幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是导致慢性胃炎及胃溃疡的主要因素，胃黏膜相关的淋巴组织癌变及胃癌的发生也与其息息相关，幽门螺杆菌已成为Ⅰ类致癌因子[1-2]。我国Hp感染率约为53%，且呈上升趋势[3]，Hp感染已严重威胁着人类的健康，目前尚未发现有效的、彻底清除Hp的方法，而且关于Hp的致病机制目前还不明确，因此深入探究Hp感染机制，揭示致病机制，对于找到有效治疗Hp感染的方法具有重要意义。

自噬是机体自我保护的免疫防御机制，参与调控机体的生长、分化、发育过程及多种疾病的发生过程，对抵抗病原体感染具有重要作用[4-5]。凋亡是受基因调控的细胞程序性死亡进程，研究发现，Hp感染阳性患者中胃黏膜细胞的凋亡率显著高于感染阴性的患者[6]。细菌感染导致的自噬与凋亡可作为宿主细胞炎症发生的触发开关，但是关于Hp感染所致胃上皮细胞自噬与凋亡的机制还不清楚，本研究通过Hp体外感染人胃上皮细胞AGS，研究了Hp感染对AGS细胞自噬与凋亡的关系，并结合NF-κB特异性抑制剂SN50探讨了可能的作用机制，以期为临床预防和治疗Hp感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Hp菌株购自美国ATCC；人胃上皮细胞株AGS购自中国科学院上海细胞所；F12培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone；胎牛血清购自美国Gibico；万古霉素(K0059)、多黏菌素(P1004)、吖啶橙(BNN2017)购自美国Sigma；Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 ，LC3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、p65、p-p65、β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Santa Cruz；Annexin V-FITC/PI 双染凋亡检测试剂盒购于Biouniquer Technology；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD；Sorcere Sorcere全自动菌落计数仪购自英国Sorcere；GDS7500紫外凝胶成像分析系统购自美国UVP。

1.2 方法

1.2.1 Hp菌株培养 自液氮罐中取出冻存的Hp菌种，迅速置于37 ℃水浴锅中轻轻震荡使其充分融化。3 000 r·min-1离心5 min后，吸取50 μL后弃去上清液，吹打混匀后划线将Hp接种至脑心浸液血琼脂平板，置于37 ℃，微需氧(10%二氧化碳、5%氧气、85%氮气)培养条件下培养48 h。挑取菌落至20 mL无菌Hp液体培养基中，置于三气培养箱的摇床上，微需氧条件，37 ℃，100 r·min-1培养24～30 h。

1.2.2 胃上皮细胞AGS培养 自液氮罐中取出冻存的AGS细胞，迅速放入37 ℃水浴锅中轻轻震荡使其充分融化，转移至离心管中与F12培养基混匀后离心收集细胞沉淀，使用新鲜的细胞培养基重悬沉淀，取重悬液加入含10%胎牛血清的F12细胞培养液中，置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养。待细胞贴壁生长至皿底80%时，弃去旧培养液，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后，0.25%的胰蛋白酶消化并收集细胞，细胞培养液重悬后按1∶4进行传代培养。

1.2.3 Hp感染AGS细胞方法 取对数生长期的AGS细胞，0.25%胰酶消化后离心收集细胞，细胞培养液重悬后显微镜下调整细胞浓度为2×105个/毫升，每孔2 mL接种于6孔板中，置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养。液体培养Hp 24 h，紫外分光光度计检测细菌浓度(1A600=1×108 CFU·mL-1)。待AGS细胞生长至皿底80%时，更换新鲜培养基，并按照细菌数：细胞数=100∶1加入Hp菌悬液，置于37 ℃，5% 二氧化碳条件下共培养0 h、3 h、6 h、9 h。

1.2.4 流式细胞仪检测AGS细胞自噬 分别向Hp时间梯度处理的AGS细胞、对照组AGS细胞、18 μmol·L-1 SN50处理6 h的AGS细胞、18 μmol·L-1 SN50+Hp共处理6 h的AGS细胞中加入终浓度为1 mg·mL-1的吖啶橙溶液，37 ℃避光孵育15 min后，0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS清洗1～2次，向细胞中加入100 μL预冷的PBS溶液重悬沉淀，流式细胞仪检测阳性荧光细胞率。

