流溪河流域是广州市饮用水的主要水源地之一，近年来，随着工业、城市污水以及周边畜禽养殖业污染的加剧，排放到流溪河水域中的可溶性无机氮含量严重超标，产生了水体富营养化等诸多问题[1]。反硝化作用作为生态系统中氮素循环的关键步骤，对水体中氮素的循环降解起着重要的调控作用[2]。因此，研究反硝化作用的过程及相关的微生物机制对缓解河流生态系统中的富营养化至关重要。

反硝化作用是指反硝化细菌还原硝酸盐，将其逐步转化为气态氮或氮氧化物的过程，主要由硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、NO还原酶和N2O还原酶4种酶催化完成[3]。其中亚硝酸还原酶为关键限速酶，主要由nirS和nirK基因编码合成[3-4]。这2个基因经常被用作标志基因来研究环境中的反硝化作用，据报道在河流生态系统中nirS基因比nirK基因分布更广泛，更适合用于沉积物中反硝化作用的研究[5-8]。

本文以反硝化细菌亚硝酸还原酶的nirS基因作为标志基因，构建基因文库对流溪河流域沉积物中反硝化细菌的群落结构和多样性进行分析，结合实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)对反硝化细菌的丰度进行研究，并通过主坐标分析和冗余度分析等多变量统计分析方法研究反硝化细菌的群落结构、丰度与环境因子之间的相关性，探讨不同采样点反硝化细菌群落结构的差异性，了解反硝化细菌对环境因子的响应机制，为流溪河生态系统中氮素循环研究提供科学依据。

3) 紧急停车功能。当发生紧急情况需立即停车时，按下“紧急停车”按钮，输出故障停车信号至遥控控制模块、LCU和DCU控制主机停机，同时直接控制燃油泄放阀动作，确保主机快速停止转动。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验在流溪河干流及支流上选取了10个采样点，从上游向下游依次标记为：水库(1–SK)、温泉 (2–WQ)、绿道–3(3–LD3)、绿道–2(4–LD2)、绿道–1(5–LD1)、良口 (6–LK)、从化 (7–CH)、钟落潭(8–ZLT)、人和 (9–RH)、南岗 (10–NG)(图 1)。使用自制的底泥采样器，在各个采样点采取水底表层(0～5 cm)的沉积物，采集后立刻放入无菌自封袋内，用干冰低温保存。每个采样点采集沉积物样品1 kg左右，返回实验室后保存于–80℃超低温冰箱。

1.2 方法

1.2.1 理化性质测定 水温及pH采用便携式通用测量仪Multiline P4在现场进行测量，底泥中化学需氧量 (Chemical oxygen demand，COD)、氨氮)、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮)和总氮 (Total nitrogen，TN)含量均参考中华人民共和国国家标准进行测定分析(表1)。COD、 和 TN 分别参照 GB11914—89、LY/T1231—1999 和 LY/T1228—1999/3 进行测定； 和参照HJ501—2009及HJ/T84—2001进行测定。

通过与NCBI数据库nirS序列比对，发现流溪河沉积物中大多数nirS序列与已知的反硝化细菌亲缘关系较远，与数据库其他环境样品中的nirS序列有较高相似性(图2)。根据邻位相接法构建系统进化树，将所有序列分成6簇，第1簇与γ–变形菌纲的产黄杆菌属Rhodanobacter有较高相似性；第2簇与α–变形菌纲的副球菌属Paracoccus以及Polymorphum gilvum的菌株SL003B–26A1有较高相似性；第3簇与β–变形菌纲的草螺菌属Herbaspirillum和陶厄氏菌属Thauera有较高相似性。其他簇序列没有亲缘关系较近的已知物种。

  

图 1 采样点分布Fig. 1 Location of sampling sites in the Liuxi River

1.2.2 流溪河沉积物宏基因组DNA提取 流溪河各采样位点沉积物样品的宏基因组DNA，采用强力土壤®DNA提取试剂盒(PowerSoil® DNA Isolation Kit，USA)提取，每个位点采集3个平行样，使用FD–1E–50型真空冷冻干燥机(Bilon)冻干，3个平行样混匀后称取0.25 g干土样品进行DNA提取。将提取的DNA用NanoDrop核酸蛋白仪测定浓度及质量，置于–20℃冰箱保存。

1.2.3 nirS基因PCR扩增 使用cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)和 R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)作为 nirS 基因序列PCR扩增的引物序列[9]。PCR反应程序为：95℃预变性 2 min；95 ℃ 变性 30 s，53 ℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min，35个循环；72 ℃ 延伸 10 min。PCR扩增产物用10 g·L–1的琼脂糖凝胶电泳进行检验，目的条带大小在420 bp左右。

