髓系白血病是一个有着不同种类的染色体异常和基因突变的克隆性疾病。针对该种疾病的分子学研究，目前是全球的热点之一。在人体的正常细胞内，早幼粒细胞白血病(PML)蛋白以一种不连续的点状方式分布在细胞核内，被称之为核体(nuclear bodies)，而且PML蛋白也是细胞生长和转化的抑制蛋白[1-2]。研究表明PML蛋白具有抗肿瘤特性，它在许多肿瘤的形成中起重要作用[3-4]。PML蛋白在急性早幼粒细胞白血病中发挥了重要作用，但PML是否在其他髓系白血病在也发挥了类似作用，尚没有明确证明。本研究分别通过免疫荧光、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)和转染等方法观察PML在髓系白血病中的作用。

通过启发式教学，学生在解决问题的过程中不仅学会了将书本知识用于实践，而且能以书本理论为基础，扩展和延伸知识的广度和深度，为今后的研究工作打下坚实的基础。

1 资料与方法

1.1 资料 所有样品均来源于2012年1月至2013年12月黄冈市中心医院收治的髓系白血病的样品，所有的病例均经过临床、细胞形态学、免疫学及组织化学染色等方法确诊。髓系白血病患者共60例，其中初治患者41例，完全缓解患者19例。髓系白血病患者中男性38例，女性患者22例，年龄范围17～68岁，中位年龄为39岁。M2患者21例，M3患者25例，M5患者14例。对照组选取黄冈市中心医院非肿瘤性血液病患者(如溶血性贫血、缺铁性贫血等)15例，其中男性10例，女性5例，年龄范围20～59岁，中位年龄为36岁。所有患者均签署了知情同意书，并通过黄冈市中心医院医学伦理委员会审核。

K562细胞来源于慢性粒细胞白血病病人的细胞系,培养于37 ℃ 5%二氧化碳培养箱。

1.2 主要仪器和试剂 PML兔抗人单克隆抗体(美国Abcam公司)；梯度聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增仪、细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK8)(美国Sigma公司)；禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus，AMV)逆转录试剂盒、DNA 标记(Marker)、 预混合水生栖热菌(Premix Thermus Aquaticus，Premix Taq)酶及热启动水生栖热菌(Hot start Thermus Aquaticus，Hot start Taq)酶(美国Takara公司);辣根过氧化物酶标记羊抗二抗(美国SantaCruz公司)；Trizol RNA 抽提试剂盒、洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；石蜡切片机(德国SM公司)；荧光显微镜EX60(日本OLYMPS)；贝克曼DU800紫外分光光度计(美国贝克曼公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 免疫荧光 所有患者的骨髓均制备成厚度2 μm至3 μm的石蜡切片，60 ℃烤片，脱蜡，复水，抗原修复后封闭，一抗孵育过夜(1∶50)，再荧光二抗(DyLight 594红色荧光二抗)避光孵育1 h，封片，观察。

收集所有患者的骨髓单核细胞并提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。依据文献[3]设计PML mRNA引物，上海生工工程公司合成。RT-PCR扩增基因。见表1。反应结束后,取50 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离,紫外灯下观察并照相。

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表1 引物序列

类型5′端引物3′端引物长度PML5′- CTCAGATGCC-GAAAACTCG-3′5′- CCTGCACT- T CTTTTT-3′238 bpβ-actin5′-CCCTGGACTTCGA-GCAA GAGAT-3′5′-GTTTTCTGCG- CAAGTTAGG-3′531 bp

1.3.2 蛋白质印迹法检测 所有样本裂解1 h，12 000 r·min-1、4 ℃离心30 min，收集上清。总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-page)分离，蛋白电转移聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭，一抗室温孵育1 h，Tris缓冲吐温20生理盐水(Tris-buffered Saline with Tween 20，TBST)缓冲液洗膜3次，每次10 min，二抗孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，通过增强化学发光法(enhanced chemilum inescence，ECL)方法显色。

1.3.3 PML对K562细胞增殖和集落形成的影响

MSCV组为转染空质粒，DN组为转染截短失活PML，Wt组为转染野生型PML，MSCV/puro-PML-WT和MSCV/puro-PML-DN真核表达质粒；以 pDONR223-PML质粒为模板，分别以P1/P2和P1/P3为引物，通过PCR扩增获得全长PML(fgfr3-WT)和PML-DN；按LipofectamineTM2000(Invitrogen)说明书操作转染，通过PCR和蛋白质印迹法检测PML的表达情况[4]。将稳定转染的PML-WT和PML-DN的K562细胞的细胞浓度调整为5×106·L-1，CCK8法测定细胞的增殖情况。将对数生长期的稳定转染PML-WT和PML-DN的K562细胞接种于6孔板中，恒温孵育7 d，瑞氏姬姆萨试剂染色，光镜下计数，总集落形成率=(总细胞集落数/接种细胞数)×500。

1.4 统计学方法 本组研究中所有数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料用表示，两组间比较采用成组t检验，三组及以上比较采用方差分析，若结果阳性，则利用q检验进行两两比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PML蛋白在髓系白血病患者和非肿瘤性血液病患者的免疫荧光染色 PML蛋白主要表达在细胞核内，髓系白血病患者核内及胞质内可见大量弥散分布的针尖样细小荧光颗粒，非肿瘤性血液病患者PML蛋白主要表达在细胞核内，聚集表达，荧光较为明显，胞质内原有的针尖样颗粒消失。

