理气散结颗粒为达州市中西医结合医院的医院制剂，是经白芍、柴胡、延胡索等10味中药材提取浓缩成稠膏后加入适量辅料制成的颗粒剂。方中白芍柔肝平肝为君药，配以柴胡、延胡索疏肝解郁，可恢复肝正常的顺达之性，治疗肝郁血瘀之证。为有效控制理气散结颗粒的产品质量和疗效一致性，本文作者采用高效液相色谱(HPLC)波长切换法联合梯度洗脱法同时测定理气散结颗粒中的芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，对理气散结颗粒的全面质量控制具有重要意义和应用价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司)；XS105DU分析天平(精度：0.01 mg，METTLER TOLEDO公司)；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试药与试剂 对照品芍药苷(批号110736-201640，含量95.2%，2～10 ℃冷处保存)、柴胡皂苷a(批号110777-201510，含量93.2%，冷冻保存)、柴胡皂苷d(批号110778-201510，含量97.3%，冷冻保存)、延胡索乙素对照品(批号110726-201617，含量99.8%，2～10 ℃冷处保存)均来源于中国食品药品检定研究院；对照品去氢紫堇碱(批号30045-16-0，含量97.5%)来源于成都德思特生物技术有限公司；对照品紫堇碱(批号518-69-4，含量98.0%)来源于宝鸡市辰光生物科技有限公司；理气散结颗粒(每袋装15 g)来源于达州市中西医结合医院制剂室；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取本品内容物适量，混匀，研细，取约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷至室温，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品各适量，用70%乙醇制成单一成分对照品储备溶液(芍药苷2.878 g·L-1、柴胡皂苷a 0.392 g·L-1、柴胡皂苷d 0.288 g·L-1、延胡索乙素0.272 g·L-1、去氢紫堇碱0.316 g·L-1、紫堇碱0.424 g·L-1)。依次精密量取各对照品储备液5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL和2.5 mL，定容至100 mL，用70%乙醇制成混合对照品溶液。

2.3 三种阴性样品溶液的制备 依据理气散结颗粒的处方和生产工艺，制备缺白芍阴性样品、缺柴胡阴性样品和缺延胡索阴性样品，依据供试品溶液制备方法制成白芍阴性样品溶液、柴胡阴性样品溶液和延胡索阴性样品溶液。

2.4 色谱条件 Agilent TC- C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脱(0～11 min，18.0%A；11～17 min，18.0%A→32.0%A；17～29 min，32.0%A→55.0%A；29～44 min，55.0%A→80.0%A；44～50 min，80.0%A→18.0%A)；0～17 min在230 nm[1-4]波长下检测芍药苷，17～29 min在210 nm[5-6]波长下检测柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，29～50 min在280 nm[7-11]波长下检测延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃。

2.5 系统适用性及专属性试验 取“2.1 供试品溶液”“2.2 对照品溶液”“2.3 三种阴性样品溶液”和空白溶剂，依法进样测定，记录色谱峰，各阴性样品溶液色谱图中，在所测芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱6种成分对应的位置处无干扰(图1)，理论塔板数按芍药苷计不低于3 500，分离度符合药典要求。

2.6 线性关系考察 精密量取芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品储备液各0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分别置20 mL量瓶中，用70%乙醇定容，制成25倍浓度差的6种不同浓度混合对照品溶液，依法进样测定芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰面积，以芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的质量浓度(mg·L-1)为横坐标(x)，所测各成分的峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归(表1)。

表1 线性关系实验结果

成分回归方程线性范围/mg·L-1r值芍药苷y=1.251 9×106x-365.814.39～359.750.999 8柴胡皂苷ay=2.645 1×106x+282.71.96～49.000.999 5柴胡皂苷dy=1.809 4×106x-207.41.44～36.000.999 9延胡索乙素y=1.637 2×106x-394.11.36～34.000.999 4去氢紫堇碱y=2.181 6×106x+175.81.58～39.500.999 7紫堇碱y=1.383 7×106x+463.52.12～53.000.999 9