编辑部新一轮的聚餐大会轰轰烈烈地来啦！主编大大照例征求众编意见，但貌似众编很齐心呀，不要问我们吃什么，就问我们吃辣还是不吃辣……但好像就算问了，众编吃辣三观不乱倒啊！

1.2.5 nirS基因丰度RT-qPCR分析 nirS基因实时荧光定量采用绝对定量法，利用iQ5(Bio-Rad，USA)仪器测定分析。按照“1.2.4”方法进行nirS基因克隆，筛选阳性克隆子，挑取单菌落培养，采用质粒小提试剂盒(E.Z.N.A® Plasmid Miniprep Protocol，Omega)提取质粒。通过10倍稀释法将阳性克隆质粒稀释成6个浓度梯度，每个梯度设置3次重复，并设置阴性对照组，以不同浓度标准品作为模板进行RT-qPCR反应，绘制nirS基因荧光定量PCR标准曲线。引物序列与“1.2.3”相同。反应体系为 20 μL:10 μL 荧光染料 SYBR Premix Mix Ex Taq Ⅱ，0.8 μL 上、下游引物 (10 μmol·L–1)，7.4 μL ddH2O，1 μL 模板 DNA。反应条件为：94 ℃ 2 min(酶启动)；95 ℃ 预变性 30 s，57 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸45 s (36个循环，前6个循环退火温度每个循环降低1 ℃，后30个循环退火温度为52 ℃)；72 ℃延伸 10 min，最后以 0.1 ℃·S–1速率从 65 ℃ 升至95 ℃。nirS基因荧光定量PCR标准曲线的相关系数R2=0.995 2，扩增效率为109%。

1.2.6 数据处理 采用MOTHUR软件对所有测序的nirS基因序列作OTU划分，并计算不同采样位点的nirS型反硝化细菌多样性指数，应用MEGA 6.0软件构建系统发育树。利用Canoco 4.5程序对nirS型反硝化群落分布进行主坐标分析(Principal coordinate analysis，PCoA)，对群落–环境因子关系进行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。试验数据的相关性及方差分析采用SPSS 19.0软件进行。

 

表 1 流溪河中各采样点底泥理化性质Tab. 1 Physical and chemical properties of sediments in sampling sites within the Liuxi River

  

采样点 pH θ/℃ w/(mg·kg–1)COD NH4+–N NO2––N NO3––N TN 1–SK 7.66 29.6 6.67 0.33 0.08 3.11 4.39 2–WQ 7.51 29.8 21.33 6.09 0.02 3.21 9.36 3–LD3 7.59 28.7 21.33 1.34 0.08 2.79 4.71 4–LD2 7.35 27.7 21.33 6.45 0.03 3.53 10.04 5–LD1 7.48 29.5 10.67 4.79 0.06 2.83 9.50 6–LK 7.38 29.0 12.00 5.58 0.08 3.34 6.94 7–CH 7.33 29.0 41.33 18.45 0.29 2.93 30.94 8–ZLT 7.33 29.4 16.00 9.38 0.23 2.97 21.52 9–RH 7.49 29.5 29.33 10.98 0.26 3.67 25.32 10–NG 7.62 28.4 69.33 26.52 0.23 2.19 71.35

2 结果与分析

2.1 流溪河nirS型反硝化细菌多样性分析

退休安置指符合退休条件的煤矿职工依法办理退休手续。内部退养是指截至2017年12月31日，距法定退休年龄（含特殊工种退休年龄）5年以内且养老保险缴费年限满15年的（含退养结束时满15年）职工自愿申请，企业同意，双方签订内部退养协议。分流安置是指总公司下属子公司或分支机构，根据需求提供工作岗位，员工自愿申请选择竞岗，被用工单位录用的员工，其工作年限连续计算，不给予经济补偿。解除（终止）劳动合同是指公司根据相关法律、法规的规定，与职工解除劳动关系，企业依法支付经济补偿③。

本试验对流溪河10个采样点沉积物样品的宏基因组DNA进行PCR扩增及克隆子测序，共得到495条克隆序列，在83%相似度水平上共获得53个不同种类的操作分类单元(OTU)(表2)。对每个采样点进行多样性指数分析，发现各采样点的覆盖率均较高，表示测序所得到的OTU序列覆盖了沉积物中绝大部分的nirS序列。最上游水库位点的Shannon、Chao1、Pielou和ACE指数值最低，分别为 0.16、2、0.23和 2.0，Simpson指数值最高为0.92，表明该采样点的物种多样性最低；人和位点的Shannon、Chao1、Pielou和ACE指数值均较高，分别为2.48、62、0.87和47.8，Simpson指数值较低为0.08，表明该位点物种比较丰富。在所有采样点中，从化、良口、人和和绿道–1位点的Shannon、Chao1、Pielou和ACE指数值相对于其他采样点较高，上游2个采样点(水库和温泉)的指数值较低，表明反硝化细菌在流溪河各不同采样位点的分布存在差异，这一差异可能与不同位点底泥理化性质(表1)和还原性物质污染程度有关。

