脂肪酶（EC 3.1.1.3）是最稳定水解酶之一，参与多种合成与水解反应，广泛应用于食品、造纸和洗涤等行业[1-3]。

脂肪酶来源广、应用领域多、需求量大，目前采用多拷贝启动子[4-5]，多拷贝目的基因[6]，融合表达[7]，密码子优化[8]，加入分子伴侣[9-10]，选择高效表达系统[11]等方法提高脂肪酶基因表达量。杨江科等将黑曲霉脂肪酶基因经密码子优化在毕赤酵母中诱导表达72 h后，发酵液酶活力达176.0 U·mL-1[12]。Chen等运用RSM试验和单因子试验优化Aspergillus sp.F044产脂肪酶发酵条件，结果表明，在最优培养条件下，脂肪酶经72 h发酵酶活力达32.15 U·mL-1，比出发菌株提高2.88倍[13]。李秀鹏等通过降低背景蛋白及构建多拷贝耐热脂肪酶（TII）基因表达载体在黑曲霉SH-2中表达，转化子发酵上清液酶活力最高为150·U·mL-1[14]。国内目前脂肪酶产量仍无法满足工业生产需求，尤其是食品级脂肪酶生产成本高，产量低，纯化困难，提高食品级脂肪酶产量是现代工业生产难题之一。黑曲霉是最重要工业生产和基础遗传研究菌株[15]，用于食品级酶制剂生产，高效生产表达食品级脂肪酶发展前景良好。

原发性输卵管癌肉瘤的转移途径与卵巢恶性肿瘤的转移途径相似。①盆腔及腹腔内扩散：癌细胞侵入并突破输卵管肌层蔓延到盆腔邻近器官，或癌细胞脱落至盆腹腔直接种植于盆腹腔各脏器表面；②淋巴结转移：盆腔内有极丰富的淋巴管，可以连通输卵管、卵巢及子宫，因此经常发生盆腔淋巴结及腹主动脉旁淋巴结的转移；③血行远处转移：在疾病晚期可经血液转移至肝脏、肺脏、骨骼等器官，转移灶含上皮或间质成分之一，而两种成分同时存在者少见。这可能与两种成分主要的转移途径有关，恶性上皮成分(癌)更易发生淋巴结转移，而恶性间叶成分(肉瘤)更易发生血行转移[10]。

试验拟用多拷贝策略，利用同源重组技术将1～2拷贝脂肪酶基因整合到黑曲霉CICC2462中高表达酸稳定α-淀粉酶基因（asAA）位点，以期获得高分泌黑曲霉脂肪酶食品级工程菌。同时，研究拷贝数对目的基因在黑曲霉中高效表达影响，为提高脂肪酶表达量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

A.niger CICC2462（ΔpyrGΔasAA::pyrG）、农杆菌AGL1、载体pSZHA由东北农业大学真菌遗传学实验室构建并保存。

1.1.2 主要试剂

Primer STAR DNA Polymerase、限制性内切酶（购自TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（购自康为世纪生物科技有限公司）；橄榄油（Olive oil）、聚乙烯醇（Poly vinyl alcohol）、尿苷（Uridine）（购自北京博奥拓达科技有限公司）；5-FOA（5-Fluoroorotic acid）（购自美国Sigma公司）；抗生素：氨苄霉素、卡那霉素、利福平等（购自Sangon公司）。其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

DK-8D三温三控水槽（购自上海百典仪器有限公司）；高速离心机（购自美国Thermo Fisher Scien⁃tific）;PCR仪（购自北京比朗实验设备有限公司）；震荡培养箱（购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（购自上海博迅实业有限公司）；FSH-2A高速可调匀浆机（购自上海旌派仪器有限公司）；pH计（购自沈阳瑞丰精细化学品有限公司）。

