0　引言

高胆固醇血症是严重威胁人类健康的常见疾病之一，是导致心脑血管疾病的主要诱因，降低机体胆固醇含量是首选治疗方式［1］.调查数据显示［2］，在发展中国家患高胆固醇血症的人口呈现年轻化和快速递增趋势，通过辅助饮食手段是降低其高发率的有效途径.红米（Red rice）是一种药食两用的大米［3］，红米稻占我国有色稻米种植资源的第二位［4］.中医将红米誉为“药米”，具有滋阴补肾、健脾消食、生气血、清肝明目等功效［5-6］.红米营养价值高，口感软弹，富含花色苷、多酚、黄酮、生物碱和皂苷等活性物质［7］.据文献报道，红米具有抗氧化［8］、抗肿瘤［9］、降血脂［10］、抗炎［11］、抗动脉粥样硬化［12］和抗衰老［13］等功效.红米中的有效成分主要来源于麸皮，其中花色苷含量丰富，主要组分为矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-G）、芍药素-3-葡萄糖苷和二甲花翠素，是潜在的调节血脂物质［14-15］.

国内外研究主要聚焦红米的营养功效和抗氧化活性，尚缺乏红米对胆固醇消化吸收的研究报道.本研究优化了红米花色苷的制备提取条件，筛选了富集纯化花色苷的大孔树脂，采用体外胰脂肪酶抑制模型和胆汁酸微团溶解模型，分别探究红米花色苷提取物对胰脂肪酶活力和胆固醇在胆汁酸微团中溶解度的影响，为红米资源的综合深加工开发利用提供理论和实验支持.

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

红米：山西农业科学院；Cy-3-G、4-甲基伞形酮油酸酯：Sigma公司；胰脂肪酶、磷脂酰胆碱、牛磺胆酸钠、荧光标记胆固醇：生工生物科技有限公司；大孔树脂：宝恩化工有限公司；甲醇和乙腈（HPLC级）：Tedia公司；乙醇：国药集团化学试剂有限公司.

碾米机：长沙昌百世机械有限公司；电子天平、酸度计：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV1800紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；恒温磁力搅拌器：常州朗越仪器制造有限公司；旋转蒸发仪：上海精科仪器有限公司；荧光酶标仪：BioTek公司；高效液相色谱仪：Agilent 1260；色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，5 μm，4.6 mm×250 mm.

1.2　红米水提取物和乙醇提取物的制备

1.2.1　红米水提取物的制备

使用碾米机蜕皮得红米麸皮，粉碎过60目（250μm）筛，准确称取50.0 g，加入500 mL去离子水，调pH值至0.5，40℃条件下提取3 h，浓缩，冷冻干燥，避光保存.

有关WDR62在大脑发育过程中的功能和作用机制研究，以及WDR62基因突变如何导致小头畸形的致病机制尚不清楚。现有研究认为WDR62通过调控JNK1的活性参与脑发育过程中神经干细胞发育，敲除WDR62或JNK1的表达可引起神经干细胞发育的提前分化，神经元谱系建立及神经元迁移异常[5, 6]。

1.2.2　红米乙醇提取物的优化制备

如图2所示，为7种大孔树脂对红米花色苷的吸附量、解吸量和解吸率.树脂的吸附和解吸能力是筛选树脂的重要指标.由图2可见，大孔树脂HPD100对红米乙醇提取物的吸附量为（49.11±3.12）mg/g，解吸量为（33.86±1.96）mg/g，解吸率为（67.35±1.89）%.与其余大孔树脂相比较，同时具备较好的吸附和解吸率，因此选取苯乙烯型非极性大孔树脂HPD100作为红米花色苷的富集树脂.

1.2.3　总花色苷含量的测定（pH示差法）

总花色苷含量按公式计算：花色苷含量=［（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5］×M×a/ε×m.M：Cy-3-G分子量449.2 g/mol；a：稀释因子；ε：Cy-3-G摩尔消光系数26900 L/（mol·cm）；m：样品质量，g.

1.3　红米大孔树脂提取物的制备

1.3.1　筛选大孔树脂

流动相：A（0.01 mol/L磷酸缓冲液），B（乙腈∶0.01 mol/L磷酸缓冲液=8∶2），流速：1.0 mL/min，温度：30℃，进样量：20 μL，线性梯度洗脱30 min，检测波长：520 nm.

