心力衰竭是小儿心血管疾病中由多种因素引发的一组心功能受损的严重综合征，是儿童致死的常见原因之一[1]。目前，传统药物治疗只能在一定程度上保护心肌、延缓心脏疾病的进程，却无法使功能性心肌细胞再生，难以从根本上逆转慢性心衰的发展进程[2]。心脏移植是治疗心衰的最终方法，但因供体受限、术后长期免疫抑制、免疫排斥等原因，很难在临床上大规模推广[3-4]。细胞移植修复受损心肌具有诱人的前景[5]。近十余年，国内外学者在通过Wnt信号通路诱导干细胞向心肌细胞分化做了大量的研究，并取得了肯定的效果。wnt5a是非经典Wnt信号通路的代表配体。研究发现，wnt5a表达上调可通过激活Notch信号促进内皮祖细胞向心肌细胞分化[6]，wnt5a也能够通过激活蛋白激酶C δ(PKC δ)从而增加人类循环前体细胞的心脏基因表达[7]，由此可见，wnt5a在心肌细胞分化和心脏形成过程中具有重要作用。然而，wnt5a在心肌祖细胞向心肌细胞分化成熟及其在心肌受损修复中的作用仍有待进一步研究。本研究旨在探讨非经典Wnt信号途径中的wnt5a对心肌祖细胞向心肌细胞分化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 心肌祖细胞CP15-5a、wnt5a重组腺病毒、绿色荧光蛋白(GFP)重组腺病毒、HEK293细胞均来自美国芝加哥大学分子肿瘤实验室。DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基及优质胎牛血清FBS购自美国Gibco公司，全蛋白提取试剂盒、Western blotting配胶试剂盒和Super ECL检测液购自中国凯基公司，RNA提取试剂盒、Real-time PCR试剂盒和反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，鼠抗β-actin单克隆抗体购自中国钟鼎生物公司，兔抗鼠CX43单克隆抗体购自美国Cell signaling公司，鼠单抗cTnT单克隆抗体购自英国Abcam公司，HRP标记羊抗兔二抗和HRP标记羊抗鼠二抗购自中国中杉生物公司，Dylight 488抗山羊二抗购自中国Abbkine公司，0.22μm PVDF膜购自美国Millipore公司，一抗二抗洗脱液购自中国碧云天公司。

1.2 方法

ANSYS软件是由美国ANSYS公司研制的，该软件能较好地迎合分析需求，而ANSYS Workbench正是为了组件的重新组合而设置的一个专用平台，因此增加了ANSYS产品的易用性和开发性[3]。

1.2.1 HEK293细胞和CP15-5a细胞培养 取HEK293细胞和CP15-5a细胞快速复温移至含5ml DMEM高糖培养基的离心管中，1000r/min离心5min，用培养基重悬至培养瓶中培养。待细胞长至培养瓶壁约75%时用PBS洗3次，胰酶消化、1000r/min离心5min，按1:3传代继续培养。

水处理综合实验是上海理工大学环境工程专业本科课程,是获得学士学位的必修课。其先修课程是环境工程原理和水污染控制工程。课程每学年开设一次,安排在第5个短学期。在2014年下半学期之前,水处理综合实验基本采用演示性(“传统”)实验,即提供实验理论和程序的讲义给学生;实验小组进行实验,每人根据每次实验的结果,单独写一份实验报告并提交。整个学期至少进行5次实验。传统实验主要集中在水污染控制工程为基础的各处理单元(例如,混凝/絮凝、沉淀、吸附、氧化、生物处理)。通常第一次课安排的是实验室安全讨论课,而且在学期内有专业认识实习,安排两次污水处理厂的现场考察。