位于赤道以南8度的巴厘岛，一直以来因种植水稻和外来水果而被世界熟知。如果在这里种植葡萄呢？大多数葡萄酒专家会告诉你：这是不可能的，因为这里太热了！但实际上，自20世纪初，巴厘岛就已经开始种植食用葡萄。就像水稻一样，葡萄每年也会有3次采收期，且不需要经历冬季的树藤休眠期。尽管如此，这并不能阻止一些颇具前瞻目光的思想家（也可以叫他们顽固派）去尝试在这个吸引了包括雅加达人在内全球旅游爱好者的热带岛屿上酿造葡萄酒。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉基因组提取

用咪达唑仑、舒芬太尼常规镇静镇痛,使用PB840呼吸机进行机械通气,控制潮气量为6~8 ml/kg,每次吸气时间为1~1.2 s,40 L/min,频率为14~25次/min,氧浓度控制在45~100%,控制呼气末正压为5~18 cm H 2 O,保证患者SaO2>85%。

①吸取培养基中新鲜黑曲霉菌丝，离心10 min，称量菌丝湿重0.1 g。

②加液氮于菌丝中充分研磨至粉末后，加400 μL Buffer LP1和 6 μL RNase A，旋涡震荡60 s，室温静置10 min，再加130 μL LP2，混合均匀后，旋涡震荡1 min。

用XbaⅠ和HindⅢ双酶切黑曲霉表达载体pSZHA6R-AnlipA和pSZHA6R-2AnlipA，分别得2 600 bp基因片段，15 280 bp载体片段和5 950 bp基因片段，15 280 bp载体片段（见图3）。

④加500 μL GW2（加入无水乙醇）于吸附柱中，离心，弃废液。此步骤重复两次。

⑤将吸附柱离心2 min后，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底将酒精晾干。

⑥50 μL ddH2O加到吸附柱中，室温静置2～5 min后，12 000 r·min-1，离心2 min，收集DNA，于-20℃冰箱保存。

1.2.2 基因克隆

根据黑曲霉脂肪酶AnlipA（Gene ID:4988581）序列，用软件Primer 5.0设计黑曲霉脂肪酶基因特异引物（见表1）。

以黑曲霉基因组为模板，用引物P1和P2作PCR扩增，将扩增产物克隆至pMD-19T（TaKaRa）并测序。

1.2.3 表达载体构建

将本实验室已有质粒pT-6R与pT-6R-Tgla分别用ApaⅠ,HindⅢ和ApaⅠ，Bam HⅠ双酶切并回收载体片段，上述相同限制性内切酶双酶切质粒pT-AnlipA，回收目的基因片段，将载体与目的基因相连接，得质粒pT-6R-AnlipA和pT-6R-Anli⁃pA-Tgla。再分别用XbaⅠ,HindⅢ和NheⅠ,HindⅢ双酶切pT-6R-AnlipA和pT-6R-AnlipA-Tgla，将两片段相连，即得质粒pT-6R-AnlipA-Tgla-6R-Anli⁃pA。将表达载体pSZHA用XbaⅠ,HindⅢ双酶切，纯化后载体片段与AnlipA单拷贝与双拷贝表达框相连（见图1），即得表达载体pSZHA6R-AnlipA与pS⁃ZHA6R-2AnlipA。

表1 引物名称及其序列 Table 1 Primer name and sequence

引物名称Primer name P1：lip-sense P2：lip-antisense P3：5'asAA-sense P4：3'asAA-antisense P5:actA-RT sense P6:actA-RT antisense P7:lip-RT sense P8:lip-RT antisense引物序列Primer sequence 5'GGGCCCGCACCGACACCACTTGATG3'5'AAGCTTGGATCCTTATAGCAGACACTCTGAAATTGC3'5'TCGCCTATCTACTCCTCATCC3'5'CTTCAACCCTGCTGCTAAATC3'5'CCACGAGACCACCTTCAACTCCA3'5'CCACCGATCCAGACGGAGTACTTGC3'5'GGCAGTAGCACCATCAAGAAC3'5'CTTCCAGAATCCAGTGTGAACC3'酶切位点Restriction sites ApaⅠHindⅢ；Bam HⅠ