取20 μL盐酸缓冲液（pH值8.0），加入5 μL供试样品和25 μL胰脂肪酶（0.5 mg/mL）溶液，在37℃条件下孵育10 min后，加入50 μL 4-甲基伞形酮油酸酯（100 μmol/L），在37℃条件下反应30 min，测定荧光值（激发波长340 nm，发射波长460 nm），计算抑制率.

1.3.2　树脂静态吸附动力学曲线

准确称取0.1 g干重的最优大孔树脂，加入10 mL不同浓度（0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL）上述红米乙醇提取物，分别在不同温度（25℃、30℃、35℃）和150 r/min条件下吸附3 h，绘制树脂吸附等温曲线.

病株上的叶脉、叶柄及茎均有黑褐色坏死条斑，并发脆易折。感病初期叶片呈现斑驳花叶或有枯斑，以后背面叶脉坏死，甚至沿叶柄蔓延至主茎。主茎发病时产生褐色条斑，导致全叶萎蔫，但不脱落。重花叶病由Y病毒侵染引起。Y病毒既可以通过汁液机械传染，又可以通过蚜虫传染。

1.3.3　树脂静态吸附等温曲线

准确称取0.1 g干重的最优大孔树脂，加入10 mL上述红米乙醇提取物，在30℃和150 r/min条件下吸附不同时间（0 min、20 min、40 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、300 min），绘制树脂吸附动力学曲线.

1.3.4　乙醇体积分数对解吸的影响

准确称取0.1 g干重的最优大孔树脂，加入10 mL上述红米乙醇提取物，在30℃和150 r/min条件下吸附2.5 h，用去离子水冲洗至洗液无色，分别加入不同体积分数（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）乙醇溶液，在30℃和150 r/min条件下解吸3 h，测定解吸量，计算解吸率.

1.3.5　树脂动态穿流曲线和洗脱曲线

（2）加强流域水功能区监测统筹和监督监测，加强水功能区动态纳污能力核定、入河污染物总量统计等工作，按行政区提出更明确的限排总量意见。

1.3.6　HPLC检测Cy-3-G含量

采用静态吸附法，综合考察大孔树脂HPD80、HPD100、D101、HZ806、HZ816、S8和AB8对红米花色苷的吸附/解吸容量和解吸率，筛选最优大孔树脂.准确称取0.1 g各种干树脂，加入10 mL上述红米乙醇提取物，在30℃和150 r/min条件下吸附24 h，测定吸附量.用去离子水冲洗饱和树脂，加入10 mL乙醇溶液（75%，pH值0.5），在30℃和150 r/min条件下解吸24 h，测定解吸量，计算解吸率.

1.4　红米花色苷对胆固醇消化吸收的影响

1.4.1　红米花色苷抑制胰脂肪酶试验

4)通讯塔上布设的1套摄像仪，可以旋转云台、调焦查看矿区内各局部的情况，获取的影像信息用光纤接到塔上的中继点，再传输至办公楼顶中继点。雨量计布设在办公楼顶，监测数据直接用光纤接到搂顶中继点。

准确称取10.0 g湿重的最优大孔树脂，填入15 mm×400 mm玻璃层析柱，柱床体积15 mL，柱床高度12 cm，在流速1.0 mL/min的条件下，加入上述红米乙醇提取物，绘制穿流曲线，测定最优上样体积.采用最优上样体积对树脂进行饱和吸附，用30 mL去离子水冲洗，使用乙醇体积分数80%绘制洗脱曲线.

1.4.2　红米花色苷降低胆固醇微团溶解度试验

取180 μL荧光标记胆固醇溶液（荧光标记胆固醇0.5 mmol/L，磷脂酰胆碱0.6 mmol/L，牛磺胆酸钠6.6 mmol/L，氯化钠132 mmol/L），加入20 μL供试样品，在37℃条件下孵育30 min，13000 r/min离心20 min，取上清液，测定荧光值（激发波长462 nm，发射波长536 nm），计算胆固醇微团溶解度降低率.

