缺血性心脏病在老年人群中发病率居高不下，甚至逐渐趋向于中青年人群，其主要的发病机制为：当心脏缺血后又恢复心脏的正常血供时，心脏功能不仅没有恢复，反而出现不可逆转性的心肌损伤，此即为心肌缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion，I/R）[1].有研究表明，血管内皮细胞是I/R损伤中尤为重要的靶细胞，同时也是I/R损伤的开始发生发展的重要影响因素[2-3].

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是广泛存在于神经系统，同时也是心肌I/R损伤中重要的信号传递分子之一[4-5].目前有研究发现，PKCα、β、δ、ε和η均具有心肌保护的作用，并且PKCε的保护作用由为突出[6-7].有研究显示，PKCε在多种预处理下的抗心肌I/R损伤中，发挥着极为重要的作用[8-11].

灯盏花乙素（scutellarin，SCU）是从云南特有药用植物灯盏花中提取的有效活性成分.根据目前的研究报道，SCU具有扩张血管、抗凝血作用和促纤溶等多种药理学活性[12-13].有研究显示，SCU可改善I/R致脑微血管内皮损伤[14].因此，作者推测：在I/R致心血管损伤方面是否也有同样功效.

基于以上推测，本研究采用人心脏微血管内皮细胞（human cardiac microvascular endothelial cells，HCMECs）为受试细胞，在正常以及缺氧再给氧（hypoxia reoxygenation，HR）（模拟缺血再灌注损伤）的处理条件下，探讨SCU对正常及HR损伤条件下HCMECs中蛋白激酶Cε（PKCε）表达的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

受试细胞HCMECs购自上海研一生物科技有限公司.受试药物SCU是由云南龙津药业植化专家张人伟[15]研究员提供，其含量＞99%.SCU的结构式见图1.

  

图1 灯盏花乙素结构式Fig.1 Structure of Scutellarin

 

4,5，6-三羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸.

实验主要试剂：细胞培养用DMEM培养基与胎牛血清均购自于美国Hyclone公司；PKCε及磷酸化PKCε（p-PKCε，PKCε的活化形式）的抗体购自美国Santa Cruz公司；蛋白定量BCA试剂盒购自于上海碧云天生物技术有限公司；Total RNA提取试剂与 RecombinantDNaseⅠ（RNase-free）购自于TaKaRa公司；2×Power Taq PCR MasterMix购自Bioteke公司.

与 Control组比较，SCU（0.1 μM，1 μM，10 μM）PKCε的mRNA表达均有显著增加，且呈剂量依赖性（图3）.

1.2 方法

1.2.2 HR模型构建与分组 用SCU0.1 μM孵育HCMECs预处理2 h后，更换无糖无血清的培养基进行缺糖处理，在此培养过程中同时给予相应浓度SCU，再放置于三气培养箱中（此时培养箱为5%CO2，2%O2，98%N2）进行缺氧培养处理12 h后，更换正常培养基，置于正常培养箱，进行复氧处理12 h.实验分组为：对照组（Control）、HR组（Model）、SCU（0.1 μM，1 μM，10 μM）3种剂量组.

1.2.1 正常培养与分组 当HCMECs贴壁达板面积90%时，用相应浓度的SCU孵育细胞，于正常培养箱中培养24 h.实验分组为对照组（Control）、SCU（0.1 μM，1 μM，10 μM）3 种剂量组.

RT-PCR检测：以Trizol法提取细胞中总RNA，再使用Quantscript RT试剂盒对其逆转录成cDNA.在基因扩增系统中，扩增过程为：94℃初始模板变性3 min（1个周期），94℃模板变性30 s（35个周期），然后57℃退火30 s，并在72℃延伸45 s.PCR反应产物再经过1%浓度的琼脂糖凝胶电泳分离，染色用溴化乙锭，之后用清水漂洗.在凝胶成像仪中观察凝胶中条带，最后将条带拍照保存.GAPDH作为基因内参，计算PKCε与GAPDH的mRNA密度值，进行评估计算.PKCε 正向序列为 CTCCCTTTGAGGCCGACAAT，其反向GTCCACAAGGGTGAGTACCG；GAPDH正向 序 列 AATCCCATCACCATCTTCC，反 向GAGTCCTTCCACGATACCAA.

