0　引言

绿色、资源可再生是当前经济社会各行业发展的趋势和追求的目标.固定化酶使用某种载体将酶限制在一定区域但其特有催化能力仍保留，反应后酶可回收重复利用［1］.在酶研究和应用领域，固定化酶由于具有可回收优势越来越得到生物柴油等新能源工业生产的青睐［2］.固定化酶的性能受固定方法影响，也与所用载体材料密切相关，因此高效固定化酶开发需要选择合适的固定化方法和载体材料［3］.寻找廉价易得的固定化载体、开发高效便捷的固定化方法、探索固定化机理问题成为当前固定化酶研究的热点.我国蚕茧产量一直稳居世界首位［4］，蚕丝在我国纤维纺织方面已有五千多年的应用历史［5］.蚕丝是一种极具吸引力的高性能天然蛋白纤维骨架材料，其表面存在丰富的化学活跃基团如氨基、羧基、巯基和羟基等，使蚕丝拥有众多可用的共价交联“接口”［6］，方便根据目标蛋白质的性质选择适宜的交联方式.在利用氨基或羧基开展的蚕丝与蛋白质的交联固定化研究中，可采取戊二醛（GA）活化蚕丝表面的氨基后与蛋白质交联固定［7］，也可用1-乙基-3-（3-二甲基丙基）碳化亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）联合活化蚕丝表面的羧基后将蛋白质交联于其上［8-9］.另外还可以综合应用GA和EDC/NHS两种方法使蚕丝表面的氨基和羧基都参与酶的交联，以达到增加蛋白载荷量，提高固定化酶活力的目的［10］.

利用桑蚕丝纤维表面的氨基和羧基通过共价交联将脂肪酶Lip2固定到蚕丝表面，研究交联剂对桑蚕丝与Lip2交联效果的影响，并检测固定化脂肪酶的各项催化性质，评估该方法的应用效果.本研究的结果为扩展广西桑蚕茧特色资源高附加值应用提供了新思路.

1　材料与试剂

1.1　实验材料

所用脂肪酶为本实验室构建的重组毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌表达的解脂耶氏酵母（Yarrowia li⁃polytica）脂肪酶Lip2.蚕丝购自浙江省嘉兴市当年产天然精干茧.N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）及1-乙基-3-（3-二甲基丙基）碳化亚胺盐酸盐（EDC）为北京鼎国生物技术公司产品，4-硝基苯基月桂酸酯（p-NPL）为美国Sigma Aldrich公司产品，Bradford蛋白浓度测定试剂盒和His-tag purification resin为上海碧云天生物技术有限公司产品，戊二醛（GA）等试剂均为国产分析纯试剂.

1.2　主要仪器

TD6M低速离心机（湖南湘立科学仪器公司）、MIKRO200高速离心机（德国Hettich公司）、Infinite F50酶标仪（瑞士Tecan公司）、JJI24BC电子分析天平（常熟市双杰公司）、SY11-K恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），以及PHS-3C酸度计（上海晶磁仪器公司）.

2　实验方法

2.1　制备及活化蚕丝载体

参考文献［10-11］并调整方案如下：称取3.5 g蚕丝剪成2 mm小段，在NaCl/1%溶液中煮沸1 h除去蚕丝表面丝胶.抽滤晾干，在55oC下使用交联剂活化：1）加入EDC/NHS（1∶1/（10 mg·L-1））混合溶液；2）加入GA/5%溶液；3）加入EDC/NHS（1∶1/（10 mg·L-1））和GA/5%等体积混合溶液，活化处理1 h.抽滤至干，30oC鼓风烘干，4oC保存待用.

2.2　脂肪酶发酵生产

按照Invitrogen公司手册配制培养基及发酵［12］.取本实验室构建的分泌表达解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的毕赤酵母P.pastoris HL菌株经1%甲醇诱导培养5 d，菌液6000 r/min离心5 min，上清液（粗酶液）4oC保存待用.