1.2.2 wnt5a重组腺病毒和GFP重组腺病毒的扩增当培养的HEK293细胞融合至75%时加入1μl病毒原液，培养3d左右，待大部分细胞变圆脱落，用枪头吹下未脱落细胞，1000r/min离心5min，得到病毒细胞沉淀进行冷冻、融化，剧烈振荡，重复4次后，4℃、14 000r/min离心15min，取上清即为病毒液。多次重复以上步骤直至得到适当的高滴度腺病毒。采用GFP荧光标记法，分别按10–2~10–6梯度稀释扩增的腺病毒，取对数生长期HEK293细胞，计数，铺24孔板，每孔500μl(5×105细胞/ml)。每个病毒梯度设3个复孔，每孔滴加50μl待测病毒样品，培养48h。直接荧光显微镜下计数每视野荧光细胞数。视野下每个荧光细胞视为一个荧光单位，病毒滴度以绿色荧光形成单位/ml(GFU/ml)表示要。绿色荧光蛋白形成单位/ml(GFU/ml)=[(绿色荧光细胞数/视野)×(视野/孔)]/[病毒体积(ml)×稀释系数]。

[2]Kantor PF, Lougheed J, Dancea A, et al. Presentation, diagnosis,and medical management of heart failure in children: Canadian Cardiovascular Society guidelines[J]. Pediatria Polska, 2013,29(12): 1535.

[13]Cesselli D, Aleksova A, Mazzega E, et al. Cardiac stem cell aging and heart failure[J]. Pharmacol Res, 2018, 127: 26-32.

1.2.4 流式细胞仪检测腺病毒对CP15-5a细胞的转染效率 腺病毒转染细胞24h后，取1×106个Adwnt5a转染的细胞作为实验组，同时取1×106个CP15-5a细胞作为阴性对照组，将细胞消化、离心，用PBS洗2次，200μl PBS重悬至EP管中，在488nm紫外光激发下计数GFP阳性细胞比率。

其次，阅读作为作文素材的来源，需要学生在平时课外阅读或是看到课文中的好的词语和句子时，摘抄到一个本子上，收集起来，便于使用时查找，例如“问渠那得清如许？为有源头活水来”的名诗。又如朱自清在《春》中是这么描写南方春雨的，“看，像牛毛，像花针，像细丝，密密地斜织着，人家屋顶上全笼着一层薄烟”。胸中有墨水，下笔之时才能够信手拈来、旁征博引。

1.2.5 qRT-PCR 腺病毒转染CP15-5a细胞1周后，用RNA提取试剂盒提取分别提取wnt5a组、GFP组和空白对照组细胞的RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，β-actin为内参检测GATA4、MEF2C的mRNA表达量。数据分析采用比较Ct法(ΔΔCt)，数据取3次重复的平均值，所用引物见表1。

1.2.6 Western blotting检测CX43、cTnT的表达 腺病毒转染CP15-5a细胞2周后，按照凯基全蛋白提取试剂盒说明书分别提取wnt5a组、GFP组和空白对照组细胞的全蛋白，BCA法检测蛋白浓度，配胶，按浓度加样电泳，半干转膜、封闭，孵育一抗14h(兔单抗CX43按1:1000稀释，鼠单抗cTnT按1:10 000稀释)，TBST洗膜30min，孵育二抗1h(羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗稀释比例均为1:10 000)，TBST洗膜30min，配制ECL显影液曝光显影。数据取3次重复的平均值。

 

表1 PCR引物序列[8]Tab.1 Primer sequence used for PCR assay[8]

  

Gene name Forward Reverse β-actin CACACCCGCCACCAGTTCG GTCCTTCTGACCCATTCCCACC GATA4 CCCTCCCGCACGATTTCT AGAGGCCCAACTCGCTCAA MEF2C GCGCAGGGAATGGATACGG TGCCAGGTGGGATAAGAACG

1.2.7 免疫荧光技术检测CX43的表达 CP15-5a细胞铺板，wnt5a病毒组和GFP病毒组细胞分别处理2周，漂洗；多聚甲醛固定，漂洗；TritonX-100破膜，漂洗；山羊血清封闭，孵育一抗兔单抗CX43按1:100过夜，漂洗；孵育二抗，漂洗，DAPI染色，封片，荧光显微镜下观察结果。