不可否认，漓江画派之所以在全国产生重大的影响，其中一个重要的因素就是“依托广西艺术学院这个学术和人才培养平台”。漓江画派集中了广西各画种的代表性画家和美术评论家，他们大多数是毕业或工作于广西艺术学院，漓江画派促进会学术委员会常务理事中超过半数是学院的专业教师。可以说，作为漓江画派的主要人才聚集地, 具有80年办学历史的广西艺术学院无论在艺术创作和理论研究方面，还是在人才培养和队伍建设方面，都为漓江画派的发展做出了突出的贡献。实施画派与学院相互依托、互为平台、共同提高的策略，成为加强漓江画派人才队伍建设的重要手段。

Western blot检测：PKCε蛋白样品准备：取出正常以及缺氧再给氧条件下培养的HCMECs，将其在含有蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解液中裂解细胞后，收集细胞裂解物，经过4℃10 000 g离心10 min，取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量.p-PKCε蛋白样品准备：取出正常以及缺氧再给氧条件下培养的HCMECs，将其在含有磷酸酶抑制剂Phosstop和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中溶解细胞，裂解物经过14 000 g离心15 min（4℃）处理.最后用BCA试剂盒进行蛋白定量.

传统的励志教育主要倾向于话语教育，但在全球经济一体化的今天，话语教育存在一定的滞后性，经常出现失语、话语失效等现象。传统的励志话语教育具有中国特色、中国风格，与思维日益发散的青年大学生多少有些不合拍。因此，思想政治教育工作者应逐渐将话语教育尽可能转向以环境涵育为主的教育模式，让学生通过深厚文化的熏陶与感染磨练出自己独特的人格魅力。

1.3 统计学处理

2018年7月，作为省管国企的老大，山东高速集团实现了飞速的换帅之举。孙亮的卸任早在几年前便在坊间有所传闻，但一直未见有实质性动作，对于相关接替人员，也一直未曾出现过热门人选。因此，由潍坊市常务副市长邹庆忠出任高速集团一把手，某种意义上说，出乎很多人的意料。

Herbertus mastigophoroides H.A.Mill.熊源新等（2006）；杨志平（2006）

2 结果

2.1 SCU对正常培养的HCMECs中p-PKCε及PKCε蛋白表达的影响

与 Control组比较，SCU（0.1 μM，1 μM，10 μM）p-PKCε的表达无明显变化，而PKCε均有显著增加，且呈剂量依赖性（见图2）.

取20 μg蛋白上样，在10%的分离胶中进行SDS-PAGE凝胶电泳.经过恒压15 V转印时间30 min半干转印，再用以脱脂奶粉与TBST缓冲液配制的封闭液在室温下封闭1 h.加入PKCε一抗（1:1 000）及p-PKCε 一抗（1:1 000），4℃孵育过夜.用1×TBST洗膜3次，每次5 min.之后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体（1:2 000）室温孵育1 h.用1×TBST洗膜3次，每次5 min.加ECL试剂，用X胶片曝光，最后用洗片机显影成像.同时用GAPDH抗体（1:10 000）作为内参对照.结果所得图像用Scion软件进行分析计算.

  

图2 SCU对正常培养HCMECs中p-PKCε和PKCε蛋白水平的影响Fig.2 Effect of SCU on p-PKCε and PKCε protein levels in normal HCMEC

 

A:Western blot实验代表性条带；B:数据统计学定量分析图).与对照组比较，**P＜0.01.

