微生物研究中的一个非常重要的环节就是微生物鉴定。微生物鉴定是对微生物形态、生态、生理及毒性等特征深化认识的过程，同时也是以系统的方法认识并驾驭微生物不可缺少的环节。通过微生物鉴定可以深刻认识微生物的生理生化性质，生活习性。因此对产絮菌的类别鉴定必将促进对其微生物絮凝剂特性、微生物絮凝剂的絮凝机理、产絮凝剂微生物培养条件优化及其致病性等方面的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验室分离出的H8菌株

金融的监管必然带来金融运行的顺周期性，这就需要构建完善的与金融相关的法律体系来解决。在2018年两会上，国务院总理李克强提出了要“强化金融监管协调机制”。而金融法律体系的构建是强化金融监管协调机制的重要措施，也是减少金融监管带来顺周期性问题的重要途径。

1.2 试验仪器

双人单面净化工作台、HH.Ⅱ420-S电热恒温培养箱、SPX-250B型生化培养箱、MLS-3020灭菌锅、Mettler AE240电子天平、XS-212-201显微镜、DYCP-3IDN电泳槽、DYY-6C稳压稳流电泳仪、Mastercycler gradient PCR仪、Omega 10 UVP凝胶成像系统、AF-100制冰机。

1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基；LB培养基

1.4 产絮菌H8形态学鉴定方法

1.4.1 产絮菌H8菌落形态观察

观察菌落大小，形状，颜色，是否透明，干燥或湿润，扁平，边缘形状，有无褶皱。

（2）在无菌条件取连接产物5μl加入到200μl感受态细胞中，敲击Eppendorf管侧壁使DNA轻轻混入细胞中，混合物冰浴30min；

（2）PCR反应程序为：

采用常规革兰氏染色法，具体步骤见参考文献。

1.5 产絮菌H8生理生化试验方法

取处于指数生长期的H8新鲜菌液，按文献方法进行糖类发酵试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验、V.P试验、硝酸盐还原试验、纤维素分解试验、明胶液化试验、石蕊牛奶试验、尿素生成试验、接触酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验。

1.6 16SrDNA序列分析鉴定方法

1.6.1 细菌总DNA（脱氧核糖核苷酸）的提取

使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取H8菌株的总基因组。具体操作步骤如下：取H8细菌培养液3ml，10000rpm室温离心1min，弃上清，向沉淀中加入180μl Tris缓冲液，37℃处理30min。再加入20μl RNaseA（25mg/ml）溶液，振荡，室温放置5min，除去RNA（核糖核苷酸）。加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。加220μl缓冲液GB（裂解使核酸和蛋白分离），振荡，70℃放置10min，加220μl无水乙醇，沉淀DNA。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中吸附，然后分别用去蛋白液GD（去蛋白杂质的漂洗液）、漂洗液PW（去盐的漂洗液）洗涤，最后用TE（溶解DNA）缓冲液洗脱。

1.6.2 16SrDNA（细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA）的PCR扩增

由图2可知，食用盐用量过多，香菇酱咸味较过，且与其他香辛料不相协调；用量过少则咸味过淡，严重影响了风味酱的口味；用量10 g时最佳，感官评分为88分。

以细菌的总DNA为模板，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增。

本文利用国家统计局、各省 （市、自治区）（以下简称 “省份”）《统计年鉴》、2017年各省国民经济和社会发展统计公报、中国经济与社会发展统计数据库、 《中国国内生产总值核算历史资料：1952～1995》和 《中国国内生产总值核算历史资料：1996～2002》构建本文所需要的数据集。数据集包括1978～2017年中国各省份地区生产总值、就业人员数、固定资本形成总额，以就业人数代表各地区劳动力投入量，利用固定资本形成总额计算得到各地区各年度资本存量作为资本投入数据，同时以1978年作为研究基期，利用相关价格指数进行数据平减。

扩增引物序列如下：

正向引物：8F 5′-AG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′

计算第j项指标的差异性系数，定义差异性系数1-Hj，当1-Hj越大时，指标越重要。根据上述熵值可得权重值:

反向引物：1512R 5′-A CGG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3′

菌株H8的革兰氏染色结果如图1所示，可也看出此菌株为短杆菌，革兰氏染色结果为阳性。

劳动最光荣，劳动最崇高，劳动最伟大，劳动最美丽。逐梦新征程，唱响新时代的奋斗者之歌，工会组织要为劳动模范、大国工匠发挥作用搭建平台、提供舞台，为劳模工匠传承技能、传承精神创造条件，培养造就更多劳动模范、大国工匠。要大力弘扬劳模精神、劳动精神、工匠精神，让诚实劳动、勤勉工作蔚然成风，引导广大职工以劳动和创造托起中国梦。

 

 

表1 PCR扩增反应体系

  