1.2.5 流式细胞仪检测AGS细胞凋亡 分别取Hp时间梯度处理的AGS细胞、对照组AGS细胞、18 μmol·L-1 SN50处理6 h的AGS细胞、18 μmol·L-1 SN50+Hp共处理6 h的AGS细胞，0.25%胰酶消化后显微镜下调整细胞浓度为2×106个/毫升，取1 mL细胞悬液离心并收集沉淀，PBS清洗2次后，加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL磷脂结合蛋白Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达 取Hp时间梯度处理的AGS细胞，0.25%胰酶消化后收集细胞沉淀，加入细胞裂解液后冰上放置30 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min取上清液，BCA法检测上清中的蛋白浓度。取50 μg蛋白按照体积比4∶1加入5×上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min制备蛋白样品。蛋白上样后竖直电泳，80 V电泳30 min后，换用120 V继续电泳，直至溴酚蓝跑出玻璃板。取出蛋白胶，冰浴条件下100 V转膜，5%脱脂奶粉室温孵育6 h，分别加入相应的一抗(1∶500)4 ℃震荡培养过夜，TBST洗涤液清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗涤液清洗后加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp感染对AGS细胞自噬的影响 利用吖啶橙标记Hp刺激0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS细胞，流式细胞仪检测阳性荧光细胞率分别为0 h(7.25±1.56)%、3 h(12.86±1.78)%、6 h(28.65±2.14)%、9 h(31.19±2.12)%，统计结果如图1所示。4个时间段整体比较差异有统计学意义(F=112.723,P=0.000)，Hp刺激后AGS细胞自噬率随着Hp作用时间的延长逐渐升高，Hp刺激3 h、6 h、9 h与0 h相比均差异有统计学意义(t1=3.587，P1=0.007；t2=13.683，P2=0.000；t3=15.307，P3=0.000)。

注：与0 h相比，aP<0.05

图1 流式细胞仪检测AGS细胞自噬率

2.2 Hp感染对AGS细胞凋亡的影响 收集Hp刺激0、3、6、9 h的AGS细胞，流式细胞仪检测各时间点AGS细胞凋亡率分别为0 h(9.25±1.56)%、3 h(14.86±1.78)%、6 h(29.65±2.14)%、9 h(33.19±2.12)%，结果如图2所示。4个时间段整体比较差异有统计学意义(F=108.205，P=0.000)，Hp刺激后AGS细胞凋亡率随着Hp作用时间的延长逐渐增加，Hp刺激3 h、6 h、9 h与0 h相比均差异有统计学意义(t1=3.587，P1=0.007；t2=13.044，P2=0.000；t3=15.307，P3=0.000)。

注：与0 h相比，at=4.53～8.22，P=0.001～0.004

图2 流式细胞仪检测AGS细胞凋亡率:A为流式细胞仪检测AGS细胞凋亡;B为细胞凋亡率统计

2.3 Hp感染对自噬及凋亡相关蛋白表达的影响

收集Hp处理0 h、3 h、6 h、9 h的AGS细胞，提取各组细胞总蛋白，蛋白质印迹法检测各组细胞自噬及凋亡蛋白表达情况，结果如图3所示。自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及凋亡相关蛋白Bax的表达随着Hp刺激时间的延长逐渐增高，其中Hp处理0 h、3 h、6 h、9 h时Beclin1的蛋白表达分别为(0.103±0.034)%、(0.276±0.046)%、(0.512±0.041)%、(0.579±0.036)%，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达分别为(0.179±0.084)%、(0.667±0.076)%、(2.987±0.120)%、(3.253±0.109)%,Bax蛋白表达分别为(0.127±0.014)%、(0.254±0.026)%、(0.413±0.021)%、(0.506±0.026)%，Bcl-2蛋白表达分别为0 h(0.453±0.023)%、3h(0.321±0.024)%、6 h(0.176±0.016)%、9 h(0.112±0.016)%。Hp处理3 h、6 h、9 h时Beclin1的蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达、Bax蛋白表达和Bcl-2蛋白表达分别整体比较均差异有统计学意义(F1=92.140，P1=0.000;F2=759.672,P2=0.000;F3=170.437，P3=0.000；F4=172.688，P4=0.000)。三者表达均显著高于0 h时 Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax的蛋白表达(tBeclin1 3 h=5.361，PBeclin1 3 h=0.001；tBeclin1 6 h=12.673，PBeclin1 6 h=0.000；tBeclin1 9 h=14.750，PBeclin1 9 h=0.000；tLC3Ⅱ3 h=6.044，PtLC3Ⅱ3 h=0.000；tLC3Ⅱ6 h=34.779，PtLC3Ⅱ6 h=0.000；tLC3Ⅱ9 h=38.073，PtLC3Ⅱ9 h=0.000；tBax3 h,=6.975，PBax3 h=0.000；tBax6 h=15.708，PBax6 h=0.000；tBax9 h=20.816，PBax9 h=0.000)，而凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达随着Hp作用时间的延长逐渐降低，在3 h、6 h、9 h蛋白表达显著低于与0 h蛋白表达(tBcl-2 3 h=8.041，PBcl-2 3 h=0.000；tBcl-2 6 h=16.873，PBcl-2 6 h=0.000；tBcl-2 9 h=20.772，PBcl-2 9 h=0.000)。