2.3　固定化脂肪酶的制备

结合固定化酶活力分析，Lip2（EDC/NHS+GA）固定的酶蛋白最多（0.140 mg·g-1），但酶活力并不突出（0.7 U·g-1，比酶活为5 U·mg酶蛋白-1），而Lip2（GA）固定的酶蛋白量（0.005 mg·g-1）和酶活力均最低（0.53 U·g-1）但其比酶活最高（106 U·mg酶蛋白-1）.Lip2（EDC/NHS）固定的酶蛋白量居中（0.084 mg·g-1），但酶活力最高（1.06 U·g-1），酶蛋白固载率（59%）与同样用EDC/NHS在蚕丝上交联固定胆固醇氧化酶的报导（70%）基本一致［16］.Lip2（EDC/NHS+GA）几乎固定了溶液中所有的酶蛋白分子（固载率98%），但其酶活力只略高于Lip2（GA）（固载率3.5%），而比酶活仅达Lip2（GA）的4.7%，说明Lip2（EDC/NHS+GA）上虽然固定的酶蛋白量多，但是酶的催化活力受到抑制.原因可能是蚕丝单位表面交联的Lip2分子过多，空间位阻影响了酶分子的活性中心形成最佳构象，从而导致酶催化活性降低；此外单个酶分子的不同部位可能与蚕丝发生多点交联，降低了酶分子的柔性，也影响酶活力发挥.具体原因有待进一步探索.

2.4　酶蛋白纯化与定量分析

酶催化反应的环境pH值和温度是影响酶催化能力最基本、最重要的两个参数.适宜的pH值可维持酶的高级结构及结合部位、催化部位的关键可解离基团处于最佳状态，也有利于底物和中间复合物处于最适于反应的解离状态.适宜的温度则有利于催化反应在底物分子活化及酶分子热变性间达到平衡.固定化后，酶的最适pH和温度受到载体和固定方式影响会发生变化，如图3所示.

2.5　固定化酶活力测定

茉心接过簪子放在妆台上，又替晞月将鬓边的白色绢花和珍珠压鬓摘下，笑道：“小主天生丽质，哪怕是簪了乌木簪子，也是艳冠群芳。何况这镯子虽然一样都有，小主戴着就是比青福晋好看。”

2.6　固定化酶的最适pH与最适温度测定

配制pH值不同的缓冲液，经pH酸度计测得准确pH值（7.17、7.58、8.05、8.52、9.02、9.48），在45oC下测定酶活力.在最适pH条件下，分别在不同温度（25oC、30oC、35oC、40oC、45oC、50oC、55oC、65oC）条件下测定酶活力［15］.

反应体系总体积 1 mL，含固定化酶 0.010 g（±0.004 g）、17 μL p-NPL/（5 mmol·L-1） 底物溶液、985 μL pH7.50 Tris-HCl/（50 mmol·L-1）缓冲液.反应体系（除底物外）混匀后在恒温水浴中预热5 min，加入底物溶液混匀后进行反应10 min.放入冰水中冷却，立即用酶标仪测A405吸光值，每个样品平行测定3组取平均值［14］.酶活力定义为在一定条件下，1 min催化底物水解产生1 μmol p-NP所需的酶量.

2.7　金属离子浓度对固定化酶活力的影响

用最适 pH 的缓冲溶液配制浓度分别为 0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.15 mol·L-1、0.20 mol·L-1、0.25 mol·L-1的CaCl2溶液、KCl溶液和Tris-HCl缓冲液，在最适温度下测酶活力.

（5）成为欧盟简化科研计划行政流程的典范，统一的在线计划项目受理平台和经费资助规则大大降低了行政管理成本和申请者的负担。

2.8　固定化酶稳定性

3) CTV不具备储油功能，但能航行，能调配到邻近的FPSO所在位置或其他海域作业，具有强大的动力定位能力，与FPSO之间无缆绳连接，与常规油船之间采用单点系泊，通过油管卸油。

热稳定性：在最适pH缓冲液中60oC恒温保温，每隔50 min取样在最适温度下测定酶活力.重复使用稳定性：将固定化酶在最适pH、最适温度条件下测酶活力，完成后用最适pH的Tris-HCl缓冲液洗涤固定化酶3遍后再重测酶活力，共重复6次.

3　结果与讨论

3.1　固定化酶的酶固定量及酶活力

通过蛋白含量和酶活力检测分析比较了3种交联方式固定的酶的情况（图1）.经蛋白含量分析，用于交联固定的30 mL发酵液含0.143 mg Lip2酶蛋白.3种交联方式中，Lip2（GA）固定的酶蛋白量最低（0.005 mg，固载率3.5%）而Lip2（EDC/NHS+GA）固定的酶蛋白量最高（0.140 mg，固载率98%）.GA交联利用了蚕丝表面的-NH2基团，EDC/NHS交联则利用-COOH基团（图2）.经查询Genbank中家蚕（Bombyx mori）丝素蛋白的3种主要蛋白（AAL83649、NP001106733和CAA27804）成熟肽氨基酸序列并统计得知，它们共具有57个侧链含-NH2的Arg和Lys残基，及98个侧链含-COOH的Glu和Asp残基.因此GA能交联固定的酶蛋白量相对较低，而利用了-NH2和-COOH的EDC/NHS+GA交联方式固定的酶蛋白量最高.

