微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由水华蓝藻产生的一类细胞内毒素，其结构为单一环肽类物质，正常情况下很稳定，能够在水体中存在相当长一段时间，在一定条件下才会发生降解，如紫外、超声等。MCs具有强烈的肝毒性[1]，会导致人体肝脏损坏及肿瘤发生，还具有肾毒性、生殖毒性、遗传毒性和心脏毒性等，它还能使磷酸酶活性降低。在细胞结构破坏或细胞凋亡时，大量的藻毒素由细胞扩散到水体中从而危及生物体的健康。沉积物作为水体中污染物的汇集地和污染源，监测其中的MCs具有重要的意义。

目前MCs的检测技术主要有生物分析法[2]、细胞毒性检测法[3]、酶联免疫吸附法(ELISA)[4]、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6-9]、高效液相色谱/质谱法(LC/MS)[10-12]等，这些方法主要用于水体中MCs测定，针对沉积物中MCs的监测文献则相对较少。田大军等[13]采用冰浴超声萃取和高效液相色谱法开展了淮河流域某县水体底泥中MCs的污染调查，但未阐述方法检出限和回收率等技术指标。樊洁等[14]采用超声萃取和高效液相色谱法开展了滇池底泥中MCs的测定，但方法回收率较低。 Zastepa等[11]则采用加速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法考察了沉积物和孔隙水中MCs的分布，阐述了不同MCs对底泥的吸附能力。

现以沉积物中MCs为研究目标，尝试建立加速溶剂萃取-固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定沉积物中5种MCs的分析方法，并应用该方法分析太湖沉积物样品中的MCs，以期为环境监管提供一定的技术支撑和数据支持。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；AB SCIEX QTRAP 5500 三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)；Dionex ASE 200加速溶剂萃取仪(美国Thermo 公司)；AQUA Trace ASPE 799自动固相萃取仪(日本岛津公司)；真空冷冻干燥机(美国Labconco公司)；氮吹浓缩仪(美国Zymark公司)；0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜针头式过滤器，Milli-Q超纯水器(美国 Millipore公司)；涡旋混合器(日本LMS公司)。

创伤性颅内损伤患者的诊断疾病占比排前3位的分别是未特指的颅内损伤（占55.3%）、脑震荡（占19.6%）、弥散性脑损伤（占13.0%）；平均住院时间排前2位的是局部脑损伤（48.5 d）、颅内损伤伴延长的昏迷（42.6 d）；平均住院费用和药品费用最高的为局部脑损伤，分别为104 760.8、53 144.6元，详见表2。

MC-LR、MC-RR、MC-LW、MC-LF、MC-YR标准溶液(10 mg/L，美国Sigma公司)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；石英砂(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；硅藻土(化学纯，德国Merck公司)；HLB固相萃取小柱(0.012 cc/mg，美国Waters公司)；实验用水为Millipore超纯水[ρ(TOC)<1 μg/L]。

1.2　样品采集及处理

于西太湖采集6个0～20 cm的表层沉积物样品，每个采样点采集沉积物量≥1 kg，置于250 mL棕色玻璃瓶中加盖密封，立即运回实验室于-20℃下保存至分析。

萃取温度定为80℃，考察6.9，10.3，13.1，15.8 和18.6 MPa等不同萃取压力对目标物回收率的影响。结果表明，5种目标物随着萃取压力升高回收率显著提高，当萃取压力为13.1 MPa时回收率最佳，萃取压力继续增加，回收率则略有下降，这可能是由于随着萃取压力的升高，基质干扰物的萃取效率也提高，萃取液颜色明显加深，不利于净化效果，从而对仪器分析产生不利影响。故确定萃取压力为13.1 MPa。

修复剂种类：本试验采用了5种化学修复剂，分别为2%骨炭(A)、2%活性炭(B)、2%磷矿粉(C)、2%土壤修复剂Ⅰ(D)、 2%土壤修复剂Ⅱ(E)。

2.1.2　萃取温度和压力的优化

1.3　分析条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；流动相为0.2%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，采用梯度洗脱模式：0 min，20% B，保持2 min，2～4 min，线性增至60%B，4～5 min，线性增至50%B，5～6 min，线性增至100%B，并保持1 min，后恢复为20%B，平衡1 min结束；流速0.5 mL/min，进样体积5 μL；柱温40℃；采用外标法定量。