 

表 2 流溪河中不同采样位点nirS型反硝化细菌多样性指数Tab. 2 Diversity characteristics of nirS-type denitrifiers in sampling sites in the Liuxi River

  

采样点 克隆子数量 OTU数量 Simpson指数 Shannon指数 Chao1 指数 Pielou指数 ACE指数 覆盖率/%1–SK 52 2 0.92 0.16 2 0.23 2.0 100.0 2–WQ 48 8 0.59 1.11 11 0.53 13.6 91.6 3–LD3 51 12 0.35 1.50 17 0.60 65.5 86.3 4–LD2 50 11 0.37 1.48 16 0.62 33.1 88.0 5–LD1 52 12 0.17 1.95 33 0.78 52.6 86.5 6–LK 50 19 0.12 2.45 30 0.83 50.9 78.0 7–CH 51 19 0.07 2.68 22 0.91 25.8 86.3 8–ZLT 47 9 0.28 1.59 12 0.72 16.8 91.4 9–RH 45 17 0.08 2.48 62 0.87 47.8 77.8 10–NG 49 10 0.26 1.67 15 0.73 23.9 89.8

2.2 流溪河nirS型反硝化细菌系统发育分析

以某项目框架节点为例，如图4所示部位，为三段预制梁相连，出现的问题是纵筋在锚固部位，按照设计图纸中的连接方式，箍筋高度不对，弯折钢筋部位保护层厚度太小，钢筋之间的伸出碰撞。

该病常发于分娩之后，病猪的体温正常，食欲减退，粪便先干后稀，有的病猪喜欢喝咸汤，有的喜食鲜块茎类食物但数量不大，严重者食欲废绝，从而出现不食症。

如图5所示，流溪河沉积物中nirS基因拷贝数呈明显的空间差异性分布，其中水库的nirS基因拷贝数最低 (8.26×101 g–1)，南岗最高 (5.45×104 g–1)，其次为从化(2.96×104 g–1)，其他采样位点nirS基因拷贝数范围为 7.89×103～1.34×104 g–1。

2.3 流溪河nirS型反硝化细菌群落分布及与环境因子相关性分析

流溪河沉积物中nirS型反硝化细菌群落分布与环境因子相关性的RDA分析如图4所示。坐标轴RDA1和RDA2总解释量为95.3%，高解释量表明了环境因子对反硝化细菌群落分布影响的可靠性。结果表明，nirS型反硝化细菌群与沉积物中(P=0.001，F=10.713)和 N(P=0.049 8，F=3.025)含量显著相关，分别占据了总解释量的57.2%和12.3%；而与TN、COD和含量、pH和温度没有相关性(P＞0.05, 1 000次蒙特卡洛排列)，共占据了总解释量的30.9%。

PCoA分析结果如图3所示，PC1和PC2主成分贡献率为75.47%，结合采样位点的周围环境，可以将所有nirS型反硝化细菌群落聚类为3组，即中上游源头区(包括水库、温泉、绿道–3、绿道–2、绿道–1和良口)，农业养殖区(从化、人和)和城市生活区(钟落潭、南岗)。这3个区域在地理位置和环境特点等方面的差异影响了反硝化细菌群落的组成及分布。

1.2.4 反硝化细菌nirS基因克隆及测序分析 PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A®Gel Extraction Kit，Omega)进行纯化，纯化后的产物采用pMD19-T Simple Vector连接试剂盒进行连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂在 LB 固体选择培养基 (含有 100 μg·mL–1氨苄青霉素、40 μg·mL–1 IPTG 及24 μg·mL–1X-gal)上，置于37 ℃条件下培养12～16 h后进行蓝白斑筛选，每个培养平板中随机挑取约100个白色菌斑，接种于含100 μg·mL–1氨苄青霉素的液体培养基中扩大培养，采用通用引物M13-D(5′-AGGGTTTTCCCAGT CACGACG-3′)和 RV-M(5′-GAGCGGATAAC AATTTCACACAGG-3′)进行菌落PCR验证，然后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

  

图 2 基于nirS序列的反硝化细菌系统发育树Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of denitrifying bacteria based on nirS sequences

  

图 3 nirS基因序列的主坐标分析Fig. 3 Principal coordinate analyses of nirS genesequences

  

图 4 nirS型反硝化细菌群落结构与环境因子冗余度分析Fig. 4 Redundancy analyses for correlations between nirS-type denitrifier community structure and environmental factors