  

图1　不同交联剂固定的酶蛋白量及酶活力Fig.1 The enzymes amount immobilized by different cross-linking agents and their activity

  

图2　蚕丝用GA或EDC/NHS活化及与酶的共价交联Fig.2 Silk activation by GA or EDC/NHS and covalently linked with enzyme

称取（1.00±0.03）g活化蚕丝，加入30 mL粗酶液，25oC下300 r/min搅拌3 h.抽滤，用pH7.36磷酸缓冲液洗涤3次，再用水洗涤3次，抽干［13］.所得固定化酶在4oC下用硅胶干燥.

华堂村的桃形李种植仍沿袭一家一户在自家土地上各自种植、各自养护管理、各自销售的传统生产方式，基本没有相应的种植和养护设施，雨、旱、冰、霜都会给桃形李种植带来严重影响；没有统一的产前、产中、产后服务，养护管理粗放，生产水平落后，工效低，成本高.特别是病虫害防治也是每家每户各自购药、施药，没有统一的操作方式与方法，既影响防治效果，还出现了成品果农药残留量难以控制的问题.

本研究制备的3种固定化酶的酶蛋白固载量与某些研究报道结果相比偏少［17］：一方面是所用粗酶液的酶含量较低（仅5 mg·L-1），可通过优化发酵工艺、筛选高产重组菌株等加以改善；另一方面与所用蚕丝颗粒较大、颗粒结构致密有关.Cestari等［18］应用静电纺丝制备交联固定肝素的蚕丝纳米纤维以及Wang等［19］利用溶解的蚕丝纤维与酶蛋白混合制备纳米级固定化酶颗粒都对所固定的目标蛋白具有较高固载效率.因此从提高酶液的浓度、使用更小的蚕丝颗粒和适当增加蚕丝颗粒的纤维间隙等方面着手优化酶的固载能力，可预期能获得效果更好的蚕丝固定化酶.

收入的样本数据目标是32例行髋关节置换的老年糖尿病患者，该次实验分组研究依据是不同护理干预模式，一组入组患者16例，参照组，男性患者和女性患者之间比例是8:8，年龄范围在61～82岁间，中位年龄数值（70.52±5.55）岁，最长病程20年，最短病程2年，中位病程（10.54±1.98）年；实验组，男性患者和女性患者之间比例是9:7，年龄范围在62～83岁间，中位年龄数值（71.55±6.01）岁，最长病程 19年，最短病程 1年，中位病程（10.01±3.22）年。验证对比实验组与参照组行髋关节置换的老年糖尿病患者一般资料，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2　固定化酶的最适pH和温度

分别分析粗酶液及制备固定化酶后残液中的蛋白质含量.使用His-tag Purification Resin试剂盒取1 mL样液进行纯化，洗脱液体积为60 μL.取5 μL洗脱液使用Bradford试剂盒定量分析蛋白含量，平行测量3次.

皖河石牌站1965～2010年的46年间，80%年份径流量波动在2.0×108 m3/年～5.0×108 m3/年。特大洪水年份石牌站年径流量在5.0×108 m3以上。年径流量在2.0×108 m3以下时对应干旱年。皖河石牌站典型丰水年(1996年)月径流量变化，最高值出现在7月，发生了大洪水；全年径流量54.44×108 m3,7月径流量最大为1 250 m3/s，相当于最小月径流量的90倍。由此可见，暴雨是洪水形成的主因。

  

图3　酶促反应的最适pH值及最适温度Fig.3 Optimum pH value and temperature of the enzymatic reactions

图3（a）显示游离酶Lip2的最适pH值为7.58，固定化酶Lip2（EDC/NHS）、Lip2（GA）、Lip2（EDC/NHS+GA）的最适pH值都为8.03，说明酶经过固定后最适pH值偏高了约0.5.Dong等［20］的研究结果与本研究类似，其在SDS插层修饰和三乙氧基硅烷表面修饰的MgAl-LDHs表面上固定解脂假丝酵母脂肪酶，发现固定后的脂肪酶最适pH值比游离酶向碱性方向偏移0.5.同样的现象在壳聚糖固定的脂肪酶上也被发现［15，21］.另外，Lip2（EDC/NHS+GA）表现出比Lip2（GA）和Lip2（EDC/NHS）及Lip2对碱性环境更强的耐受性.在最适温度方面，Lip2、Lip2（GA）、Lip2（EDC/NHS+GA）都为40oC，而Lip2（EDC/NHS）的最适温度为50oC（图3（b））.温度上升至55oC时所有酶的活力都显著降低，说明此温度下酶蛋白热变性明显.赵兴秀等［22］在脂肪酶固定化及其催化生物柴油研究中发现，脂肪酶固定前后最适温度没有发生改变，且40oC时达到最高酶活.本研究发现Lip2（EDC/NHS）的最适温度为50oC，为今后进一步探索提供了有价值的线索.相比较而言，Lip2（GA）对温度变化较敏感，而Lip2（EDC/NHS+GA）表现出对温度适应性较好.综合最适pH研究结果，说明EDC/NHS+GA方式固定化酶可能在酶的pH适应性和耐热性方面具有优势.

