口蹄疫Aphtae epizooticae是由口蹄疫病毒Aphthovirus(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种热性、急性、人畜共患传染病[1]。该病具有传播速度快、病原变异快、血清型种类多等特点, 加上该病发病率较高，对我国的畜牧贸易造成了巨大的经济损失。因此，做好该病的防控具有重要的意义。

FMDV VP1基因的变异程度最大，编码的VP1蛋白是参与形成抗原位点的最主要的机构蛋白。在FMDV分型中，可以通过分析VP1基因的核苷酸序列差异建立遗传进化树来进行分型。3A基因是一种膜相关蛋白，其C段易突变，在病毒RNA的复制中起重要作用[2]。3A蛋白的氨基酸变化与FMDV的宿主嗜性及毒力相关。分析3A蛋白的遗传变异趋势，有可能预测病毒在宿主范围和毒力方面的变化[3]。本研究通过对广东部分地区FMDV进行抗体检测和对VP1和3A基因进行序列分析，旨在丰富广东地区FMDV流行病学资料，为临床上不同疫苗毒株的选择提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 病料来源

18份临床样品采集自广东省2015—2016年临床症状疑似FMDV感染的猪蹄部水泡液。

1.2 主要试剂

Ex Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、DL2000 Marker、pMD18-T载体均购自宝生物工程(大连) 有限公司；TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；DH-5α 感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中发表的FMDV基因组序列，设计扩增FMDV VP1(835 bp)和3A基因(830 bp)的引物，包括 VP1-F：5′-GTGCYGGCAARCACTTTGA-3′；VP1-R: 5′-CACATGTTCTCTTGCATCTG-3′；3A-F：5′-ACGACGTCYCARTACGTT-3′；3A-R：5′-ACCTTCAAAGTGACAGGYT-3′。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.4 基因扩增和克隆

李建明的收藏范围不再局限于像章，塑像、红宝书等各种与毛主席有关的红色物件，进入他的视野。有次花了2000元，拉来整整两汽车毛主席石膏塑像，小的五六十厘米，大的一人多高。他经常去废品收购站。毛主席语录红宝书，塑料皮与内页被拆分了。他出比收购时高出一倍的价钱买下，然后一一对上、装好。

将采集的病料浸出液，按照TRIzol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书操作，提取病毒总RNA[4]。以其为模板，采用MLV反转录酶进行反转录制备cDNA。以cDNA为模板，VP1-F/R与3A-F/R为引物，合成VP1基因与3A基因。参数为：95 ℃ 4 min，1 个循环；94 ℃ 1 min，54 ℃ 50 s，72 ℃90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行回收纯化[5]。克隆于pMD18-T载体中，阳性重组质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

1.5 序列分析

参考GenBank登录的国内外FMDV参考病毒株序列[6]和 NCBI Blast结果，利用 DNAStar、ClustalX、MEGA5.1、MegAlign软件对不同病毒株的VP1和3A基因序列进行比较分析，绘制基于VP1和3A基因的FMDV遗传进化树[7]。

2 结果与分析

2.1 VP1和3A基因片段的扩增

2.4.4 基于3A基因的A型FMDV遗传进化分析基于3A基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年7株A型FMDV与其他12株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图5)，结果表明，这7株A型FMDV与参考株分成了2个组群，根据这7株A型FMDV氨基酸位点变异性分析可知，本次检测的7株A型FMDV均属于Ⅰ型毒株，即3A基因有22个碱基缺失，而Ⅱ型毒株的3A基因只有3个碱基连续缺失。

  

图 1 VP1和3A基因的RT-PCR扩增产物Fig. 1 The RT-PCR amplification products of VP1 and 3A genes

2.2 VP1基因的联机检索

将VP1基因序列用NCBI Blast进行联机检索，结果显示7个分离株属于A型毒株, 包括GD-MC-1、GD-MC-2、GD-ZS-1、GD-ZS-2、GD-CH-1、GD-3和GD-4；11个分离株属于O型毒株[9]，包括GDMM-1、GD-MM-2、GD-MM-3、GD-MM-4、GD-MM-5、GD-MM-6、GD-QY-1、GD-JM-1、GD-1、GD-2 和GD-KPYC。

2.3 O型FMDV VP1和3A基因的序列分析

2.3.1 基于VP1基因的O型FMDV遗传进化分析

与大班额的教学相比，小班化教学有着与生俱来的优势，既可以提高教师对每个学生的关注度，又可以增强班级凝聚力，营造良好的生生互动、师生互动的氛围。在小班教学的背景下，探索合作学习的另一个重要价值是，能够充分利用小班教学的教育优势资源，将出现在合作学习过程中一些具体问题予以克服或解决。