1.2.8 全细胞膜片钳技术 wnt5a病毒组和GFP病毒组细胞分别处理2周，对3组细胞进行爬片处理6h，细胞开始贴壁且呈圆形时开始实验。在时程300ms的去极化脉冲下保持电位–80mV，以10mV间距给予幅值为–120~+50mV的钳制电压。应用Clampex程序采样，采样频率为10kHz，滤波频率2kHz，记录不同钳制电压下的膜电流。采用Axon-patch700B膜片钳放大器记录电流，经过Digidatal320A转化器和pclamp9.2分析软件系统采集数据，记录在细胞外液中加入钠通道阻滞剂河豚毒素(TTX)前后的钠电流(INa)。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用Dunnett's T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组腺病毒扩增结果 腺病毒加入HEK293细胞48h后，荧光显微镜观察可见大部分HEK293细胞出现变亮、变圆、飘落。GFP荧光标记法测得wnt5a腺病毒滴度为1.7×1010GFU/ml，GFP腺病毒滴度为2.6×1010GFU/ml。

干细胞移植治疗心脏疾病是近年的研究热点。随着临床病例数的增多，细胞移植成分逐渐向组成单一、纯度高的组织定向干细胞群过渡。但是外源性干细胞移植成分复杂，它们在心肌微环境的诱导下可表现出向心肌样细胞、肿瘤细胞等分化的多向性，并由此带来微梗死、心律失常、肿瘤等一系列的移植并发症[9-10]。相对于其他外源性干细胞，心肌祖细胞属于成体干细胞，能诱导分化为心肌细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞[11]，采用心肌祖细胞进行细胞移植可能会减少上述移植并发症的发生。此外，心肌损伤后与胚胎发育的心肌微环境不同，原始状态的干细胞在成熟心肌环境中不能被正常调控，移植后只有少数细胞停留在心脏归巢现象[12]，而心肌祖细胞是心脏来源的干细胞，在心脏微环境中有较好的适应性，可能更适合移植后的细胞归巢。在成体心脏受损时，心肌祖细胞会动员修复受损心肌，但是其代偿修复功能有限[13]。原始的心肌祖细胞增殖周期有限，用于细胞体内外的研究有很大的局限性。本课题组前期成功建立了心肌祖细胞株[14]，为诱导心肌祖细胞向心肌细胞分化提供了实验基础。

  

图1 CP15-5a细胞倒置相差显微镜和荧光显微镜观察(×100)Fig.1 Contrast diagram of inverted phase contrast microscope and fluorescence microscope for CP15-5a cells (×100)

 

A. Inverted phase contrast microscope; B. Fluorescence microscope

2.3 流式细胞仪检测的病毒转染效率 Ad-wnt5a和Ad-GFP转染CP15-5a细胞24h后，检测转染效率分别为42.8%、44.3%。

2.4 各组GATA4、MEF2C的表达情况 qRTPCR检测结果显示，wnt5a组中GATA4基因的表达量(1.717±0.220)明显高于GFP组和空白对照组(1.003±0.087、0.961±0.063)，差异有统计学意义(P<0.05)，而GFP组与空白对照组比较差异无统计学意义；wnt5a组中MEF2C基因的表达量(1.847±0.190)明显高于GFP组和空白对照组(0.456±0.042、0.500±0.095)，差异有统计学意义(P<0.05)，而GFP组与空白对照组比较差异无统计学意义(图2)。

2.5 各组CX43、cTnT蛋白的表达情况 Western blotting检测结果显示，wnt5a组CX43、cTnT蛋白的表达(分别为1.597±0.267、0.727±0.100)明显高于GFP组和空白对照组(CX43：0.723±0.047、0.783±0.1333；cTnT：0.217±0.021和0.253±0.102)，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而GFP组与空白对照组比较差异无统计学意义(图3)。

2.6 免疫荧光技术检测CX43的细胞内定位 wnt5a组CX43在细胞质中有明显表达，而GFP组CX43在细胞质中未见明显表达(图4)。

  

图2 qRT-PCR检测GATA4、MEF2C的表达Fig.2 mRNA expression of GATA4 and MEF2C by qRT-PCR

 