2　结果与讨论

2.1　优化红米花色苷制备提取条件

  

图1　红米花色苷制备提取的单因素实验结果Fig.1 Single factor experimental results of extraction of anthocyanins from red rice

如图1所示，为红米花色苷制备提取的单因素实验结果.由图1（a）可见，提取红米麸皮中花色苷的最佳乙醇体积分数为75%.依据“相似相溶”原则，75%乙醇的极性与红米花色苷的极性相似，因此提取率最高.由图1（b）可见，当pH值为0.5时，红米花色苷提取率最高，表明酸性条件可以保持花色苷的稳定性，减少分解［15］.由图1（c）可见，提取温度为40℃时，红米花色苷提取率最高.当提取温度从30℃升至40℃时，花色苷稳定，未分解，提取率线性升高.当提取温度高于40℃时，花色苷稳定性差，发生分解，是提取率降低的原因［7］.由图1（d）可见，当提取时间为2.5 h时，红米花色苷提取率最高.在提取时间增至2.5 h时，提取率呈线性升高，但当提取时长超过2.5 h后，提取率反而下降，表明花色苷稳定性差，已发生分解［7］.由图1（e）可见，当料液比从1∶2降至1∶10时，红米花色苷提取率线性升高，虽然料液比继续降至1∶20时，提取率略有上升，但与料液比1∶10的提取率没有显著差异，基于节能环保的考量，选择1∶10为最佳料液比.由图1（f）可见，提取次数增加至3次时，红米花色苷提取率最高，当提取次数大于3次时，花色苷稳定性差，发生分解，提取率略有下降.

  

图2　不同大孔树脂对红米花色苷的吸附量、解吸量和解吸率Fig.2 Adsorption and desorption rates of red rice anthocyanins in different macroporous resins

2.2　建立红米花色苷大孔树脂富集提取工艺

2.2.1　大孔树脂筛选

准确称取1.0 g红米麸皮，分别按照不同料液比（1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）加入系列乙醇体积分数（55%、65%、75%、85%、95%），调节不同pH值（0.25、0.5、1、2、3），在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）条件下提取不同时间（1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h），检测不同提取次数（1次、2次、3次、4次、5次）后所得提取液的吸光度值，计算提取率.

2.2.2　HPD100大孔树脂静态吸附动力学研究

如图3所示，为HPD100大孔树脂静态吸附动力学曲线和静态吸附等温曲线.由图3（a）静态吸附动力学曲线可见，在0～20 min时，HPD100大孔树脂对红米花色苷的吸附量呈线性升高，吸附速率大.在20～60 min时，吸附速率逐渐降低，90 min时达到吸附平衡.由图3（b）静态吸附等温曲线可见，HPD100大孔树脂吸附能力随着红米花色苷乙醇提取物浓度的增大而增强，但随着温度的升高而减弱，表明HPD100大孔树脂静态吸附可能是放热过程［14］.

目前我国的个人信用制度的建立还不完善，对于个人信用很多时候还是依靠道德的约束，个人的无信用行为并不能受到严厉的惩罚。相关法制建设的不完善，法律责任明确不到位，导致一旦出现情况比较严重的信贷危机，给不了无信用的人合理的处罚。违信处罚力度不够，对个人就起不到震慑作用，个人信用违约就会增加。建立健全个人信用制度，减少个人住房贷款违约现象，对降低银行信贷危机的发生，从而降低房地产金融风险是十分必要的。健全的个人信用制度涵盖了个人信用调查、个人信用档案、个人信用监控与评估、个人信用账户等机制。另外，提高违信成本也是减少个人住房贷款违约，降低房地产金融风险的有效方式。

  

图3　HPD100树脂静态吸附动力学实验结果Fig.3 Experimental results of static adsorption kinetics of HPD100 resin

2.2.3　HPD100大孔树脂动态吸附与解吸动力学研究

如图4所示，为HPD100大孔树脂动态穿流曲线与动态洗脱曲线.由图4（a）动态穿流曲线可见，当上样体积小于120 mL时，HPD100大孔树脂完全吸附红米花色苷乙醇提取物.上样体积大于120 mL时，穿流率呈线性升高，至上样体积360 mL时，穿流率达100%.因此，选取穿流率小于10%的上样体积140 mL.由图4（b）可见，HPD100大孔树脂解吸率随着乙醇体积分数的增大而升高，80%以上乙醇体积分数的解吸率无显著差异，基于节能环保的考量，选择乙醇体积分数80%为洗脱剂.由图4（c）动态洗脱曲线可见，当洗脱剂乙醇体积小于10 mL时，花色苷含量较低.当洗脱剂乙醇体积从10 mL增加至30 mL时，花色苷含量较高.当洗脱剂乙醇体积大于30 mL后，花色苷含量趋于零.因此，选择收集10～30 mL花色苷含量较高的洗脱组分.由表1可知，经由HPLC分析检测，红米提取物中Cy-3-G的含量分别为：水提取物（2.39±0.21）%、乙醇提取物（8.92±0.78）%、树脂富集物（36.48±3.11）%.

