三色堇（Viola tricolor）是重要的二年生草本花卉,素有“花坛皇后”的美称[1].近年来,随着分子生物的快速发展,分子标记和基因工程等生物技术广泛应用于多种植物的种质资源鉴定和遗传多样性分等方面[2-4],但有关堇菜属植物分子生物学研究的报道很少.获得高质量的DNA是开展三色堇分子生学研究的基础.DNA的提取方法通常有CTAB法[5]、改良CTAB法、SDS法[6]和试剂盒法[7]等.本试验采SDS法和植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）法提取DNA,比较DNA的质量和提取效率,探索快提取三色堇DNA的方法,旨在为利用分子生物技术研究堇菜属植物的遗传多样性和三色堇的分子标辅助选择育种打下基础.

1 材料与方法

1.1试验材料

试验所用的三色堇材料来自德国,是Buzzy系列品种中的一个类型,种子由河南科技学院草花育实验室提供.试验植株在育苗室培育,培育条件为：日温20℃,夜温15℃,光照12 h/d.培育4个月左右,真叶数5～10片的植株为材料进行DNA提取.

1.2试验方法

1.2.1总DNA提取 取三色堇幼苗的幼嫩叶片0.2 g,吸干表面水分,放入预冷研钵中,加液氮研磨至粉末状,转移粉末至1.5 mL离心管中.分成2组,每组2管,其中一管作为重复.一组采用SDS方法提取总DNA,具体步骤参考王景雪等[8]的方法进行；另一组采用植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）的方法（以下简称试剂盒法）,具体步骤按照试剂盒说明书的要求进行.

1.2.2 DNA质量浓度和质量检测

采用NanoDrop分光光度计,测定DNA样品的吸光值OD260/OD280和DNA的质量浓度.根据OD260/OD280来评价DNA的质量.

由图1可知,用试剂盒法提取的DNA电泳图谱主带清晰无杂带,DNA完整性较好,基本上无断裂,RNA降解完全,说明试剂盒提取方法能有效去除三色堇叶片中的多糖及其他次生代谢物质,为三色堇总DNA提取的有效方法（图1-a）.用SDS方法提取的未纯化DNA电泳图谱主带清晰但附有杂带,说明RNA没有去除干净,仍含有未被除去的多糖及其他次生代谢物质（图1-b中2-1和2-2泳道）；经纯化后的DNA电泳图谱主带模糊（图1-b中2-3和2-4泳道）.由图1可知两种方法提取的三色堇叶片DNA质量有明显差别.

相比很多“半路出家”的沃尔沃经典车主们来说，沃尔沃已经陪伴潘叔27年时间。早在1991年，潘叔就拥有了这辆当时还能被成为新车740 Wagon。

2 结果与分析

2.1两种提取方法获得DNA的质量和效率比较

纯DNA溶液的OD260/OD280应为1.8.若OD260/OD280大于1.9,表明有RNA污染；OD260/OD280大于2.0,表明溶液中有残存的盐和小分子杂质,如核苷酸、氨基酸、酚等；OD260/OD280小于1.6,表明有蛋白或酚的污染[9-10].将两种不同方法提取的三色堇总DNA,应用NanoDrop进行吸光值检测,结果见表1.

 

表1两种不同方法提取的总DNA的质量和效率Tab.1 Theefficiency of thetotal DNA extracted by twodifferent methods

  

方法试剂盒法SDS法SDS法后再纯化样品1-1 1-2 2-1 2-2 2-3 2-4 OD260/OD280 1.81 1.82 2.12 2.04 1.82 1.84质量浓度/（ng/μL）370.4 375.7 401.6 390.8 65.7 76.0费用（元/个）20.0 20.0 0.5 0.5 0.6 0.6时间/h 115566

由表1可知：用试剂盒提取的三色堇DNA溶液其OD260/OD280在1.8左右,说明DNA纯度较好；SDS方法提取的三色堇未纯化DNA溶液其OD260/OD280的数值在2.0以上,说明其中还有不少RNA和杂质未去除干净.经纯化后的三色堇DNA溶液其OD260/OD280的数值在1.8左右,说明经纯化后的DNA纯度较好,但质量浓度显著降低,仅为纯化前的1/6左右.从提取时间上来看,试剂盒法用时1 h,而SDS法用时5 h,试剂盒法比SDS法少了4 h；从费用上看,试剂盒法的费用是SDS法的近40倍.

1.2.3 PCR扩增检测 根据本课题组已发表的三色堇HSP70基因序列,利用Primer 5.0设计特异性引物.引物 1：5'-AGATATGGCTAACAAAGGAG-3',引物 2：5'-GTCGACCTCCTCAATCTT-3'.以两种方法提取的DNA作为模板,PCR检测提取DNA质量.PCR反应体系为：DNA模板1μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTP 1.6μL,上、下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶0.3μL,无菌水补足至20μL.PCR反应程序为：94℃预变性1 min,94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸2 min,35个循环,72℃终延伸5 min,4℃保存,对PCR产物进行电泳检测.

2.2琼脂糖凝胶电泳检测两种方法提取DNA的质量和质量浓度

以两种方法所提取的DNA（含SDS法纯化后）作为模板,采用同一对引物和反应体系进行PCR增,均能获得大于2 000 bp的条带,条带均比较清晰（见图2）,且条带大小与HSP70基因的大小一致,明两种方法均能满足基因扩增和分子标记检测的需要.