注：与0 h相比，aP<0.05

图3 蛋白质印迹法检测自噬及凋亡相关蛋白表达:A为蛋白质印迹法检测蛋白表达;B为蛋白相对表达统计

2.4 Hp感染对NF-κB通路蛋白表达的影响 Hp作用于AGS细胞0 h、3 h、6 h、9 h后，收集各组细胞提取各组总蛋白，蛋白质印迹法检测各个时间点p65、p-p65蛋白表达变化，并进行统计，0 h、3 h、6 h、9 h四个时间段内p65和p-p65的蛋白表达分别为(0.678±0.030)%、(0.673±0.034)%、(0.664±0.037)%、(0.681±0.041)%，(0.100±0.011)%、(0.211±0.015)%、(0.387±0.026)%、(0.415±0.031)%，结果如图4所示。p65蛋白表达在0 h、3 h、6 h、9 h间差异无统计学意义(F=0.130,P=0.940)，p-p65蛋白表达在0 h、3 h、6 h、9 h蛋白表达具有明显变化，整体比较差异有统计学意义(F=134.791，P=0.000)，其中Hp作用3 h时即开始显著增高(t=6.109，P=0.000)，其表达随着Hp作用时间的延长明显增强。

注：与0 h相比，aP<0.05

图4 蛋白质印迹法检测NF-κB通路蛋白表达：A为蛋白印迹法检测蛋白表达；B为蛋白相对表达统计

2.5 Hp感染联合NF-κB抑制剂对AGS细胞自噬及凋亡的影响 为了检测Hp感染是否通过NF-κB信号通路促进AGS细胞自噬与凋亡，利用NF-κB通路抑制剂SN50与Hp共处理AGS细胞6 h，并检测各组细胞的自噬及凋亡情况，结果如图5所示。对照组、Hp、SN50处理后以及Hp与SN50联合处理后AGS细胞自噬与凋亡率分别为(11.76±1.70)%，(13.25±1.56)%，(28.65±2.14)%，(29.65±2.14)%，(6.56±1.40)%，(9.86±1.78)%，(19.65±2.14)%，(20.65±2.14)%，4组AGS细胞自噬与凋亡率分别整体比较差异有统计学意义(F1=79.582，P1=0.000，F2=67.421,P2=0.000)。与对照组AGS细胞自噬与凋亡相比，Hp处理AGS细胞自噬与凋亡显著增强(t1=11.054，P1=0.000;t2=10.456，P2=0.000)；SN50处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著减弱(t1=3.403,P1=0.009;t2=2.799,P2=0.023)；Hp与SN50联合处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著高于对照组，但低于Hp单独处理组，差异有统计学意义(t1=5.164,P1=0.001;t2=5.890,P2=0.000;t3=4.718,P3=0.002;t4=5.738，P4=0.000)。

注：与对照组相比，at=5.46～8.34，P =0.001～0.003；与Hp组相比，bt=4.23～8.56，P=0.001～0.004

图5 Hp与SN50处理对细胞自噬与凋亡的影响：A为流式细胞仪检测细胞凋亡；B为细胞凋亡率统计；C为细胞自噬率统计

3 讨论

自噬是在真核细胞中普遍存在的一种现象，依赖于溶酶体的自我消化及再循环机制，进化过程中高度保守[7]。自噬的发生起始于自噬体的形成，自噬体由细胞双层膜包裹待降解物形成，自噬体形成后与溶酶体融合后被消化降解[8]。自噬能平衡细胞合成和代谢，起到稳定细胞内环境的作用，自噬还参与调控细胞的固有免疫及获得性免疫应答过程[9-10]。