2.2 SCU对正常培养的HCMECs中PKCε mRNA表达的影响

我们从上述看出，这时期体育改革推动体育公共服务建设和完善，以青少年体质健康和老年人健康为重点加快了体育公共服务改革，逐步形成以政府服务为主体，以社会和市场机制为补充的体育公共服务体系。

构建和谐企业并非一蹴而就，而是一个长期的过程。企业要按照企业美学理论，特别是审美文化理论来全面规划，把“和谐”的意识全面落实到企业的生产经营管理过程中，与具有这种思想观念的人相配合，真正发挥出“和谐”的强大力量。“在文化创造的各个领域，人们更关心的是审美表达，而不是社会解释。”［4］525审美表达更多的是人们有意识地创造和享受美的一种表现，而不是寻求一种社会通俗的表达，因为我们是生活在一个文化大发展的时代和社会。

数据分析处理采用SigmaStat统计学软件，实验所得数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）的Fisher Least-Significant Difference检验，检验标准α=0.05.用SigmaPlot图形软件进行作图.

  

图3 SCU对正常培养HCMECs中PKCε mRNA水平的影响Fig.3 Effect of SCU on PKCε mRNA levels in normal HCMECs

 

A:RT-PCR实验代表性条带；B:数据统计学定量分析图.*P＜0.05，**P＜0.01.

2.3 SCU对HR培养的HCMECs中p-PKCε和PKCε蛋白表达的影响

与Model组组比较，SCU给药使p-PKCε和PKCε蛋白表达有逐渐升高的趋势且存在一定的剂量依赖性，SCU10μM可显著上调p-PKCε和PKCε蛋白表达（见图4）.

  

图4 SCU对HR培养HCMECs中p-PKCε和PKCε蛋白水平的影响Fig.4 Effect of SCU on p-PKCε and PKCε protein levels in HR-treated HCMECs

 

A:Western blot实验代表性条带；B:数据统计学柱状图).*P＜0.05.

2.4 SCU对HR培养的HCMECs中PKCε mRNA表达的影响

相比于Control组，HR损伤使Model组PKCε mRNA表达显著下降.而与Model组比较，SCU给药使PKCε mRNA表达有逐渐升高的趋势，并且存在一定的剂量依赖性，SCU（1 μM，10 μM）可显著上调PKCε mRNA表达（见图5）.

  

图5 SCU对HR培养HCMECs中PKCε mRNA水平的影响Fig.5 Effect of SCU on PKCε mRNA levels in HR-treated HCMECs

 

A:RT-PCR实验代表性条带；B:数据统计学定量分析图.*P＜0.05.

3 讨论

灯盏花乙素是云南特有植物灯盏花的有效活性成分，并且也是一种成功用于临床治疗缺血性疾病的黄酮苷类化合物[16].本研究表明，SCU在正常培养以及HR培养的HCMECs中，可上调PKCε的蛋白和mRNA的表达，提示PKCε参与了I/R至心血管的损伤，而SCU可通过上调PKCε的蛋白和mRNA的表达起到保护作用.

以前的研究[17]显示，SCU通过拮抗I/R损伤起到舒张血管的作用，从而达到保护心脑的效用.而在目前的研究中，笔者着重研究SCU对内皮细胞可能的直接保护作用.在正常培养HCMECs的实验中，SCU可显著增加细胞中的PKCε蛋白及mRNA的表达，并且对PKCε的活化形式p-PKCε也有上调作用.在HR培养HCMECs的实验中，SCU可降低细胞受HR损伤，并且可显著增细胞中的PKCε蛋白及mRNA表达.

PKC是一组依赖Ca2+激活蛋白丝／苏氨酸激酶，它是由单一的多肽单链构成.目前，在生物细胞中至少发现了13种PKC亚型.PKCε属于nPKC中的一员，其在细胞的生长、分化、凋亡以及转化等多种细胞信号转导途径中发挥着重要的作用[18].研究发现在缺血再灌注机制中，PKCε的作用尤为重要.迄今为止，各类研究对缺血预适应晚期效应中的PKC各个亚型变化研究较少，并且，对PKCε在晚期效应期的分布及其表达也尚无报道[19].