基于VP1基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年11株O型FMDV与其他11株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图2)，结果表明11株O型FMDV均在ESA分支上，均属耿马谱系毒株。GD-1株和GD-2株与O/GZ/CHA/2010株遗传进化关系较近。

2.3.6 O型FMDV 3A蛋白氨基酸位点变异性分析

2.3.4 基于3A基因的O型FMDV遗传进化分析

2.4.3 A型FMDV VP1蛋白氨基酸位点变异性分析

2.3.3 O型FMDV VP1蛋白氨基酸位点变异性分析

基于3A基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年11株O型FMDV与其他7株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图3)，结果表明11株O型FMDV分为2个分支，其中有9株与O/BY/CHA/2010株在1个分支；另外2株与O/TAW/2/99/TC株分布在1个分支。11株FMDV的3A基因均不存在缺失。

  

图 2 基于VP1基因的O型FMDV的遗传进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of the nucleotide sequence of type O FMDV based on VP1 gene

  

图 3 基于3A基因的O型FMDV的遗传进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of type O FMDV based on 3A gene

2.3.5 O型FMDV 3A基因序列相似性分析 对2015—2016年11株O型FMDV的3A基因，用DNAStar软件与其他7株FMDV的参考株进行了序列比对分析，结果表明11株O型FMDV的3A基因之间的序列相似性为87.1%～98.0%。O/BY/CHA/2010株与GD-1株和GD-2株的序列相似性最高，为95.2%。O/GZ/CHA/2010株与GD-1株和GD-2株序列相似性最高，为93.9%。

2.3.2 O型FMDV VP1基因序列相似性分析 对2015—2016年11株O型FMDV的VP1基因，用DNAStar软件与其他11株FMDV的参考株进行了序列比对分析，结果表明11株O型FMDV的VP1基因之间的序列相似性为95.3%～99.8%。O/BY/CHA/2010株与GD/MM/3株序列相似性最高，为 95.3%。O/MYA/1/98株与GD/1株、GD/MM/1株和GD/MM/3株序列相似性最高，为90.8%。这11株O型FMDV与O/HK/2001株序列相似性较低，为75.4%～78.2%。

对2015—2016年11株O型FMDV的3A蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用O/BY/CHA/2010株作为FMDV的参考株。结果表明，Cathay分支上的毒株出现氨基酸的缺失，因此FMDV也可以按是否出现氨基酸缺失分为2个组群，即第Ⅰ组群为新毒株谱系毒株，第Ⅱ组群为耿马谱系新毒株和泛亚谱系毒株。O型FMDV的3A蛋白的高突变区分布在125～152 aa。

2013年，天津水务在部党组可持续发展治水思路的指引下，不断加快水务改革发展步伐，全力推进民生水务工程建设，全年各项目标任务圆满完成，确保了城乡防汛和供水安全，呈现出水务投入稳定增长、保障能力显著提升、发展活力持续增强的良好态势，为经济社会发展提供了坚实保障。

2.4 A型FMDV VP1和3A基因的序列分析

2.4.1 基于VP1基因的A型FMDV遗传进化分析

基于VP1基因序列，用MEGA 6.0软件对2015—2016年7株A型FMDV与其他15株FMDV的参考株进行了遗传进化分析(图4)，结果表明，这7株A型FMDV与A/GDMM/CHA/2013株、A/HuBWH/CHA/2009株在同一个大分支上，均属Asia型毒株。这7株A型FMDV中GD-3株与A/GDMM/CHA/2013株的遗传进化关系最近。A/HuBWH/CHA/2009株与这7株A型FMDV的遗传进化关系相对较远。

龙斌的目光茫然而散乱地投向江面，江面上几艘游船改造的“水上歌厅”霓虹闪烁，传出阵阵欢歌笑语，带着凉意的秋风扑面而来，把浓郁的桂花香味送入肺腑，温馨中又揉入了几缕伤感。良久，龙斌收回目光，对同样盯着江面出神的竹韵说：“风大天凉，我们回去吧。”

2.4.2 A型FMDV VP1基因序列相似性分析 对2015—2016年7株A型FMDV的VP1基因，用DNAStar软件与其他7株FMDV的参考株进行了序列比对分析, 结果表明，7株A型FMDV的VP1基因之间的序列相似性为95.6%～99.7%。A/GDMM/CHA/2013株与GD-3株的序列相似性最高，为99.8%；A/GDMM/CHA/2013株与GD-CH-1株的序列相似性最低，为96.4%。A/HuBWH/CHA/2009株与GD-3株的序列相似性最高，为91.4%；A/HuBWH/CHA/2009株与GD-CH-1株的序列相似性最低，为88.4%。