3.3　离子浓度对固定化酶活力的影响

很多酶的活性中心都需要特定金属离子作为辅因子.金属离子在提高水的亲核攻击能力、通过静电作用屏蔽负电荷、稳定催化反应中形成的负电荷促使底物进入过渡态、帮助底物进行定向以及作为氧化还原酶的电子传递中间物等方面发挥重要作用.但金属离子浓度过高也会影响酶的活力发挥，因此探索酶在特定反应中所需的金属离子及其最佳浓度是极有应用价值的.研究结果表明（如图4所示），在K+浓度达到最适激活浓度之前，各酶的相对酶活力都随着K+浓度的增大而增大.Lip2的最适K+浓度为0.15 mol·L-1，而固定酶的最适K+浓度为0.1 mol·L-1.达到最适激活浓度后，随着K+浓度的增大，固定化酶的相对酶活力受到抑制.游离酶的K+最适激活浓度高而固定酶的K+最适激活浓度低，说明经过固定后酶对K+的激活作用更敏感.与K+低浓度激活、高浓度抑制的情况不同，Ca2+在0.05 ～ 0.25 mol·L-1浓度范围内无论对游离酶还是固定酶都表现出促进作用.对Bohai sea-9145重组脂肪酶固定化研究中发现，Ca2+对脂肪酶固定前后起到促进作用，而K+在一定浓度范围起到促进作用，浓度过高后转为抑制作用［23］，与本研究结果类似.另外由于使用K、Ca的盐酸盐配制不同浓度的K+、Ca2+溶液进行研究，且同等浓度下的K+和Ca2+溶液中Cl-含量差别很大.为了判断不同浓度Cl-是否会对酶活力有影响，配制了不同浓度的Tris-HCl缓冲液进行检验.结果显示Cl-浓度的变化对各酶的酶活力影响很小，可认为Cl-含量高低不影响K+、Ca2+对脂肪酶的活力的作用.

  

图4　离子浓度对固定化酶活力的影响Fig.4 Effect of ionic concentration to the activity of immobilized enzymes

3.4　固定化酶的稳定性

固定化酶相比游离酶的最大特点是酶制剂稳定性提高，且方便重复回收使用.对游离酶和3种固定化酶的热处理实验结果显示（如图5所示），随着60oC保温时间的增加，各酶的活力都呈降低趋势.保温时间150 min时除了Lip2（GA），其余酶的活力损失都超过50%.Lip2（GA）的变化趋势较缓，在250 min时相对酶活还残留43%，表现出相对较好的热稳定性.程媛媛等［10］在以天然纤维织物为载体固定化脂肪酶研究中也发现，使用GA活化的固定化酶其热稳定性比其他方法的稳定性好.固定化酶的重复使用性方面，3种固定化酶都表现出具有一定的可重复使用能力，不过他们的相对酶活力都随着重复使用次数的增多而降低.其中，Lip2（GA）重复使用的效果最差，而Lip2（EDC/NHS+GA）重复使用性相对最好.该结果的原因可能是EDC/NHS+GA方式固定的酶蛋白较多，与酶蛋白的交联也比较牢固.重复使用过程中Lip2（EDC/NHS+GA）部分酶蛋白丢失后，可能缓解了原来的空间位阻反而有利于剩余酶蛋白活性发挥；另外，酶蛋白的丢失率也低于采用EDC/NHS或GA方式交联固定的酶制剂，因此表现为酶活力减少的程度优于其他两种固定化酶.

  

图5　固定化酶的热稳定性和重复使用性分析Fig.5 Assay of the thermostability and re-use characteristic of the immobilized enzymes

4　结论

1）以蚕丝纤维为载体交联固定脂肪酶Lip2，采用EDC/NHS与GA联合交联制备的固定化酶，其酶蛋白载量高，酶的pH、温度适应范围宽、重复使用性好，但比酶活力低；采用GA交联固定的酶蛋白载量低，但比酶活力高、热稳定性较好.