图1 pSZHA6R-AnlipA与pSZHA6R-2AnlipA表达阅读框 Fig.1 Expression cassette of pSZHA6R-AnlipA and pSZHA6R-2AnlipA

1.2.4 黑曲霉脂肪酶共培养和转化子鉴定

明治时期是日本从封建社会步入近代社会的开端，更是国家在科学技术、社会文化、思想意识等经济基础和上层建筑两方面获得急速发展的时期，对明治文学的研究，不但可以使我们进一步明晰明治文学的本质，通过文学进一步了解日本近代政治思想体系和历史文化变迁乃至近代国家的发展脉络。对明治的借鉴可以使我们从多角度思考本国乃至世界文化的发展，为人类共同体的构建提供可行的思路。因此，明治文学研究很有必要。

重组质粒通过冻融法转入农杆菌AGL1后，初次活化农杆转化子菌按1∶10比例接种于新鲜YEB培养基（100 mg·L-1利福平，100 mg·L-1卡那霉素和200 μmol·L-1乙酰丁香酮）中，当OD600达 0.4～0.6时，取200 μL农杆菌离心后沉淀与50 μL破碎黑曲霉菌丝混合，涂布于覆盖在PDA平板玻璃纸上（200 μmol·L-1乙酰丁香酮）。30℃孵育2 d后，将含菌丝体玻璃纸倒置于新CD平板上（200 mmol·L-1头孢、20 g·L-1麦芽糖、1 mol·L-1尿苷和1 mol·L-1 5-FOA）培养1 d后，取出玻璃纸，30℃培养至菌落形成。将平板上菌落接种在CD液体培养基（200 mmol·L-1头孢、20 g·L-1麦芽糖、1 mol·L-1尿苷和1 mol·L-15-FOA）中培养5～7 d，收集黑曲霉菌丝提取其基因组DNA[16]。用引物P3和P4（见表1）鉴定黑曲霉纯合转化子。

根据康为世纪生物科技公司生产基因组提取试剂盒提供说明书提取黑曲霉基因组，具体步骤如下：

1.2.5 荧光定量PCR检测

(1)治疗前,两组患者的三项心功能指标(左心室射血分数、左心室舒张末期内径、左心房舒张末期内径)比较差异不显著,P>0.05,无统计学意义;(2)治疗后,两组患者的三项心功能指标(左心室射血分数、左心室舒张末期内径、左心房舒张末期内径)比较差异显著,P<0.05,有统计学意义,详见表1.

以黑曲霉基因组为模板，用引物P1、P2作PCR扩增为1 055 bp目的条带（见图2），将AnlipA基因片段克隆至pMD-19T转入大肠杆菌中，摇瓶提取质粒，然后作测序比对，比对结果表明该基因序列与黑曲霉CBS513.88相似度为100%。

1.2.6 SDS-PAGE

徐苏炜等在毕赤酵母中表达RML基因，其酶活为102 U·mL-1[28]； Garcíasilvera等在粘质沙雷氏菌中表达胞外脂肪酶，酶活为124 U·mL-1[29]；本研究中2拷贝AnlipA重组黑曲霉菌株的酶活力达1 480 U·mL-1，符合食品级要求，安全优势和生产潜力显著。