小班化教学给实践活动提供了极大的便利，教师要在实践活动中关注学困生，通过实践活动磨炼学困生的意志，陶冶学困生的情操，为学困生的成长提供广阔的天地。很多学困生虽然学习成绩不佳，但是他们的实践能力较强，在实践活动中十分活跃。教师应缩短与学困生的心理距离，鼓励他们积极参与实践活动，在潜移默化中向学生渗透学习思想和道德品质等。联系生活实际，讲述学科知识在实际生活中的应用，为学困生创设与教学资料有关的情境，引发他们的好奇与思考。同时，分层活动是帮助学困生体验成功的有效方法，可开展分层学科竞赛，达到人人都有发展的目的。

对2015—2016年11株O型FMDV的VP1蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用O/MYA/1/98株作为FMDV的参考株。结果表明，O型FMDV的VP1蛋白的高突变区分布在47～51、153～156 aa。

对2015—2016年7株A型FMDV的VP1蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用A/GDMM/CHA/2013株作为FMDV的参考株。结果表明，FMDV VP1蛋白的高突变区分布在43～47、138～143、151～156、163～173 aa。

用针对VP1和3A基因特异性的引物对临床采集的具有水疱症状的样品(水泡液及水泡皮)进行RT-PCR验证，所扩增的VP1和3A基因与预期长度一致[8](图 1)。

  

图 4 基于VP1基因的A型FMDV的遗传进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of type A FMDV based on VP1 gene

  

图 5 基于3A基因的A型FMDV的遗传进化树Fig. 5 Phylogenetic tree of type A FMDV based on 3A gene

2.4.5 A型FMDV 3A基因序列相似性分析 对2015—2016年7株A型FMDV的3A基因，用DNAStar软件与其他12株FMDV的参考株进行了序列比对分析， 结果表明，7株A型FMDV的3A基因之间的序列相似性为96.1%～99.8%。A/airan/iso105株与GD-MC-1株和GD-MC-2株的序列相似性最高，为92.8%；A/airan/iso105株与GD-ZS-1株和GD-MC-2株的序列相似性最低，为90.4%。这7株A型FMDV的3A基因与A/VN/03/2009株和A/VN/03/2009的序列相似性较低，为41.7%～42.8%。

实验组不良反应发生率为100.0%，其中骨髓抑制发生率为40.0%，恶心发生率为24.0%，呕吐发生率为（22.0%），皮肤黏膜改变发生率为14.0%；对照组不良反应发生率为43.5%，其中骨髓抑制发生率为17.4%，恶心发生率为8.7%，呕吐发生率为（6.5%），皮肤黏膜改变发生率为10.9%，比较两组患者不良反应发生率，差异有统计学意义（χ2=38.758，P＜0.05）。详见表2。

2.4.6 A型FMDV 3A蛋白氨基酸位点变异性分析

对2015—2016年7株A型FMDV的3A蛋白，用MegAlign软件进行氨基酸位点变异性分析，用A/TUR/43/95株作为FMDV的参考株。结果同样表明，7株A型FMDV均属Ⅰ型毒株，其3A蛋白氨基酸存在较多缺失。Ⅱ型毒株的3A蛋白只有1个氨基酸的缺失。

以SPSS 19.0统计学软件统计计算数据。肺部感染、泌尿系统感染、胃肠综合征等术后并发症情况以及护理满意度以（%）形式表示，进行 χ2检验；切口拆线时间、住院时间、血糖水平以（±s）形式表示，进行 t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 讨论与结论

2015—2016年间检测到的11株O型FMDV属于耿马谱系，与历年流行毒株相似性均低于95%。氨基酸突变位点集中于 138～139，153～156 aa，位于RGD两侧决定病毒感染细胞特性的关键区域[10]。O型FMDV的3A基因未发现氨基酸缺失。7株A型FMDV同属于Asia型，变异程度相对较低，为96.4%～99.8%，氨基酸变异同样包括了RGD两侧的 138～139，153～156 aa区域[11]。7 株 A 型口蹄疫3A基因均出现了不同程度的缺失。

华南地区在2010年以前，口蹄疫流行毒株均为新毒株谱系或泛亚谱系，2010年后耿马谱系毒株在广东猪群大规模流行[12]。石庆伟等[13]于2014年检出2株O型耿马系FMDV和本研究检出的11株O型耿马系FMDV突变程度大，说明了广东地区耿马系毒株开始大规模流行。A型口蹄疫近年来被官方报道流行于新疆、西藏和云南等地[14]。石庆伟等[13]于2014年检出3株A型口蹄疫，2015—2016年检测到7株A型FMDV，A型毒株在广东地区同样呈现流行趋势。广东部分地区口蹄疫病毒基因型复杂基因变异情况复杂，原有基因型FMDV未得到有效控制，新发基因型相继流行，由此导致广东地区FMDV预防控制困难[15]。

本研究通过对FMDV遗传进化分析为我国FMDV流行病学的研究提供了基础数据，同时为临床上不同型疫苗的选择提供依据。

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