配制1%琼脂糖凝胶,取10μLDNA进行电泳,电压150 V,25 min,在凝胶成像系统上观察并拍照,观察提取DNA的质量.

发送方A开始先选定一种Hash函数，通过该函数产生散列值,然后发送方A用自己的私钥对消息摘要进行加密，生成数字签名并将这个数字签名发给接受方B。与此同时，将消息通过公开信道发给接受方B。

  

图1试剂盒法和SDS法提取三色堇叶片DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 DNAsecureplant kit and method of SDSextraction of pansy leaves DNAagarosegel electrophoresis

2.3 PCR扩增

试剂盒法和SDS法两种方法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳对照结果见图1.

此外，今年农产品产量不高且价格偏低，导致农民收入微薄，即便是种植大户也是依靠国家补贴才能勉强维持。而肥料价格的大幅上涨，势必会影响农民购买肥料的积极性，这让原本就不太明朗的冬储市场雪上加霜。

  

图2 PCR扩增产物电泳图谱Fig.2 Agarosegel electrophoresismap of PCRamplification products

3 结论与讨论

DNA提取的难易因植物种类的不同而异,试材选择、提取方法、操作技术、环境因素等也会对DN的提取结果产生影响[11].从DNA的提取效率和质量来说,试剂盒法步骤简单,且能有效去除多糖、酚类蛋白质等物质,在短时间内获得纯度高、完整性好的DNA,节省了时间,整个提取过程大约节省4 h,极地提高了提取效率,琼脂糖凝胶电泳条带较为清晰,DNA质量最好,且能够进一步满足分子生物学的验要求,是快速大量提取三色堇叶片DNA的理想方法.

赵喜华等[12]用SDS法提取杜鹃属基因组DNA时,DNA沉淀为淡黄色,纯度过低.SDS法可能是对糖及次生代谢物含量较高植物的DNA提取效果不理想[13].SDS方法提取的未经纯化的DNA杂质多,量差,但提取过程中可清楚地看见絮状的DNA,琼脂糖凝胶电泳主带清晰但附有杂带,可能是三色堇有较多多糖及次生代谢物质的缘故[14]；经进一步纯化后的DNA质量好,但质量浓度低,纯化效果不理想且SDS法提取步骤相对繁琐,耗时长,但仍能满足普通PCR扩增的要求.

综上所述,经两种方法所提取的三色堇叶片总DNA均能满足PCR扩增的要求.各实验室可根据费支出、人员配给等实际条件选择适合的方法进行三色堇植物基因组DNA的提取.

H社区的资金受到区政府限制，并且资金的审批过程复杂，时间长，效率低，导致许多老旧小区的消防安全设施无法得到有效完善，存在一定的安全隐患，对居民的人身安全具有潜在的威胁。

参考文献：

[1]陈宏志,杜晓华,贾文庆,等.12份三色堇优良株系主要观赏性状评价[J].河南科技学院学报（自然科学版）,2015,43（3）：21-25.

[2]赵雅楠,王颖,张东杰,等.基于SSR技术的水稻DNA指纹图谱构建[J].黑龙江八一农垦大学学报,2016,28（5）：32-35.

[3]黄凤兰,郭志强,孟凡娟,等.试剂盒法提取蓖麻基因组DNA的条件优化[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版）,2010,25（1）：29-33.

[4]车彩凤,李烨,彭浩,等.蹄叶橐吾基因组DNA提取及RAPD-PCR体系的优化[J].延边大学农学学报,2011,33（1）：60-63.

[5]李艺,铁双贵,朱卫红,等.快速CTAB法提取玉米种子胚基因组DNA[J].河南农业科学,2008（2）：17-20.

[6]单志,吴宏亮,李成磊,等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究[J].广东农业科学,2011（8）：113-115.

[7]余志雄,欧高政,陈清西,等.火龙果总DNA提取方法比较研究[J].中国农学通报,2010,26（4）：300-303.

[8]王景雪,孙毅,高武军.一种简便实用的植物总DNA提取方法[J].山西大学学报（自然科学版）,2000,23（3）：271-272.

[9]赵静,叶欢,李雪松,等.四种改良CTAB法提取大叶朴基因组DNA比较研究[J].北方园艺,2010（1）：165-168.

[10]代翠红,李杰,朱延明,等.不同DNA提取方法对4种重要作物DNA提取效率的比较[J].东北农业大学学报,2005,36（3）：329-332.

[11]COΜCH JA,FRITZ PJ.Isolation of DNA from plants high in polyphenolics[J].Plant Molecular Biology Reporter,1990,8（1）：8-12.

[12]赵喜华,张乐华,王曼莹.杜鹃属基因组DNA提取及RAPD的鉴定[J].生物技术,2005,15（5）：43-45.

[13]仇建标,丁文勇,陈少波.几种DNA提取方法对红树植物秋茄叶片DNA提取效果的比较[J].浙江海洋学院学报（自然科学版）,2012,31（5）：402-408.

[14]李琴,王健,赵钟鑫,等.三色堇花瓣总RNA 3种提取方法的比较[J].江苏农业科学,2013,41（5）：24-26.