体系组分 用量（μl） 终浓度10×PCR Buffer 2.5mMdNTP正向引物（1pmol/μl）反向引物（1pmol/μl）DNA模板Taq酶ddH2O总体系2.02.00.40.41 0.114.720 1×0.2mM 0.02pmol/μl 0.02pmol/μl 250ng/μl— —

反应结束后取PCR产物4μl，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，PCR产物用大连宝生物有限公司DNA胶回收试剂盒进行回收。

1.6.3 纯化PCR产物与T-Vector连接

 

表2 PCR扩增反应体系

  

成分体积（μl）pMD18-T Vector EGFP胶回收产物Solution I ddH2O补至终体积为1 3 5 10

将纯化的PCR产物与克隆载体pMD18-T在16℃连接过夜，转化反应体系见表2（10μl）。

本研究显示，采用MRI扫描获得的ADC值可以鉴别肺部结节良恶性病变情况，提示ADC值与肺部结节良恶性病变情况呈现负相关性，并且b值为400 s/mm2时检测的敏感性最高，所以笔者认为，采用MRI扫描获得的ADC值可以在临床上对肺部结节良恶性病变进行鉴别，并且对b值进行优化调整后具有较高的检测灵敏度，可以作为临床上无损伤检测的一种重要的检测手段对肺部结节良恶性病变进行鉴别诊断。

1.6.4 质粒的转化

（1）于冰上融解100μl E.coli DH5α感受态细胞；

1.4.2 细菌革兰氏染色方法

（3）42℃热击，1.5min。冰浴2min；

式中：z为丢包率；x1为PRB利用率；x2为CCE利用率；x3为RRC连接数；e为误差项,b0～ b3为PRB利用率等几个指标与丢包率的相关系数。

（5） 将16μl IPTG （200mg/ml）、35μl X-gal（20mg/ml）混匀，涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB平板上，取100μl细菌菌液涂布于此平板上，37℃培养16-24h直至观察到明显的蓝、白色菌落。挑取白色菌落培养，用宝生物质粒DNA纯化试剂盒进行重组质粒制备。

1.6.5 PCR检测

在整个LNG气化站的工艺包括通过槽车运输的过程中，都会由于压力的变化导致一部分LNG气化，即BOG气体。虽然BOG气体相对于LNG来说非常少，但是倘若不加以处理，会对设备以及管道造成损坏，因此，需要针对BOG设置专门的处理工艺。一般在BOG处理工艺中设置BOG气化器对BOG气体进行气化增温后，方可投入使用。考虑到对于撬装式气化站来说，使用BOG压缩机会比气化器更节省空间，所以，撬装式的气化站在该工艺中采用压缩机处理BOG气体[7]。

将测定的16SrDNA序列用BLAST软件与Gen－Bank中已知的16SrDNA序列进行同源性比较，绘制系统发育树。

（4）加入500uLLB液体培养基（无菌条件下）。37℃扩培，180r/min进行60min；

1.6.6 16SrDNA序列的测序

 

表3 H8的菌落形态特征

  

表面形态 隆起形状 边缘形状 干湿 大小 颜色 是否透明H8 圆形 凸起 光滑、整齐 湿 较小 乳黄色 否

16SrDNA序列的测定由上海生工生物公司完成。

1.6.7 系统发育树的构建

随着校园信息化这几十年突飞猛进的发展，由于最先10兆局域网已经必展成为主干网是万兆，上网速度成几何数字往上涨，速度较快。在校的师生都会较多地通过校园网去互联网上获取更多的信息。同时，青年人又喜欢上网，使得校园网平时里用户规模比较大。而校园网的建设时，出于成本的考虑，会买些低端的设备，更有些学校连一些基本的安全设备都配备不全，主要考虑的还是教学与管理的应用，对网络安全不够重视。

虽然修水县旅游发展得到了政府的大力支持和高度的重视，在现有的国家财税体制下，当地政府可支持财力投入有限，旅游发展仍面临资金来源困难的问题。同时只有投入建设当地旅游发展所需的相关基础设施、第三产业才能实现当地旅游发展的可持续，修水县发展旅游时间较短，各项产业从零到有，前期需要大量的资金投入，这样才能通过前期打造的旅游产业和景点来获得旅游回报，实现修水旅游的可持续性发展。同时，当地政府缺少对当地民营企业的沟通和政策扶持来调动其对第三产业的资金投入实现经济的良性发展，同时还需增加当地民众的投入建设积极性，以全民来打造大旅游时代。

PCR检测阳性克隆，方法同1.6.2，在20μl PCR反应体系中，以1μl质粒DNA（经100倍稀释）为模板，加入相应的PCR反应成分，进行PCR扩增，电泳检测是否扩出特异性条带，以确定重组子。