本研究通过观察SCU上调PKCε，从而对HCMECs起保护作用，一定程度上表明了SCU拮抗心肌I/R损伤的分子机制.本研究的结果将揭示用于缺血性疾病临床的化合物SCU的药理作用及分子机制研究，也提示了PKCε在I/R损伤相关信号通路中的重要作用.

［参考文献］

［1］WANG M，SUN G B，ZHANG J Y，et al.Elatoside C protects the heart from ischaemia/reperfusion injury through the modulation of oxidative stress and intracellular Ca2+homeostasis［J］.Int J Cardiol，2015，185（2）:167-176.

［2］GROVER-PAEZ F，ZAVALZA-GMEZ AB.Endothelial dysfunction and cardiovascular risk factors ［J］.Diabetes Res Clin Pract，2009，84（1）:1-10.

［3］MARX N，GRANT P J.Endothelial dysfunction and cardiovascular disease the lull before the storm ［J］.Diab Vasc Dis Res，2007，4（2）:82-83.

［4］STEINBERG S F.Structural basis of protein kinase C isoformfunction ［J］.Physiol Rev，2008，88（4）:1341-1378.

［5］LAI L，ZHANG X，ZHANG X，et al.Lazaroid U83836E protects the heart against ischemia reperfusion injury via inhibition ofoxidative stress and activation ofPKC［J］.Mol Med Rep 2016，13（1）:3993-4000.

［6］AKITA Y.Protein kinase C-epsilon（PKC-epsilon）:Iits unique structure and function［J］.J Biochem，2002，132（6）:847-852.

［7］CHEN Y，TIAN Q.The role of protein kinase C epsilon in neural signal transduction and neurogenic diseases［J］.Front Med，2011，5（1）:70-76.

［8］HUND T J，LERNER D L，YAMADA K A，et al.Protein kinase Cepsilon mediates salutary effects on electrical coupling induced by ischemic preconditioning ［J］.Heart Rhythm，2007，4（9）:1183-1193.

［9］INAGAKI K，CHURCHILL E，MOCHLY-ROSEN D.Epsilon protein kinase C as a potential therapeutic target for the ischemic heart［J］.Cardiovas Res，2006，70（ 15）:222-230.

［10］HAO Z，PAN S S，SHEN Y J，et al.Exercise preconditioning-induced early and late phase of cardioprotection is associated withprotein kinase C epsilon translocation［J］.Circ J，2014，78（7）:1636-1645.

［11］TANG L，PENG Y，XU T，et al.The effects of quercetin protect cardiomyocytes from A/R injury is related to its capability to increasing expression and activity of PKC epsilon protein ［J］.Mol Cell Biochem，2013，382（1）:145-152.

［12］LIN L L，LIU A J，LIU J G，et al.Protective effects of scutellarin and breviscapine on brain and heart ischemia in rats［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，50（1）:327-332.

［13］ZHANG H F，HU X M，WANG L X，et al.Protective effects of scutellarin against cerebral ischemia in rats:evidence for inhibition of the apoptosis-inducing factor pathway［J］.Planta Med，2009，75（1）:121-126.

［14］XIAOHUA D U，CHEN CHEN，MIN ZHANG，et al.Scutellarin reduces endothelium dysfunction through the PKG-I pathway［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2015，2015（1）:1-12.

［15］张人伟，张元玲，王杰生.灯盏花黄酮类成分的分离鉴定［J］.中草药，1988，19（5）:7-9.

［16］朱君荣，李运曼.灯盏花素冰片注射液对实验性脑缺血的保护作用［J］.中国药科大学学报，2007，38（5）:456-460.

［17］YANG W，LUST R M，BOFFERDING A，et al.Nitric oxide and catalase-sensitive relaxation by scutellarin in the mouse thoracic aorta［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2009，53（1）:66-76.

［18］杨翼，李章华，石武谛，等.热预处理对超负荷训练大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2015，21（1）:49-53.

［19］KORZICKDH，RISHELME，BOWLESDK.Exercise and hypercholesterolemia produce disparate shifts in coronary PKC expression ［J］.Med Sci Sports Exerc，2005，37（3）：381-388.