(1)P<0.05 compared with control group and GFP group; (2)P<0.05 compared with control group and GFP group

  

图3 各组CX43、cTnT的蛋白表达(Western blotting)Fig.3 CX43 and cTnT protein levels in each group (Western blotting)

2.7 全细胞膜片钳技术检测INa 经腺病毒诱导后，3组细胞中仅wnt5a组可以检测出INa，且具有一定时间依赖性，INa在–70mV左右开始激活，在–10mV左右时达到最大，在达到+30mV左右时开始消失(图5A)。在细胞外液加入钠通道阻滞剂TTX 5min后电流明显减弱(图5B)。图5C为根据在300ms内不同钳制电压下测得的各电流峰值均值绘制的I-V曲线。GFP组和空白对照组均未见特异性INa。

  

图4 免疫荧光技术检测CX43的细胞内定位(×200)Fig.4 Intracellular localization of CX43 (Immunofluorescent technique ×200)

3 讨 论

2.2 Ad-wnt5a和Ad-GFP感染的CP15-5a细胞形态改变 Ad-wnt5a和Ad-GFP分别感染CP15-5a细胞24h后，继续培养2周，在倒置相差显微镜下wnt5a组细胞排列紧密有序且细胞呈长梭形，GFP组细胞排列混乱无方向性。在荧光显微镜下观察可见两者均有大量绿色荧光(图1)。

通过构建海淀区战略性新兴产业专业技术人才紧缺度指数来衡量岗位的紧缺程度。岗位紧缺度指数基于收集数据进行建构，从岗位人数需求量、岗位在行业内企业的需求情况、岗位在时间上的紧缺情况进行衡量。

  

图5 全细胞膜片钳技术检测CP15-5a细胞的INaFig.5 INa in CP15-5a cells (Whole-cell patch clamp technique)

 

A. INa of CP15-5a cells infected with wnt5a virus; B. Effect of TTX on INa; C. I-V curve of INa

综上所述，本研究在体外通过Ad-wnt5a成功诱导了心肌祖细胞向心肌细胞的分化，从而为进一步的体内细胞移植修复受损心肌奠定了实验基础。后续将进行体内实验验证心肌祖细胞移植的效果和并发症发生情况。

Wnt5a是Wnt蛋白家族的成员之一，是非经典Wnt信号途径的代表，在细胞成熟、胚胎发育等过程中发挥着重要作用[19-21]。Wnt5a信号在干细胞自我更新、分化及心脏发生中有着重要的调控作用，可通过激活非经典Wnt信号通路上调wnt5a的表达，诱导带有Sca1+/c-kit+的鼠脂肪源性血管基质细胞分化为自发搏动的心肌细胞[22]。本实验采用wnt5a诱导心肌祖细胞成功分化为了心肌细胞。此外，本实验通过重组腺病毒稳定高效地转染心肌祖细胞，wnt5a基因在细胞中得到稳定表达。重组腺病毒具有对宿主细胞致病率低，稳定转染和表达目的基因，无致突变性，并可通过HEK293细胞扩增出理想的高滴度病毒，以及较为经济等多个优点[23]。

GATA4和MEF2C是心脏早期发育的重要因子[15-16]。本实验通过上调wnt5a培养心肌祖细胞1周后，qRTPCR检测GATA4和MEF2C的表达明显增高，从基因层面充分证明了wnt5a的作用。CX43和cTnT是心肌的特异性蛋白，尤其是cTnT，在心肌中具有高度的特异性[17]，一般只在心肌细胞中表达，可作为鉴定心肌分化的指标。上调wnt5a干预心肌祖细胞培养2周后，本研究结果显示实验组心肌特异性蛋白cTnT、CX43表达量较对照组明显增高，提示上调wnt5a干预心肌祖细胞可促进其分化为心肌细胞。此外CP15-5a细胞要成为成熟的心肌细胞，必须具备同步的自主收缩功能，这除了需要心肌特异性的收缩蛋白以外，心肌特异性的电生理功能也必不可少。本实验在wnt5a腺病毒感染CP15-5a细胞2周后可以检测到INa的发生。INa是心脏发育过程的重要因子[18]，作为心肌细胞兴奋或去极化的第一个离子流，其变化对兴奋的发生及传导均有重要意义，且在房室样细胞的分化晚期可以充分表达。而INa的出现进一步说明经wnt5a感染后的CP15-5a细胞在电生理上较空白对照组和GFP组细胞更为成熟和完善。以上实验结果可以有力地证明wnt5a诱导后的CP15-5a细胞在电生理特性上较空白对照组和GFP组细胞与心肌细胞更为相似，更有可能成功分化为成熟的心肌细胞。此外，与空白对照组和GFP组细胞相比，wnt5a组CP15-5a细胞与正常成熟的心肌细胞有着更好的同质性。