2 结果与讨论

2.1 产絮菌H8的菌落形态分析

参照《微生物学实验》，对产絮菌H8进行培养特征的观察，该菌在固体培养基上的菌落形态见表3。

2.2 产絮菌H8的革兰氏染色结果

（1）PCR扩增反应体系如表1（20μl）：

3.强化训练，规范作业。就书面练习来看，小学生往往重结果而轻过程，进入初一后，突出表现在部分学生的作业在独立做时不会，抄或与别人对答案等。因此，必须强化以下两点：一是要严格训练，即教师要在规范解题上为学生做好样子；二是要严格要求，让学生从思想上认识规范作业的重要性，对那些不规范的现象及时改正。

2.3 产絮菌H8的生理生化反应结果

  

图1 菌株H8的革兰氏染色图片

 

表4 菌株H8的生理生化性质

  

生理生化试验H8革兰氏染色淀粉水解试验明胶水解试验石蕊牛奶试验尿素生成试验硫化氢试验吲哚试验甲基红试验V-P试验柠檬酸盐试验接触酶试验氧化酶试验硝酸盐还原试验纤维素分解试验G+ + + + + - - - - + - + + -

  

图2 H8基因组DNA的琼脂糖电泳

  

图3 16SrDNA的PCR扩增结果

  

图4 质粒DNA的提取结果

  

图5 目的DNA片段的PCR验证结果

菌株H8的生理生化鉴定结果见表4。

2.4 产絮菌H8的16SrDNA序列分析鉴定结果

2.4.1 总基因组DNA的提取

1%琼脂糖凝胶电泳分析表明所提得的细菌总DNA大小位于23Kb附近（见图2）。

2.4.2 16SrDNA的PCR扩增

1%琼脂糖凝胶电泳分析表明：以H8菌株的总DNA为模板所扩增得到的16SrDNA的PCR产物与预期的大小一致，即约为1.5Kb（图3）。

由于起泡葡萄酒的二次发酵需在原酒中进行，因此对起泡葡萄酒酵母发酵性能进行评价时，除考虑酿造静止葡萄酒时的起酵速度、发酵活力、酒精耐受性、抗二氧化硫能力和不良风味物质的产生等指标外，还需考虑其自溶能力、产气能力、耐压能力、低温发酵能力等特殊指标[18-19]。

2.4.3 转化子的获得与鉴定

  

图6 菌株H8的16SrDNA的全序列

  

图7 16SrDNA的序列比对结果

  

图8 菌株H8的16SrDNA全序列的系统发育树

对随机挑取的一个在含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板呈白色的菌落进行质粒提取，通过电泳分析表明这个白色菌落携带的质粒大于其对照pGEM-T-easy载体，且大小一致。这就意味着这是侯选的质粒转化子（图4）。随之对这个转化子进行PCR验证（图5）结果表明目的片段已转入载体中，此克隆为阳性克隆。

2.4.4 菌株H8的16SrDNA测序及序列比对结果

测序结果（见图6）表明菌株H8的16SrDNA的1442个核甘酸序列得到了有效扩增。

将获得的16SrDNA序列与GenBank已知序列进行比对，比对结果见图7。

2.4.5 产絮菌H8的系统发育树

将菌株H8的16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank中已发表的16SrDNA序列进行同源性比较，用文献报道的方法选取同源性在95%以上的细菌构建系统发育树（图8）。由系统发育树可知H8菌株与已报道的假单胞菌（Pseudomonas mandelii）亲源关系最近。

3 小结

（1）对H8这株培养液絮凝率在85%的菌株的进行了形态观察，此菌为乳黄色圆形细菌，表面光滑湿润且有凸起，不透明的革兰氏阳性菌。将形态学观察和生理生化鉴定结合查阅伯杰氏细菌鉴定手册，初步确定此菌为假单胞菌。

（2）对此H8菌株进行16SrDNA序列分析鉴定，鉴定结果为假单胞菌，与Pseu－domonas mandelii亲缘关系最近。

为深入了解高职院校大学生创新创业能力、创新创业教育现状，自2016年10月至2017年8月期间，通过问卷星形式进行对江苏省高职院校大学生创业主体进行调研。调研选取苏州、无锡、徐州、南京、盐城等地江苏省15所高职院校，共收到1 265份有效问卷。问卷内容从高职院校创新创业教育、存在的主要问题、毕业学生创业现状及创业能力等方面进行。其中大一学生180名，占14.2%，大二学生465名，占36.8%；大三的431名，占34.1%，已毕业的189名，占14.9%；男生385名，女生880名；理工类专业1389名，人文经管类715名，艺术及其他类164名。

参考文献：

〔1〕陶然，杨朝晖等.微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及其培养条件的优化研究.中国生物工程杂志.2005，25（8）：76-81.

〔2〕沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验〔M〕.北京：高等教育出版社，1999.

〔3〕迟熠.复合型生物絮凝剂（CBF）絮凝特性研究〔D〕.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2006.

〔4〕陈盛，钱伟，罗志敏，佘晨兴，马秀玲.酸性多糖微生物絮凝剂的提取、纯化与分析.环境污染治理技术与设备.2006，7（12）：62-63.

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