2）3种交联固定化酶最适pH值都为8.03；Lip2（EDC/NHS）的最适温度为50oC，Lip2（GA）以及Lip2（EDC/NHS+GA）的最适温度为40oC；0.10 mol·L-1的K+对固定化酶激活作用最强，Ca2+在0.05～0.25 mol·L-1范围内对固定化酶都具有一定激活作用，而Cl-浓度对固定化酶的酶活力无明显影响.

参考文献

［1］DATTA S，CHRISTENA L R，RAJARAM Y R S.Enzyme immobilization：an overview on techniques and support materials［J］.3 Biotech，2013，3（1）：1-9.

［2］SOLER L，ILLANES A，WILSON L.Immobilization of Alcaligenes sp.lipase as catalyst for the transesterification of vegetable oils to produce biodiesel［J］.Catalysis Today，2016，259（1）：177-182.

［3］李勤.固定化技术在食品工业中的应用和发展研究［J］.四川食品与发酵，2006（4）：16-19.

［4］徐劲.中国丝绸协会召开2015全国茧丝绸产销形势座谈会［J］.江苏丝绸，2015（3）：55.

［5］谢松杨.桑蚕丝无缝针织物的结构与性能研究［D］.杭州：浙江理工大学，2016.

［6］MCGILL M，COBURN J M，PARTLOW B P，et al.Molecular and macro-scale analysis of enzyme-crosslinked silk hydrogels for rational biomaterial design［J］.Acta Biomaterialia，2017，63：76-84.

［7］屠洁，刘冠卉.家蚕丝素固定化单宁酶的研究［J］.中国酿造，2010（7）：130-132.

［8］唐荣华.京尼平交联磁性壳聚糖微球的制备及酶的固定化［D］.长沙：湖南师范大学，2013.

［9］ELAHI M F，GUAN G P，WANG L，et al.Influence of layer-by-layer polyelectrolyte deposition and EDC/NHS activated hepa⁃rin immobilization onto silk fibroin fabric［J］.Materials（Basel），2014，7（4）：2956-2977.

［10］程媛媛，陈必强，谭天伟.以天然纤维织物为载体固定化脂肪酶［J］.北京化工大学学报（自然科学版），2008，35（6）：71-74.

［11］明津法，刘蓉，张焕相，等.EDC/NHS交联改性再生桑蚕丝素纳米纤维［J］.高分子材料科学与工程，2012，10：162-165，169.

［12］“Pichia Expression Kit”User Guide［M/OL］.（2014-01-15）［2017-10-01］.K1710-01.https：//www.thermofisher.com/order/catalog/product/K171001？SID=srch-srp-K171001.

［13］MUKHERJEE J，MAJUMDER A B，GUPTA M N.Adding an appropriate amino acid during crosslinking results in more stable crosslinked enzyme aggregates［J］.Analytical Biochemistry，2016，507：27-32.

［14］邱玉龙，邓冬梅，潘淑兰，等.解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2与疏水蛋白SC3融合表达及催化性质［J］.食品与发酵工业，2016，42（9）：21-26.

［15］邱玉龙，邓冬梅，韦扬辉，等.壳聚糖微球固定化脂肪酶催化性质研究［J］.广西科技大学学报，2016，27（1）：93-98.

［16］SAXENA U，GOSWAMI P.Silk mat as bio-matrix for the immobilization of cholesterol oxidase［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162（4）：1122-1131.

［17］杨光.脂肪酶固定化的新方法研究及其应用［D］.杭州：浙江大学，2009.

［18］CESTARI M，MULLER V，RODRIGUSE J H S，et al.Preparing silk fibroin nanofibers through electrospinning：further hep⁃arin immobilization toward hemocompatibility improvement［J］.Biomacromolecules，2014，15（5）：1762-1767.

［19］WANG P，QI C L，YU Y Y，et al.Covalent immobilization of catalase onto regenerated silk fibroins via tyrosinase-catalyzed cross-linking［J］.Applied Biochemistry Biotechnology，2015，177（2）：472-485.

［20］DONG L J，GE C L，QIN P Y，et al.Immobilization and catalytic properties of Candida lipolytic lipase on surface of organic intercalated and modified MgAl-LDHs［J］.Solid State Sciences，2014，31（5）：8-15.

［21］GOMES F M，PEREIRA E B，DE CASTRO H F.Immobilization of lipase on chitin and its use in nonconventional biocatalysis［J］.Biomacromolecules，2004，5（1）：17-23.

［22］赵兴秀，何义国，赵长青，等.脂肪酶固定化及其催化生物柴油研究［J］.食品研究与开发，2015，36（22）：159-164.

［23］冉凡娇.Bohaisea-9145重组脂肪酶发酵条件优化、制备及固定化酶研究［D］.上海：上海海洋大学，2016.