＜0.001.

3 讨论

作为革兰阴性菌细胞壁的外膜层组成成分，脂多糖是有效的免疫激活剂[15].LPS刺激小胶质细胞后可产生炎症因子或氧化应激状态，释放细胞因子或诱导型一氧化氮合酶，后者导致NO产生.NO是无须特异受体自由穿透细胞膜的一种高反应性、细胞毒性的自由基[16].有研究报道，过量的NO会产生明显的毒性，可以杀伤神经元[17].大量的研究表明，小胶质细胞参与了神经系统疾病中的一系列炎症和氧化应激反应[9-12，18].本研究使用不同浓度的LPS介导原代小胶质细胞激活均产生NO，证明LPS介导氧化应激模型已建成，为后续的药物干预提供基础.EDA最初是清除脑部自由基的临床用药，有发现药物可以抑制胶质细胞水肿，进而达到保护神经病变的作用，而本研究未见细胞水肿[19].近有报道[20]EDA可以通过Notch信号通路调节BV-2小胶质细胞激活的研究，而本研究以原代小胶质细胞进行EDA的进一步研究，获得结果与BV-2结果类似.加用MAPK信号传递通路抑制剂，同等用量EDA则出现NO显著下调.MAPK是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其抑制剂主要 SP600125、SB203580、U0126分别为JNK、p38MAPK、ERK信号通路的抑制剂，与细胞的增殖、细胞凋亡及其炎症反应有密切的关系[21-23].当MAPK信号通路被过度激活后，p38MAPK、JNK、ERK的过度激活会使iNOS的表达上调、促进NO生成增加[24-27].结果提示EDA与p38MAPK、JNK、ERK通路抑制剂有协同下调LPS介导的原代培养小胶质细胞氧化应激（本文仅提供NO指标，iNOS研究有待下一步完成）反应，至于EDA如何影响MAPK的表达及其机理仍需要进一步研究以进行阐明.

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