2.4 流溪河nirS基因丰度及与环境因子相关性分析

总酸含量是反映酱油品质的主要指标之一，各有机酸与相应醇类经酯化反应可生成具有芳香气味的各种酯，从而赋予酱油特殊的风味[27]，但过高的总酸能使酱油酸味突出，降低酱油的品质。《GB2717-2003酱油卫生标准》[28]中严格规定总酸含量不得超过 2.5 g/100 mL，本试验所检出的总酸含量均在标准限值之下，如图2。

基因丰度和环境因子相关性分析结果如表3所示，nirS基因丰度与COD和TN含量呈极显著正相关，与含量呈显著负相关。

  

图 5 流溪河各采样点沉积物中nirS基因拷贝数Fig. 5 nirS gene copy numbers in sediments of sampling sites in the Liuxi River

 

表 3 nirS基因丰度与环境因子相关系数Tab. 3 Correlation analyses of nirS gene abundance with environmental factors N=10

  

1) “*” 、“**”分别表示在 0.05 和 0.01 水平相关性显著

 

理化性质 P1) R pH 0.044 0.904 θ–0.367 0.297 w(NH4+–N) 0.965** 0.000 w(NO2––N) 0.609 0.061 w(NO3––N) –0.683* 0.029 w(COD) 0.948** 0.001 w(TN) 0.970** 0.000

3 讨论与结论

本研究采用构建基因文库和实时荧光定量的方法研究了广州市流溪河沉积物中反硝化细菌的多样性，分析了沉积物中反硝化细菌的群落结构、基因丰度及其与环境因子的关系。研究发现流溪河中nirS型反硝化细菌主要与变形菌门中的α–，β–和γ–变形菌纲亲缘关系较近，此结果与Henry等[10]报道一致，说明了变形菌门在反硝化过程中的重要作用。同时，本研究中的nirS型反硝化细菌还与许多来自其他生态系统(包括土壤、河口沉积物以及污水处理厂污泥)的微生物亲缘关系较近，表明了流溪河沉积物中反硝化细菌群落的复杂性。Gao等[11] 以及Zheng等[7]分别报道沿海湿地和河流入海口的反硝化细菌nirS序列均与水生系统中的菌群亲缘关系较近，可能原因是海水的高盐度导致其反硝化细菌群落与其他生态系统存在差异。

大量研究表明环境因子会对反硝化细菌群落结构产生影响。Gao等[11]发现含量与反硝化细菌群落多样性呈正相关，与本研究结果一致，这可能是由于含量的升高为反硝化过程提供了更多的电子受体[12]。Francis等[13]发现含量显著影响nirS型反硝化细菌群落，并且作为氮循环中的重要物质，可以影响nirS基因编码的亚硝酸还原酶的mRNA水平[14]。此外温度、盐度和pH同样会显著影响反硝化细菌群落结构的组成[11, 15-17]，但本试验由于采样地点及时间的限制，未发现相关现象。在本试验中，发现nirS型反硝化细菌群落与TN、COD和含量存在显著的相关性，这表明流溪河沉积物中反硝化细菌群落对特定环境具有一定的适应性。

流溪河沉积物中nirS基因丰度呈现显著的空间异质性分布(P＜0.01)。根据采样点周围环境的不同，我们发现城市生活区的nirS基因丰度要高于源头区和农业养殖区。本研究中nirS基因的拷贝数为 8.26×101～5.45×104 g–1，明显低于中国沿海湿地沉积物 (4.3×105～3.7×107 g–1)、长江河口沉积物(1.01×106～9.00×107g–1)和旧金山湾沉积物(5×105～5×107 g–1)的拷贝数[11, 18-19]。本研究发现流溪河中含量与nirS基因丰度呈显著负相关，Dong等[20]也发现河口中含量增加会导致nirS基因丰度的降低。Mosier等[19]发现COD和TN含量对nirS基因丰度有显著影响，与本研究结果一致。此外，Dang等[8]发现含量对nirS细菌群落的组成和丰度具有显著影响。因此，含量是决定反硝化菌数量、组成和分布的关键因素。除此之外，还有一些研究报道pH、温度和含量可以改变nirS基因的丰度[8, 11, 14, 21]，但本试验没有发现明显的相关性。这些结果意味着进入水生系统中的化学污染物或活性氮(如和)会显著影响反硝化细菌群落的基因丰度。

本研究调查了广州市流溪河沉积物中nirS型反硝化细菌的组成、分布以及基因丰度。结果发现nirS型反硝化细菌的组成和基因丰度存在明显的空间差异。总的来说，城市生活区的nirS基因丰度要高于源头区和农业养殖区，这主要是城市环境中TN、、COD 和 含量较高影响的结果。同时，和含量也是影响nirS反硝化细菌组成和分布的关键因素。这些研究结果表明河流中化学污染物以及活性氮的大量存在会显著影响水生系统中反硝化细菌群落的生存，从而导致水体富营养化等一系列环境问题。

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