2.2 PML蛋白在对照组和髓系白血病患者中的表达差异 PT-PCR结果显示：60例髓系白血病均表达PML蛋白。Quantity one软件对PML mRNA表达水平进行量化，对照组15例PML mRNA表达相对量(A值)为0.536±0.066，髓系白血病组60例PML mRNA表达相对量为0.356±0.092，髓系白血病组PML mRNA水平显著低于对照组(t=7.11，P<0.01)；初诊组41例PML mRNA表达相对量为0.284±0.022。

髓系白血病是成人急性白血病中最常见的类型，由于白血病细胞的增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，使细胞停滞在较早的发育阶段，最终导致白血病的发生。目前化疗可以使70%～80%的患者病情得到缓解，但大多数患者缓解后会复发，进展为难治性白血病[5-6]。因此寻找对预后分析评价有意义的基因及蛋白具有重要意义。随着基因芯片、PCR等生物学技术的发展，多种蛋白、基因的过度表达与急性髓细胞性白血病发展及预后不良相关，如BAALC、MNI、乳腺癌耐药蛋白、ERG等[7-8]。

2.3 PML对K562细胞增殖的影响 MSCV组，DN组和Wt组在450 nm波长下吸光度值(Optical Density450，OD450)和集落生成单位(Colony-Forming Units，CFU)的数据均差异有统计学意义(F=34.28，25.39，P<0.05)，q检验结果显示，均为Wt组的数值低于DN组和MSCV组。见表2。

表2 PML对K562细胞增殖和克隆的影响

组别例数OD450CFU/500细胞MSCV61.12±0.23bc256±23bcDN61.07±0.31bc247±34bcWt60.68±0.26a158±17aF值34.2825.39P值<0.001<0.001

注：MSCV组为转染空质粒，DN组为转染截短失活PML，Wt组为转染野生型PML；q检验结果:与MSCV组相比，aP<0.05；与DN组相比，bP<0.05；与Wt组相比，cP<0.05

3 讨论

采用Band Leader软件计算PML蛋白相对表达水平，以最大灰度值作为1，其它条带与其灰度值比值为其相对表达量。对照组PML蛋白相对表达水平为0.323±0.025，髓系白血病组PML蛋白相对表达水平为0.189±0.032，髓系白血病组PML蛋白相对表达水平显著低于对照组(t=16.10，P<0.01)；初诊组PML蛋白相对表达水平为0.139±0.041，完全缓解组PML蛋白相对表达水平为0.186±0.017，初诊组PML 蛋白相对表达水平显著低于完全缓解组(t=4.40，P<0.01)。

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PML是近年来研究较多的凋亡相关蛋白，PML参与了多个凋亡途径，PML基因敲除后的小鼠细胞在受到Fas、IFN、TNF、神经酰胺(ceramide)和电离辐射诱导后均无法凋亡[9-11]。PML蛋白是一种十分稳定的蛋白，控制着细胞的增殖、肿瘤基因及造血细胞的分化过程[12]。在多种研究中表明，PML在肿瘤形成中有重要的作用，转染PML将导致肿瘤的凋亡[13]。在早幼粒细胞白血病中，PML-RARα融合蛋白与PML蛋白形成二聚体，而干扰了其功能而导致了疾病的发生[14]。骨髓髓系祖细胞中PML高表达，PML在细胞核内呈现分散的斑点状分布，在本研究中发现正常人的PML表达与该研究类似，PML荧光大量表达且分散分布，而髓系白血病患者PML表达下降，且呈针点状分布[15]。

本组研究中，60例髓系白血病患者均表达PML蛋白，髓系白血病组PML mRNA水平显著低于对照组，并且初诊组PML mRNA水平显著低于完全缓解组。通过比较正常人和患者之间的PML蛋白含量可以发现，髓系白血病患者PML蛋白的表达显著下降，完全缓解组PML蛋白相对表达水平显著低于完全缓解组，提示PML蛋白对髓系白血病的诊断和病情评估具有重要的参考价值。髓系白血病中PML扮演了何种生物功能，为此我们将PML基因转染入K562白血病细胞株，观察转染和未转染的K562细胞增殖和克隆能力，结果显示转染PML基因后，K562的增殖和克隆能力显著下降。由此可推断PML基因高表达于正常骨髓髓系祖细胞中，可抑制细胞的异常增殖，而PML的异常表达减少，可能会导致髓系原始细胞克隆性恶性增殖，其作用机制可能类似于早幼粒细胞白血病中PML-RARα融合蛋白与PML蛋白二聚体的形成。

总之，髓系白血病患者中PML蛋白表达水平下降导致细胞异常增殖可能是其发病机制。PML是一种潜在的抑癌基因，可以通过调节相关功能蛋白的活性而影响髓系白血病及慢性粒细胞性白血病细胞的增殖和凋亡。对PML蛋白的调控机制进行深入研究，可以进一步阐明白血病的发病机制。

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