1.2.7 酶活测定

将培养5～7 d黑曲霉纯合转化子接种到工业发酵培养基中（2%豆饼粉，2%玉米浆，10%葡萄糖，pH 5.5～6.0），30 ℃，250 r·min-1摇瓶振荡培养，收集4～10 d发酵液。配置0.05 mol·L-1氢氧化钠储备液，稀释为0.01 mol·L-1氢氧化钠标准溶液待用。取2个100 mL三角瓶，分别于瓶1与瓶2加入4 mL底物溶液（称取聚乙烯醇40 g加800 mL蒸馏水在沸水浴中加热、搅拌至全部溶解，加蒸馏水定容至1 L，冷却至室温后，干净双层纱布过滤，留滤液备用。量取上述溶液240 mL，加80 mL橄榄油，高速匀浆机处理6 min，共2次，间隔10 min，每次处理3 min。即得乳白色底物混合液，该底物溶液现用现配）和pH为7.5磷酸缓冲溶液5 mL（分别称取磷酸二氢钾3.92 g和79.24 g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解并定容至1 L），再于瓶1中加入95%乙醇15 mL，40℃水浴锅中预热5 min，两瓶中加入适当稀释倍数酶液1 mL，立即混匀计时，准确反应15 min后，瓶2中立刻补加15 mL 95%乙醇终止反应[18]。1、2两瓶中各加两滴酚酞指示剂，氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30 s不褪色为滴定终点，记录氢氧化钠标准溶液消耗体积。每个样品作3组平行。

脂肪酶制剂活力按如下公式计算：

X1：样品酶活力（μ·g-1）；

V1：滴定瓶2时消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）；

V2：滴定瓶1时消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）；

c：氢氧化钠标准溶液浓度（mol·L-1）；

n1：样品稀释倍数。

1.2.8 脂肪酶酶学性质测定

最适pH：将酶液稀释到适当倍数，调节缓冲溶液pH范围为4～11，在40℃条件下，测定脂肪酶酶活。

最适温度：将酶液稀释到适当倍数，调节温度范围25～55℃，在磷酸缓冲溶液pH 7.5条件下，测定脂肪酶酶活。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉脂肪酶AnlipA克隆

提取黑曲霉脂肪酶发酵第5天菌体RNA并合成反转录cDNA。用Premix Ex Taq在SYBR's Strata⁃gene Mx3000P仪器（美国）作实时定量PCR。每个样品反应体系50 μL，设3个重复，用表1中列出引物P5，P6和P7，P8作Quantitative real time PCR分析。PCR程序步骤如下：95℃初始变性10 min，95℃，15 s，60℃，60 s，40个循环，在每个延伸步骤结束时，95℃测量荧光信号。内部定量标准是同一样品actin转录数[17]。

图2 AnlipA基因扩增结果 Fig.2 Cloning of AnlipA by PCR

2.2 多拷贝脂肪酶表达载体构建

③高速离心10 min，取上清液至新EP管中，加入1.5倍体积LP3，混匀后加DM吸附柱中，离心，弃废液。

2.3 冻融法转化农杆菌AGL1

将表达载体pSZHA6R-AnlipA，pSZHA6R-2AnlipA通过冻融法转入农杆菌AGL1感受态中，在含卡那霉素和利福平抗性YEB培养基中28℃培养，直至长出大小适宜单菌落（见图4）。

图3 pSZHA6R-AnlipA，pSZHA6R-2AnlipA双酶切鉴定结果 Fig.3 Double enzymes digestion results of vectors pSZHA6R-AnlipA and pSZHA6R-2AnlipA

图4 重组表达载体转入农杆菌 Fig.4 Expression vectors transferred into AGL1

2.4 黑曲霉转化子筛选和鉴定

使用出发菌株以pyrG为筛选标记且重组菌株中不含抗生素抗性基因，符合食品级要求。挑取筛选培养基上黑曲霉转化子单菌落，接种于液体CD培养基（200 mmol·L-1头孢、20 g·L-1麦芽糖、1 mol·L-1尿苷、1 mol·L-15-FOA）中，置于培养箱中培养4～5 d，提取黑曲霉菌丝体基因组DNA。用引物5'asAA-sense和3'asAA-antisense作PCR扩增，鉴定黑曲霉纯合转化子。以水和出发菌株为阴性对照，pSZHA6R-AnlipA和pSZHA6R-2AnlipA质粒分别为阳性对照，黑曲霉转化子均扩增出与质粒对照相同目的条带，见图5～6。结果表明，CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）、CICC2462（pSZHA6R-2Anli⁃pA）均为纯合转化子。