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1.2.3 Adwnt5a和AdGFP转染CP15-5a细胞 计数CP15-5a细胞，取5×105个细胞铺于T25培养瓶中，设置为3个组，分别是wnt5a组(wnt5a腺病毒转染)、GFP组(GFP腺病毒转染)和空白对照组(未转染)。第2天弃培养基，加入新鲜无血清培养基，wnt5a组和GFP组分别加入4.71μl的wnt5a腺病毒和3.08μl的GFP腺病毒，放入孵箱继续培养12h再次换液，24h后观察两组细胞GFP的表达及细胞生长情况。

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住院药房药品调剂的原有流程为：医师开具医嘱→护士审核后生成药品请领单→药师审核确认后打印摆药单、摆药、复核→护士清点药品，将药品转运至病区。该流程中各临床科室领药时间未固定，而同时由护士完成到药房领取、清点、转运药品的全部工作，耗时较长。通过广泛查阅相关文献[3-5]并结合对其他大型“三甲”医院进行实地考察所获得的经验，我院根据自身特点，针对性地制定了以下全新的药品调剂流程：

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是不是觉得光阴似箭呢？明明还记得刚上高一时紧张慌乱的心情，那些灯下奋力做题的日子仿佛还在昨天，如今是否觉得恍若时光倒带呢？是啊，老师从来没有骗我们，高中三年过得真的很快。你当然也还记得初踏入一中大门的那个秋天，如今又是一年金秋岁月，不同的是，你已经踏上了高考的战场，正厉兵秣马、严阵以待。

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口服升白细胞药物依从性差已成为阻碍肿瘤病人升白细胞治疗效果的重要因素，为更好地保证治疗效果，护士应根据病人及其家属认知水平、理解能力，进行个体化用药指导，还应加强健康教育、简化用药方案、建立家庭社会支持系统等。但针对出院病人如何进行更有效的健康指导，开展延续性护理服务，提高病人生活质量，还需要护理人员进一步研究。

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在接受康复护理前，2组患者的ADL评分、FMA评分均较低且对比差异无统计学意义（P＞0.05）；在康复护理后，观察组患者ADL评分、FMA评分结果均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1。

中国互联网络信息中心(CNNIC) 2018年1月31发布的我国互联网发展状况统计报告显示，我国网民规模已达到7.72亿，互联网普及率达到55.8 %，网民使用手机上网的比例为97.5 %[1]。手机等新媒体在对大学生的生活、学习带来便利的同时，也产生了一定的消极影响。因此，对新媒体对大学生思想行为的影响进行全面分析并提出进行正确引领路径，帮助他们确立正确的理念信念、形成正确的思想行为，促使他们勇挑时代重任，在实现中华民族从富起来到强起来伟大征程上建功立业，就成为高校教师和广大教育工作者面临的重要而紧迫的任务。

在私有云资源池网络引入SDN时，根据网络采用虚拟机还是物理机分为3种场景，分别为纯虚拟化场景，非虚拟化场景以及混合场景。

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目前军工科研单位许多科研人员认为档案是档案管理部门的工作，缺乏对过程资料归档的意识。导致项目建设中对随机资料、研制过程资料、测试验收资料等没有进行及时的预归档工作，造成后期找不到资料，档案验收不合格的情况。

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