2.7 加样回收率试验 分别精密称取芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品各适量，用70%乙醇制成单一成分的加样对照品溶液(芍药苷0.761 g·L-1、柴胡皂苷a 0.539 g·L-1、柴胡皂苷d 0.409 g·L-1、延胡索乙素0.299 g·L-1、去氢紫堇碱0.431 g·L-1、紫堇碱0.247 g·L-1)。

称取已知含量批号为20160909的理气散结颗粒6份，每份约2.5 g，精密称定，分别精密加入上述各成分对照品溶液5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、70%乙醇40 mL，按供试品溶液制备方法制备加样回收样品溶液，依法进样测定，计算芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱平均加样回收率及RSD值(表2)。

注：1为芍药苷， 2为柴胡皂苷a，3为柴胡皂苷d，4为延胡索乙素，5为去氢紫堇碱， 6为紫堇碱

图1 理气散结颗粒HPLC图:A为对照品，B为供试品，C为阴性样品(缺白芍)，D为阴性样品(缺柴胡)，E为阴性样品(缺延胡索)，F为空白溶剂

2.8 精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱峰面积的RSD(n=6)分别为0.62%、1.15%、0.72%、0.94%、1.18%和0.55%。

2.9 重复性试验 称取批号为20160909的理气散结颗粒6份，按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，依法进样测定，分别计算芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的含量，结果6种组分含量的RSD分别为1.22%、0.89%、1.39%、0.67%、0.43%和1.70%。

2.10 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于室温下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h进样测定，结果供试品溶液室温下16 h内稳定，芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱峰面积的RSD分别为1.08%、0.65%、0.82%、0.96%、0.77%和1.31%。

2.11 样品含量测定 取3批次样品，依据供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法进样测定，结果见表3。

表3 理气散结颗粒样品含量测定结果/mg·g-1

批号芍药苷柴胡皂苷a柴胡皂苷d延胡索乙素去氢紫堇碱紫堇碱201609091.5270.2170.1610.1190.1730.096201609101.4490.2440.1760.1030.1960.108201609111.6820.1970.1390.1300.1580.083

3 讨论

3.1 提取方法的选择 在供试品溶液提取方法上，作者分别尝试了回流提取和超声提取，结果回流提取和超声提取所测6种成分芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的测定结果差异无统计学意义，选取操作简便的超声提取作为供试品溶液的提取方式；在此实验基础上，作者又考察了不同的超声提取时间(15 min、30 min、60 min)和提取溶剂(50%乙醇[1]、70%乙醇[8]、95%乙醇、甲醇[9])，结果超声提取15 min所测成分含量测定结果偏低，超声提取30 min和超声提取60 min，所测成分含量较高。以70%乙醇为提取溶剂时，所测各成分综合提取率最佳，故最终选取70%乙醇超声提取30 min作为理气散结颗粒供试品溶液的制备方法。

表2 理气散结颗粒回收率实验结果

成分取样量/g样品量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均值/%RSD/%芍药苷2.500 43.818 13.805 0 7.635 6100.33 2.503 63.823 03.805 07.598 399.222.497 33.813 43.805 07.585 199.122.499 63.816 93.805 07.648 0100.692.498 03.814 43.805 07.650 7100.822.501 13.819 23.805 07.586 999.0299.87 0.84 柴胡皂苷a2.500 40.542 60.539 01.079 399.572.503 60.543 30.539 01.074 498.532.497 30.541 90.539 01.059 896.092.499 60.542 40.539 01.079 599.652.498 00.542 10.539 01.062 796.592.501 10.542 70.539 01.060 596.0797.75 1.74 柴胡皂苷d2.500 40.402 60.409 0 0.806 298.68 2.503 60.403 10.409 00.800 797.212.497 30.402 10.409 00.802 397.852.499 60.402 40.409 00.803 498.042.498 00.402 20.409 00.801 697.652.501 10.402 70.409 00.808 199.1298.090.71延胡索乙素2.500 40.297 50.299 00.595 399.602.503 60.297 90.299 00.590 997.992.497 30.297 20.299 00.584 596.092.499 60.297 50.299 00.590 798.062.498 00.297 30.299 00.586 996.862.501 10.297 60.299 00.585 196.1597.461.39去氢紫堇碱2.500 40.432 60.431 00.858 898.892.503 60.433 10.431 00.852 197.222.497 30.432 00.431 00.856 498.472.499 60.432 40.431 00.849 896.842.498 00.432 20.431 00.861 599.612.501 10.432 70.431 00.858 298.7298.291.07紫堇碱2.500 40.240 00.247 00.483 798.66 2.503 60.240 30.247 00.480 397.172.497 30.239 70.247 00.476 996.032.499 60.240 00.247 00.477 596.152.498 00.239 80.247 00.477 196.072.501 10.240 10.247 00.481 597.7396.971.11

