荒川库蠓 (Culicoides arakawai Arakawa, 1910)(双翅目：蠓科)是一种嗜吸鸡血的蠓类，广布于东南亚各国，是我国东南沿海诸省及台湾地区的优势蠓种。在日本及我国台湾地区已经被证实是鸡卡氏住白虫 Leucocytozoon caulleryi的传播媒介 (Akiba, 1960; Sun, 1969)。近年来，随着人类社会生产活动的迅速发展，加剧了对自然生态环境的破坏，也在一定程度上加剧了蠓传疾病的发生与传播及蠓类生物多样性的丧失；另外，区域性地质事件的发生和全球温暖性气候的不断形成，也影响着蠓类的地理分布。台湾与大陆隔海相望，与临近的福建省最近距离仅68海里，在动植物区系特征、动植物种类和群落分布等方面与福建有着较高的一致性。历史上，台湾与大陆多次分分合合，促进了大陆与台湾昆虫区系的隔离分化和扩散演化，物种间的交流也愈加频繁。亲缘地理学(Phylogeography)又称谱系生物地理学或系统发生生物地理学，主要是研究种内不同种群间或近缘物种形成现有分布格局的历史成因(Avise et al., 1987; 1998)。利用亲缘地理学分析方法，获取海峡两岸重要吸血蠓的分子数据，不仅可以研究海峡两岸吸血蠓遗传多样性格局、估算两岸吸血蠓分歧时间、重建两岸吸血蠓分歧格局的系统发育，还能揭示隐存的多样性信息、通过比较种内或种间等位位点地理分布格局等方面的信息来探讨生物地理学的机制。本研究选用线粒体基因COⅠ、16S rDNA及核基因ITS1-ITS2(以下简称为ITS)分析海峡两岸荒川库蠓的基因分化和种群结构，探讨其起源与扩散路径，以期更有效地指导吸血蠓的防治工作。

目前流行的统计软件较多，SPSS是较为优秀的一种。SPSS全名为社会科学统计软件包，被广泛应用于通讯、医疗、市场研究以及科研教育等多个领域和行业，是国内最为普及的统计软件之一[1]。鉴于SPSS软件具有上述众多优点，国内众多金融、财经类院校选择将统计软件SPSS课程设置为它们的专业必修课程。因此，研究统计软件SPSS的教学方法和规律，是一项必要且具有现实意义的工作。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

选取采自大陆地区7大省份(海南、福建、安徽、广西、湖南、四川和云南)及台湾地区(花莲、嘉义)共10个群体77个荒川库蠓标本，标本详细信息如表1。环斑库蠓Culicoides circumscriptus(N267)作为外群，用于构建荒川库蠓单倍型分子进化树。蠓类鉴定结果由蠓类专家虞以新研究员进行复核。

我给众兄弟介绍阿斯哈图石阵来由时用的也差不多是这套语风：第四纪大冰川期260万年前活活给整个地球北半球造个千米以上厚度的大冰盖子，冰盖下面啥手脚都可做得，再硬的岩石也得让它随便给揉巴了。甭说岩石，连整个大兴安岭，原来本有个小3000米海拔高度，让大冰盖削瘪犊子一样活活削下去近千米；大兴安岭这个郁闷：你把我削得这么惨，好歹给留个念想啥的？结果一脚没踩住，把个石阵给冒出来了。

1.2 基因扩增

采用线粒体基因COⅠ、16S rDNA及核基因ITS进行分析，引物信息见表2。对实验中所有ITS样品均克隆后测序，其余为PCR产物测序。为确保所获基因序列的准确，所有的样品均双向测序。

 

表1 不同种群的荒川库蠓样本信息Tab.1 Data of different geographic populations of Culicoides arakawai

  

种群Geographic population种群代码Code样本数Species number采样日期Date经度Longitude纬度Latitude安徽淮南 Huainan, An'huiAH1018-July-2013117°04' E 32°37' N福建戴云山 Daiyunshan, FujianFJD105-Aug-2013118°34' E 25°42' N福建平潭 Pingtan, FujianFJP122-June-2010119°46' E 25°33' N广西宁明 Ningming, GuangxiGX1020-Mar-2013107°05' E 22°05' N湖南怀化(湘)Huaihua, Hunan (Xiang)HNX1111-July-2013109°59' E 27°32' N海南五指山(琼)Wuzhishan, Hainan (Qiong)HNQ924-June-2013109°30' E 18°46' N四川峨眉 E'mei, SichuangSC97-Mar-2014103°30' E 29°37' N云南安宁 An'ning, YunnanYN117-Mar-2014102°27' E 24°57' N台湾花莲 Hualian, TaiwanTWH829-Nov-2013121°33' E 23°51' N台湾嘉义 Jiayi, TaiwanTWJ77-Oct-2013120°11' E 23°27' N

 

表2 各基因所用的引物信息Tab.2 Information of PCR primers used

  

基因 Gene引物 Primers 引物序列Primer sequence(5'-3)'退火温度 Annealing temperature(℃)文献 ReferenceCOⅠLCOⅠ490GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG48Flomer et al., 1994HCO2198TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA48Flomer et al., 199449FAATCATAAAGATATTGGAAC48Data unpublished734RCCAAAAAATCAAAATAAATGTTG48Data unpublished16S rDNA16SR21GCCTGTTTATCAAAAACAT48Yeh et al., 200416S22CCGGTCTGAACTCAGATCA48Yeh et al., 2004ITSPanculFGTAGGTGAACCTGCGGAAGG52Cetre-Sossah et al., 200428Sj2GTTAGTTTCTTTTCCTC52Data unpublished