1.2.3 单药MIC值测定与结果判定 采用96孔V型灭菌反应板，用微量肉汤二倍稀释法测定[2]多西环素、阿莫西林、恩诺沙星、氟苯尼考对鼠伤寒沙门菌sh2034的MIC值。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式扫描；离子化电压5 500 V；离子源温度500℃；气帘气压力138 kPa；喷雾气压力414 kPa；辅助加热气压力414 kPa；碰撞气流速中等，驻留时间20 ms。各物质离子对优化后的参数见表1。

 

表1　目标化合物的多离子反应监测参数①

  

化合物母离子子离子去簇电压/V碰撞电压/VMC-LR995．7213．3∗12070375．112066MC-LW1025．6135．2∗120104213．012053MC-LF986．8375．3∗12043135．212093MC-RR520．0135．1∗12038213．112043MC-YR1045．7213．3∗12072135．112082

①: * 表示定量离子

2　结果与讨论

2.1　加速溶剂萃取条件的优化

2.1.1　萃取溶剂的选择

首先麦克风阵列接收目标声源的语音信息,由于声源经过不同的传播路径到达不同麦克风,所需的传播时间存在差异,因此可以通过对多个麦克风采集到的信号进行相应的分析处理,得到各路信号之间的传播时间差,并根据麦克风阵列的几何关系确定声源的方位。

由于MCs是一种易溶于水、极性较大的物质，多用醇和水作为提取溶剂来萃取沉积物中的MCs。故选择甲醇和水作为萃取溶剂，研究不同比例下甲醇-水萃取溶剂对沉积物中MCs的提取效率，结果见表2。结果表明，不同比例甲醇-水溶剂对MC-RR的萃取效率影响较大，以甲醇-水(1∶4，V/V)为萃取溶剂时，MC-RR具有最好的萃取回收率。故选择甲醇-水(1∶4，V/V)为萃取溶剂，此时5种MCs均能获得满意的回收率。

一是对文本所传递的具体信息内容的理解。主要是通过引导学生查找描述作者言语活动和心理状态方面的语言理解其表达的概念，如假设、定义、推断、主张等。可以采用教师引导、学生小组讨论的形式找出文中主题句以及写文章概要的方式，以促进对篇章信息的理解。

 

表2　萃取溶剂对5种MCs回收率的影响(n=6)　%

  

萃取溶剂MC-LRMC-LWMC-LFMC-RRMC-YR回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD纯水93．52．382．110．577．68．271．45．675．74．4甲醇∶水=1∶493．06．21025．51194．995．68．892．64．1甲醇∶水=2∶392．310．31168．61327．246．811．381．97．5甲醇∶水=1∶178．16．293．48．412011．346．914．668．19．2甲醇∶水=3∶281．45．11057．71268．241．76．569．74．3甲醇∶水=3∶190．26．41042．51184．946．97．178．52．8甲醇∶水=4∶198．35．194．03．31259．236．313．189．32．6纯甲醇61．14．393．45．656．411．223．29．151．97．4

将萃取液转移至量筒中，用水定容至200 mL后，以10 mL/min的速度转移至活化的固相萃取小柱中，以氮气吹干小柱，然后用10 mL甲醇以3 mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液氮吹至0.5 mL左右，用甲醇定容至1 mL后，涡旋振荡混匀，过0.22 μm PVDF滤膜，置于进样瓶中，采用UPLC-MS/MS测定。固相萃取柱依次用20 mL甲醇和20 mL水以5 mL/min速度进行活化。

根据《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)方法检出限测定要求，配制质量比为5 μg/kg的2 g石英砂加标样7份，按照样品分析过程进行测定，计算7次平行测定的标准偏差S，以3S为方法检出限，4倍检出限为定量下限，所得结果见表3。结果表明，5种物质的检出限为2～3 μg/kg，定量下限为8～12 μg/kg，说明该方法具有较高的灵敏度，可以满足底泥中MCs的分析测定要求。