Hp感染胃上皮细胞后，细胞为了清除病原菌会诱发自噬的产生，以降解病原体及其所分泌的毒性物质，保护胃上皮细胞[11]。吖啶橙能进入溶酶体和自噬体中并能发生质子化，经吖啶橙标记的细胞无自噬溶酶体产生时呈现绿色，反之则呈现红色，流式细胞仪用于定量检测吖啶橙标记的阳性荧光细胞率，即为细胞的自噬率[12]。本研究通过吖啶橙标记Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS细胞，流式细胞仪检测自噬细胞率，结果显示，Hp刺激3 h后，AGS细胞即出现自噬现象，细胞自噬率随着Hp作用时间的延长逐渐升高，6 h时细胞自噬率达到高峰，随后开始下降，说明细胞感染Hp早期即可快速启动自噬的发生，以促进对病原菌的清除。Beclin 1蛋白参与形成自噬前体，引导与自噬相关的蛋白定位于自噬体膜上，从而促进自噬的进行，是调节自噬发生的重要因子，其表达在一定程度上反应了自噬的活性[13-14]。微管相关蛋白(microtubule associate protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)主要定位于前自噬泡及自噬泡膜的表面，参与形成自噬体，是自噬体特异性标记蛋白[15]，LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型，自噬发生前，LC3蛋白主要以Ⅰ型状态存在，自噬发生时Ⅰ型蛋白与自噬泡膜表面的PE结合形成Ⅱ型蛋白，结合到自噬体膜上[16]。本研究结果显示噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表达逐渐随着Hp刺激时间的延长逐渐增高，LC3Ⅰ蛋白表达随着Hp作用时间的延长逐渐降低，Hp处理6 h对蛋白表达作用效果最显著。说明Hp感染AGS细胞后促进了自噬的发生。

基于2016年该病种次均费用、次均耗材费、直接可控成本占比等大幅上升，医院数据中心分析发现，该病种直接可控成本中高值耗材同比增长77.17%，远高于药品、试剂、设备等只有个位数的增长率。进一步深入分析，原来一款单价为2.8万元的椎体扩张球囊导管在2016年的使用量比2015年增加88个，其大量使用直接导致该病种各项费用的上升。

细胞凋亡是细胞受基因调控的主动性死亡过程，机体通过凋亡清除掉机体内衰老及畸形细胞[17]。Hp感染胃上皮细胞后，会诱使凋亡的产生以清除病变细胞。利用Annexin V-FITC/PI双染色标记Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h细胞，流式细胞仪检测凋亡细胞，结果显示，Hp感染3h细胞凋亡率出现显著增加，6 h时凋亡率变化最显著。Bcl-2家族是调节细胞凋亡的关键原件，其家族成员Bcl-2和Bax与细胞凋亡密切相关。Bcl-2蛋白可能通过阻断细胞程序性死亡的一个早期环节阻遏细胞凋亡。Bax蛋白在细胞中通过与Bcl-2蛋白形成二聚体，使Bcl-2蛋白失活，从而调控细胞凋亡[18]。本研究结果显示，Hp感染3 h后Bax的表达显著增加，6 h时变化最显著，Bcl-2蛋白表达则随着Hp作用时间的延长逐渐降低。说明Hp感染AGS细胞后促进了凋亡的发生。

NF-κB信号通路广泛参与机体的感染、免疫及凋亡进程，被认为在慢性炎症转变为癌症的进程中具有重要作用[19]。在未受到刺激时，NF-κB二聚体p50/p65与其抑制蛋白IκBα形成多聚体，处于失活状态，细胞受到病原菌感染等刺激时，IKK活化，使IκBα发生磷酸化，无活性的多聚体降解，暴露出NF-κB二聚体的核定位序列，二聚体进入核内，与靶蛋白结合，促进下游基因的表达[20]。检测Hp感染对NF-κB信号通路蛋白的影响，发现Hp感染能显著促进p-p65蛋白的表达，且随着刺激时间的延长蛋白表达也随之增强。说明Hp感染能影响NF-κB信号通路蛋白的表达，为了进一步验证Hp感染是否通过NF-κB信号通路调控AGS细胞的自噬与凋亡，本研究利用NF-κB抑制剂SN50与Hp共同作用于AGS细胞，检测AGS细胞的凋亡与自噬的发生；结果发现，与对照组相比，Hp处理AGS细胞自噬与凋亡显著增强；SN50处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著减弱；Hp与SN50联合处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著高于对照组，但低于Hp单独处理组，说明Hp感染导致的AGS细胞自噬与凋亡的增强与NF-κB通路的活化有关。

鲁迅的叙述、鲁迅的叙述所建构出的意义、鲁迅研究者以鲁迅的文本为核心建构出的意义，这三者既不能被视为相同的，又不能被视为毫无联系的。但青年周树人的经历与鲁迅的叙述之间产生分离却是完全可能的。在这一前提下，对于鲁迅在其叙述中呈现的意义进行阐发和对青年周树人生平的考证是同一研究领域中的两种行为。二者的意义中有相辅相成的一面。但也各有其独立性。他们之间出现分歧并不令人忧虑，反而是研究深入的标志。

综上所述，Hp感染促进胃上皮细胞AGS的自噬与凋亡的发生，其作用机制与NF-κB通路的活化有关，上述结果可能为临床开发新的预防与治疗Hp感染的药物提供理论依据。

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