2.5 重组脂肪酶荧光定量PCR分析

将重组菌株 CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）和CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）作摇瓶发酵，取发酵第5天菌体提取RNA，用引物P5，P6和P7，P8作Real-time PCR，在转录水平上比较不同拷贝数AnlipA基因表达量，如图7所示。结果表明CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）中脂肪酶基因转录水平为CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）1.26倍。

2.6 SDS-PAGE分析

取重组菌株摇瓶发酵4～10 d上清液用于SDSPAGE蛋白电泳，结果如图8所示。箭头所指为重组脂肪酶蛋白条带，约为37.0 ku。

图5 pSZHA6R-AnlipA黑曲霉重组转化子PCR酶切鉴定结果 Fig.5 Single enzyme digestion result of identification pSZHA6R-AnlipA recombinant transformants by PCR

图6 pSZHA6R-2AlipA黑曲霉重组转化子PCR酶切鉴定结果 Fig.6 Single enzyme digestion result of identification pSZHA6R-2AnlipA recombinant transformants by PCR

图7 CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）和 CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）荧光定量PCR结果 Fig.7 Transcription level of CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）and CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）

图8 重组脂肪酶菌株SDS-PAGE蛋白电泳 Fig.8 SDS-PAGE of recombinant AnlipA strains

2.7 重组脂肪酶酶活检测

将重组菌株摇瓶发酵，取4～10 d上清液测定脂肪酶活性（见图9）。重组菌株CICC2462（pS⁃ZHA6R-AnlipA），CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）在第8天达最高酶活性，分别为1 120 U·mL-1，1 480 U·mL-1。至第9天由于培养基中营养物质消耗和次级代谢物大量积累，发酵条件不适合菌体分泌蛋白，故酶活性下降。

图9 CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）与CICC2462（pSZHA6R-2 AnlipA）4～10 d酶活检测结果 Fig.9 Enzyme activities of recombinant AnlipA strains at 4-10 d

2.8 重组脂肪酶最适pH

取重组脂肪酶菌株CICC2462（pSZHA6R-2An⁃lipA）发酵表达量最高第8天发酵液，分别在pH 4～11条件下作酶活检测，结果如图10所示。pH为6时重组脂肪酶酶活最高，确定该脂肪酶最适pH为6，酶活为2 135 U·mL-1，且该重组脂肪酶在pH 6～7时酶活较高。随pH增高，酶活迅速下降，pH＞9时酶活趋于平稳但已丧失大部分活性。

[11] 李杰,吴婷,马南,等.白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达[J].东北农业大学学报,2016,47(5):29-35.

2.9 重组脂肪酶最适温度

取重组脂肪酶菌株CICC2462（pSZHA6R-2An⁃lipA）发酵表达量最高第8天发酵液，分别在25～55℃作酶活检测，见图11。温度为35℃时，重组脂肪酶酶活最高，即35℃为该脂肪酶最适温度，且在25～45℃酶活均较高，说明其适合温度范围较大。

图10 CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)在不同pH下酶活检测结果 Fig.10 Enzyme activities of CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)at different pH

图11 CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)在不同温度下酶活检测结果 Fig.11 Enzyme activities of CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)at different temperature

3 讨论与结论

黑曲霉作为食品级安全受体菌株可分泌大量同源和外源蛋白，对分泌蛋白作正确翻译后修饰，发酵产物安全。研究利用黑曲霉表达系统分泌表达AnlipA基因转录水平，结果表明，摇瓶发酵后含2个拷贝AnlipA重组菌株最高酶活力达1 480 U·mL-1，比1拷贝重组菌株最高酶活力提高32%。与林俊涵等研究结果相符，证明增加目的基因拷贝数可增强转录水平，提升目的基因表达产量[19-21]。但与Vas⁃sileva等结果不同，2拷贝酶活力未呈线性增加，仅为1拷贝1.32倍[22]，推测可能是引入多拷贝正调控元件强启动子和过多基因拷贝数引发调控蛋白滴定效应[23]，在其他整合位点引入正调控蛋白amyR与目的基因共表达是解决问题有效途径[24]。另一方面也可能因过大基因剂量，使内质网中发生部分非折叠蛋白响应[25-26]，蛋白表达量下降、平稳或增加幅度减缓，加入具有协同作用辅助因子，可能是降低或消除负反馈作用手段之一[27]。