鉴于结构思考在《船研所学报》出版流程优化方面的成功应用，针对学术期刊出版工作中需重点关注的几个重要工作对象，提出开发以下几种基于结构思考的期刊出版工作辅助工具，通过应用这些工具，进一步提高期刊出版各个环节的质量和效率。

沉积物样品冷冻干燥磨细后过40目筛，准确称量(2.0±0.2)g样品，与25 g硅藻土搅拌混匀置于ASE萃取池中，按照指定条件，在加速溶剂萃取仪中萃取5 min，并循环萃取2次。

The mRNA level of HMGB1 in the myocardium of the baseline group was positively correlated with the expression of TLR-4,RAGE,and NF-κB(r=0.904,P ＜0.000;R=0.952,P＜0.000;r=0.909,P=0.002,respectively,Figure 5).

这个阶段已经存在较为成熟的知识产权规则，人工智能创作程序的开发者可以对其设计开发的程序享有版权、专利或商业秘密，并通过销售人工智能软件或许可他人使用人工智能软件获益。对于纯粹“人工智能创作”而言，由于程序的设计者无法预设创作结果，最多从算法设计、风格选择等思想层面对人工智能创作进行干预，因此不应对人工智能生成内容拥有权利。

2.2　固相萃取小柱的选择

样品经加速溶剂萃取后萃取液含有大量水，直接进行浓缩比较困难。为实现对萃取液的进一步净化，采用固相萃取方式继续进行富集和净化。

固相萃取小柱对萃取效果影响较大，故考察了C18和HLB 固相萃取小柱对模拟水样中5种MCs回收率的影响，结果见图1。由图1可知，HLB小柱比C18柱具有更好的回收效果。因此选用HLB小柱进行富集净化。

2.3　方法性能指标

配制低(5 μg/kg)、高(25 μg/kg)两个质量比的沉积物加标样各6份，进行准确度和精密度实验，得加标回收率和相对标准偏差结果见表4。结果表明，5种目标物的回收率为76.0%～118%，RSD为1.9%～12.0%。方法的准确度和精密度均符合痕量分析要求。

该系统采用SQL Server 2012数据库作为后台数据库。根据前期做的数据调查，设计相应的字段，数据库包括以下主要表：Student、Dormitory、Worker、HeadMaster和其他附表，部分表结构设计如表1、2。

  

图1　不同固相萃取小柱对5种MCs的回收率(n=6)

在上述优化条件下，配制5种MCs质量浓度为5，10，20，50和100 μg/L的混合标准系列使用液1.0 mL。以目标化合物定量离子的峰面积(y)为纵坐标、目标化合物的质量浓度(x，μg/L)为横坐标进行线性回归，结果见表3。结果显示，5种目标物在质量浓度5～100 μg/L范围内线性良好，相关系数(r)均>0.995。

在加速溶剂萃取过程中，萃取温度对目标物的回收率也会产生影响。选定萃取溶剂后，设定萃取压力为6.9 MPa，比较不同萃取温度(50，60，70，80，90℃)对萃取结果的影响。结果表明，各目标物回收率随温度的增加而提高，80～90℃时达到平缓状态。因此选择80℃作为萃取温度。

2.本刊按国际学术期刊惯例，实行双向匿名审稿制度。来稿请遵守正文和作者信息分离原则，即论文部分(含:标题、中英文摘要、中英文关键词、正文、注释、参考文献)不得包含任何作者信息。作者有关信息请另起他页，包括:文章标题、作者姓名、作者简介(含出生年、性别、籍贯、职称、职务、学历、研究方向等)、作者单位、详细通讯地址、电话、邮政编码及电子信箱。

2.3.2　精密度与回收率

2.3.1　标准曲线、检出限与定量下限

 

表3　5种目标物的标准曲线、相关系数、方法检出限及定量下限

  

化合物标准曲线方程相关系数检出限/(μg·kg-1)定量下限/(μg·kg-1)MC-LRy=471x+2690．999928MC-LFy=2600x-1610．997928MC-LWy=1860x-1270．995328MC-RRy=6960x-8110．9999312MC-YRy=1090x+1070．999928