首先，自然资源确权登记中调查工作粗放。自然资源范围包含多种类型，在确权登记工作中，只是简单粗放的进行整体登记，未进行细化登记，不利于自然资源统一确权登记工作开展和合理的资源利用管理。其次，权属来源资料缺失。由于历史原因，大量自然资源不具备充分的权属来源资料，并且与周边集体土地存在权属争议情况较多，权籍调查工作开展困难，进而无法开展确权登记工作。二是，缺少经费支持。自然资源确权登记工作量较大，由于历史资料较少，需要开展大量调查工作，但地方政府一般经济状况很难满足经费需求，造成部分确权登记工作进展缓慢。

  

图4　HPD100大孔树脂动态吸附与解吸动力学实验结果Fig.4 Experimental results of dynamic adsorption and desorption kinetics of HPD100 resin

 

表1　红米提取物中矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-G）的含量Tab.1 Contents of Cy-3-G in red rice extracts　%

  

C y-3-G含量水提取物2.39±0.21乙醇提取物8.92±0.78树脂富集物36.48±3.11

2.3　红米花色苷对胆固醇消化吸收的影响

2.3.1　红米花色苷对胆固醇消化的影响

如图5（a）所示，为红米花色苷对胰脂肪酶活力的抑制曲线.胰脂肪酶能够将甘油三酯水解为游离脂肪酸，游离脂肪酸、胆固醇与胆汁酸盐等形成乳糜微团，辅助胆固醇消化.降低游离脂肪酸的生成可以减少乳糜微团的形成，抑制胰脂肪酶的活力是有效方式［1，5］.由图5（a）和表2可知，红米花色苷提取物对胰脂肪酶均有抑制作用，红米水提取物、乙醇提取物、大孔树脂富集物对胰脂肪酶活力抑制的IC50（半数抑制率）分别为61.13 mg/L、30.11 mg/L、18.91 mg/L.上述结果结合表1可知，红米花色苷提取物对胰脂肪酶抑制作用与Cy-3-G的含量呈正相关剂量效应关系.

  

图5　红米花色苷对胆固醇消化吸收的影响Fig.5 Effects of anthocyanins from red rice on digestion and absorption of cholesterol

2.3.2　红米花色苷对胆固醇吸收的影响

如图5（b）所示，为红米花色苷影响胆固醇微团溶解度的实验结果.肠道中的胆固醇需要与游离脂肪酸、胆汁酸盐等形成乳糜微团，才能经由小肠细胞吸收.降低胆固醇在乳糜微团中的溶解度，是减少胆固醇吸收的有效途径［10，12］.由图5（b）可知，红米花色苷提取物均能降低胆固醇微团的溶解度.上述结果结合表1可知，红米花色苷提取物降低胆固醇微团溶解度的作用与Cy-3-G的含量呈正相关剂量效应关系.表明红米可以作为预防和降低机体胆固醇水平的药食两用资源.

 

表2　红米花色苷提取物抑制胰脂肪酶的IC50值Tab.2 IC50on pancreatic lipase for red rice extracts mg·L-1

  

I C 50树脂富集物18.91±1.73乙醇提取物30.11±2.89 C y-3-G 43.56±3.91水提取物61.13±5.84

3　结论

通过优化红米花色苷的制备提取条件（乙醇体积分数75%、pH值0.5、温度40℃、料液比1∶10、提取时间2.5 h、提取次数3次），建立了HPD100大孔树脂富集花色苷的最佳工艺（上样体积140 mL、温度25℃、吸附1 h、洗脱液乙醇体积分数80%、流速1.0 mL/min、洗脱体积20 mL）.经大孔树脂富集处理，Cy-3-G含量达（36.48±3.11）%.利用体外胰脂肪酶抑制模型和胆汁酸微团溶解模型，探讨了红米花色苷对胆固醇消化吸收的影响，结果表明，红米花色苷主要成分为Cy-3-G，对胰脂肪酶活力和胆汁酸微团溶解度均有抑制作用，抑制作用与Cy-3-G的含量呈正相关剂量效应关系.红米水提取物、乙醇提取物、大孔树脂提取物对胰脂肪酶活力抑制的IC50分别为61.13 mg/L、30.11 mg/L、18.91 mg/L.红米花色苷影响胆固醇消化吸收和调节血脂的作用机理仍需要进一步研究.

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