发酵上清液和2×protein loading buffer按1∶1比例混合，加热煮沸10 min。SDS-PAGE，用5%浓缩凝胶和12%分离凝胶对样品处理。加考马斯亮蓝R-250染液过夜染色后，再作1～2 h脱色处理。

激活函数的函数值选择在闭区间[0, 1]之间，是因为这个神经元主要的任务是“做决策”；而对于一些更复杂的情况，我们要求神经元不仅能够进行决策，而且能够输出实数值。为此，我们会引入一个递归的线性函数：

企业在评价经营状况时通常采用的是利润总额或净利润，传统会计利润只考虑了有息负债部分成本，对于股权资本成本的影响未予考虑，通常情况下传统会计利润的结果较经济增加值要高。

实验室建立黑曲霉表达系统中，将目的基因整合到高表达asAA基因整合位点，在分泌目的蛋白同时也产生大量背景蛋白，主要包括葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，且目的蛋白与背景蛋白均由amyR基因调控[17]，在amyR表达转录因子一定情况下，目的蛋白与背景蛋白存在竞争关系，故敲除背景蛋白，会相应减少或解除竞争机制，间接增加目的基因表达。后续研究将敲除葡糖淀粉酶和α-淀粉酶基因，以利目的蛋白高效表达，提高目的蛋白纯度、减少生产成本；同时利用RSM统计学方法，优化接种量、培养温度，发酵时间等条件，提高脂肪酶表达量[30]。

试验采用多拷贝脂肪酶基因表达框策略构建黑曲霉重组菌株CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）和CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）。结果表明含2个拷贝AnlipA较含1拷贝AnlipA黑曲霉转化子表达量有所提高。研究为黑曲霉高效表达重组蛋白提供有效途径，为食品级黑曲霉脂肪酶工业化生产提供工程菌株。

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第一，通过立法，禁止科技涉足特定的领域。由于部分科技可能造成伦理危机或者危害人类健康，因而法律禁止科技工作者涉足该领域。比如，克隆技术的发展，引发了人们对伦理危机的担忧，于是很多国家立法，禁止任何人进行克隆人的研究。比如，英国、美国、澳大利亚及欧盟等都有对克隆人的限制性规定。

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普通公众使用版本的ArcGIS产品中功能比较繁杂；进行符号化时需要对每一个海图要素人工选择符号及配置注记等，制作过程不便捷。因此应该对ArcGIS平台进行二次开发，实现海图数据转换、自动符号化、自动图廓整饰等功能并将其模块化封装，使用COM技术以插件的方式整合至ArcGIS Desktop中。

农村的教育一定要进步，才能赶得上城市教育的步伐，要学习先进的教育系统，才能让农村的学校和班级有进一步的提高和发展，具有强大凝聚力的班级，才能让学生融入其中，提高学生学习效率，培养学生培养健康、积极、向上的品德情操。班级凝聚力的形成，因素是多方面的，作为教师，首先要提高自身的个人素养；其次，要善于建造平等和谐的班级；再次，要设立明确的班级奋斗目标；最后，可以以活动的方式提高班级凝聚力，最终促进班级凝聚力的形成。

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传统的课程考核方法主要是通过考试考核学生对理论知识的掌握程度,这种一次性的考核方法不能真正地反映出学生对所学知识的掌握程度及其专业应用能力,而一个良好的评价体系能够激起学生的学习兴趣和积极性。

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徐锴《系传》云：“犬善出卑户也”。张舜徽《约注》“卑户，谓僅容犬身以通出入之小竇（洞）也。湖湘旧俗，凡造室必于大门之旁穿壁为竇，以悲门闭而犬得由是而出入焉。形似户而实非户也。犬出入其间，必曲其身，因谓之戾。”

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