3.2 流动相的选择 作者在本研究中分别对甲醇-水流动相体系[12]、乙腈-水流动相体系[13-14]、乙腈-0.1%磷酸溶液流动相体系[9,15-16]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液流动相体系[6]进行了对比考察，以色谱峰基线平稳情况和所测成分芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰形及分离度为指标，优选最佳的流动相体系，结果以乙腈-0.1%冰醋酸溶液为流动相按照文中的梯度洗脱进行洗脱时，色谱峰基线平稳，所测各成分峰形较好，分离度符合中国药典规定。

3.3 测定方法的选择 理气散结颗粒为中药复方制剂，所含成分复杂，不同活性成分的最大吸收波长差异较大，单一波长难以同时测定多种活性成分的含量。本研究采用波长切换技术，提高了所测定成分的灵敏性和检测结果的准确性，同时联合梯度洗脱技术，提高了所测各成分的分离效果，缩短了检测时间，实现了对理气散结颗粒中芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱6种成分的同时测定。同时HPLC波长切换联合梯度洗脱法对中药复方制剂多成分同时测定存在对照品使用量较大、检测成本高等不足之处，采用一测多评法对理气散结颗粒中多成分同时测定还在进一步研究中。

参考文献

[1] 陆小云,楚楚,颜继忠.超高效液相色谱法同时测定白芍中芍药苷和芍药内酯苷的含量[J].中南药学,2012,10(2):98-100.

[2] 杜伟锋,胡淑珍,吴芳,等.不同等级杭白芍中3个有效成分的考察[J].中成药,2014,36(2):358-362.

[3] 吴飞,洪燕龙,张继全,等.高效液相色谱法同时测定止颤颗粒中芒果苷和芍药苷的含量[J].安徽医药,2016,20(12):2266-2269.

[4] 谢若男,杨满琴,王丽,等.痹痛丸的质量控制研究[J].安徽医药,2017,21(4):643-645.

[5] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:280-281.

[6] 姜正华,李劲平,石丽颖,等.HPLC同时测定参积护胃颗粒中积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量[J].中国中医药信息杂志,2017,24(10):64-67.

[7] 周卿,尚京川.HPLC-DAD法同时测定延胡索中4种生物碱的含量[J].重庆医科大学学报,2014,39(7):1017-1019.

[8] 徐皓.HPLC法测定不同产地元胡药材中5种生物碱含量[J].药物分析杂志,2015,35(8):1403-1407.

[9] 毕福钧,林彤.RP-HPLC法同时测定醋延胡索配方颗粒中7种生物碱[J].中草药,2016,47(4):606-609.

[10] 张静,周浓,祁俊生,等.HPLC同时测定不同产地延胡索中的6种生物碱[J].华西药学杂志,2016,31(4):415-419.

[11] 陈东东,毛坤军,李祥,等.HPLC法比较延胡索炮制前后7个生物碱成分的含量[J].药物分析杂志,2015,35(9):1591-1595.

[12] 易为丹,方应权.HPLC测定三峡库区紫花大叶柴胡中柴胡皂苷a含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(2):71-73.

[13] 何晓梅.HPLC-ELSD法测定大柴胡颗粒中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量[J].健康必读杂志,2012,12:433,406.

[14] 李媛媛,秦雪梅,王玉庆,等.柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量[J].中国中药杂志,2008,33(3):237-240.

[15] 李伟铭,赵月然,杨燕云,等.HPLC波长切换法同时测定白芍饮片中9个成分的含量[J].药物分析杂志,2011,31(12):2208-2212.

[16] 史志辉,肖会敏,何悦,等.皮肤病血毒片制备中7种成分转移率研究[J].安徽医药,2017,21(7):1204-1209.