 

表4　沉积物中5种目标物的回收率及精密度

  

化合物测定值/(μg·kg-1)加标前加标后加标量/(μg·kg-1)加标回收率/%RSD/%MC-LR04583．510．80212585．63．9MC-LF06511810．00232590．12．6MC-LW03568．312．00212585．42．3MC-RR48576．07．30252583．81．9MC-YR04584．87．70222588．53．2

2.4　实际样品分析

2017年5月，采集了西太湖6个点位的沉积物样品，应用建立的分析方法进行分析测定，5种目标物的检出情况见表5。结果表明MC-LR和MC-RR在西太湖沉积物中检出率较高。

 

表5　西太湖沉积物样品中5种MCs检出浓度

  

点位测定值/(μg·kg-1)MC-LRMC-LWMC-LFMC-RRMC-YRS170——13011S2———4—S35——8—S43——6—S511——11—S63——3—

3　结语

建立了ASE-SPE/UPLC- MS/MS同时分析沉积物中5种MCs的方法，实际样品的测定表明，方法具有灵敏度高、准确、重现性好的特点，可以满足环境样品的监测要求。

[参考文献]

[1]　YANG M, LAM P K S, HUANG M, et al.Effects of microcystins on phosphorylase-a blinding to phosphatase-2A:kinetic analysis by surface plasmon resonance biosensor[J].Biochimica Et Biophysica Acta,1999,1427(1):62-73.

[2]　GEHRINGER M M, KEWADA V, COATES N, et al.The use of Lepidium stadium in a plant bioassay system for the detection of microcystin-LR[J].Toxicon,2003, 4l(7):87l-876.

[3]　FLADMARK K E, SERRES M H, LARSEN N L, et al.Sensitive detection of apoptotic toxins in suspension cultures of rat and salmon hepatocytes[J].Toxicon, 1998, 36(8):1101-1114.

[4]　YU F Y, LIU B H, CHOU H N, et al.Development of a sensitive ELISA for the determination of microcystins in algae[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2002, 50(15):4176-4182.

[5]　ROBILLOT C, HENNION M C.Issues arising when interpreting the results of the protein phosphatase 2A inhibition assay for the monitoring of microcystins[J].Analytica Chimica Acta,2004,512(2):339-346.

[6]　MERILUOTO J.Chromatography of microcystins[J].Analytica Chimica Aeta,1997,352(1-3) :277-298.

[7]　WU X, WANG C, XIAO B, et a1.Optimal strategies for determination of free/extractable and total microcystins in lake sediment[J].Analytica Chimica Acta, 2012,709(4):66-72.

[8]　KONDO F, ITO Y, OKA H, et al.Determination of microcystins in lake water using reusable immunoaffinity column[J].Toxicon, 2002, 40(7): 893-899.

[9]　HYENSTRAND P, METCALF J S, BEATTIE K A, et al.Effects of adsorption to plastics and solvent conditions in the analysis of the cyanobacterial toxin microcystin-LR by high performance liquid chromatography [J].Water Research,2001,35(14): 3508-3511.

[10] DELL′AVERSANO C, EAGLESHAM G K, QUILLIAM M A.Analysis of cyanobacterial toxins by hydrophilic interaction liquid chromatography mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 2004, 1028(1):155-164.

[11] ZASTEPA A, PICK F R, BLAIS J M, et al.Analysis of intracellular and extracellular microcystin variants in sediments and pore waters by accelerated solvent extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Analytica Chimica Acta, 2015, 872:26-34.

[12] 虞锐鹏，陶冠军，秦方，等.液相色谱-电喷雾电离质谱法测定水中的微囊藻毒素[J].分析化学研究简报，2003, 31(12):1462-1464.

[13] 田大军，郑唯韡，韦霄，等.淮河流域某县水体富营养化及水体、底泥微囊藻毒素污染状况研究 [J].卫生研究，2011,40(2):158-162.

[14] 樊洁，邓南圣，刘碧波，等.滇池沉积物中微囊藻毒素的HPLC检测[J].云南环境科学，2005,24(3):18-20.