1.3 序列处理与分析

将测序结果用SeqmanⅡ(Burland, 2000) 辅以人工校正完成序列的拼接。多序列比对采用MAFFT v7 (Katoh et al., 2013)，比对后切齐。对于编码蛋白的基因运用无脊椎动物遗传密码子 (Invertebrate Mitochondrial Genetic Code) 对其进行翻译检测。应用MEGA v5.2 (Tamura et al., 2011)进行各基因的序列特征分析，包括可变位点 (variable sites)、保守位点 (conserved sites)、单态位点(singleton sites)、简约信息位点 (Parsimony informative sites) 以及遗传距离的运算。

基于线粒体COⅠ、16S rDNA基因和基于核基因ITS对不同种群荒川库蠓的遗传关系分析结果均表明，各种群间的遗传距离较小(COⅠ: 0.001～0.060，平均距离0.015；16S rDNA：0～0.014，平均距离0.004；ITS：0.004～0.011，平均距离为0.007)，各种群与外群的遗传距离基本一致(COⅠ: 0.206～0.212、16S rDNA: 0.106～0.110、ITS: 0.163～0.168)。从总体来看，线粒体基因和核基因虽然均表现出较高的单倍型多样性(COⅠ: Hd=0.706、16S rDNA: Hd=0.675、ITS: Hd=0.985)，但核苷酸多样性却均较低(COⅠ: Pi=0.005、16S rDNA: Pi=0.002、ITS: Pi=0.006)，且基于核基因的单倍型多样性和核苷酸多样性均大于线粒体基因组而具有较高的遗传多态性，3个基因中以16S rDNA的单倍型多样性和核苷酸多样性最低。据此，可推测荒川库蠓可能是在较短的历史时期内才定殖于大陆及台湾地区，由于定殖时间短，单位时间内所积累的变异较少，导致群体遗传差异小。线粒体基因，如16S rDNA的保守性较强，利用核基因和线粒体基因联合分析能够弥补单类型基因遗传信息有限的缺陷，为不同种群的亲缘关系研究提供更加丰富的演化资讯。

1.4 系统发育

应用MrMTgui+PAUP 4.0b10+MrModeltest v2.3 (Swofford, 2001;Nylander, 2004)根据AIC (Akaike information criterion) 原则进行核苷酸替代模型的选择。分别应用最大似然法 (Maximum Likelihood, ML)、贝叶斯法 (Bayesian) 对COⅠ+16S rDNA+ITS联合基因单倍型构建系统发育树推论其可能的亲缘关系。ML法应用PhyML 3.0在线版 (http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/)，bootstrap 为1000。三个基因的BIs分析由MrBayes v.3.2 (Ronquist et al., 2012) MCMCMC运行1×107代。树的25%作为burn-in，其他数据用于建合一树。

1.5 遗传多样性及遗传结构

人才自古要养成，放使干宵战夜雨。梳理关键环节，进行本地化创新；以绩效为导向，促住培持续改进。他们传承人才培养文化，勇当“住培试验田”。

1.6 种群变动分析

AMOVA结果表明，在线粒体基因数据集中，绝大部分遗传变异出现在种群内(96.75%)，部分变异出现在不同地理区间 (1.81%)，仅少数的变异出现在地理区内的不同种群间 (1.44%)(表7)。在核基因数据集中，绝大部分的变异也是出现在种群内 (91.44%)，地理区内种群间与地理区间所分布的比例均较少，分别为12.64%和-4.08%(表8)。

2 结果

2.1 碱基组成与序列分析

采用Tajima′s D Test 对荒川库蠓各地理种群进行中性测验 (Neutral test)(表9)。基于线粒体联合数据集的检测结果表明：除GX、HNX、HNQ、SC 4个种群中性检验结果显著(P<0.01或P<0.05)，其余种群均不显著；而基于核糖体基因数据集的检测结果仅有GX和HNQ 2个种群达到显著水平(P<0.01或P<0.05)。不同数据集均表明，荒川库蠓总体上在较近的历史时期内未经历明显的种群扩张，Tajima D值虽然为负值但不显著 (P>0.10)。应用DnaSP v5.0 对不同地理种群的COⅠ+16S rDNA单倍型序列进行错配分析(mismatch distribution)(图2)，所有的COⅠ+16S单倍型呈现为一条不完整平滑且多峰型曲线，说明荒川库蠓在过去呈现稳定状况。

2.2 遗传距离

基于线粒体COⅠ和16S rDNA基因对不同种群荒川库蠓的遗传关系分析结果表明，各种群间的遗传距离较小(COⅠ: 0.001～0.060，平均距离0.015；16S rDNA：0～0.014，平均距离0.004)，各种群与外群的遗传距离基本一致(COⅠ: 0.206～0.212、16S rDNA: 0.106～0.110)(表3)；基于核基因的不同种群遗传距离为：0.004～0.011，平均距离为0.007，各种群与外群的遗传距离也基本一致(0.163～0.168)。各种群内的遗传距离分别为0.001～0.013 (COⅠ)、0～0.004 (16S rDNA)、0.002～0.012 (ITS)(表4)。

 

表3 荒川库蠓不同种群COⅠ与16S rDNA基因的K2P遗传距离

 

Tab.3 Genetic distance of COⅠ and 16S rDNA in different populations of C. arakawai based on K2P model

  

种群代码CodeAHFJDFJPGXHNXHNQSCYNTWHTWJ外群Out groupAH0.0010.0000.0020.0010.0010.0000.0140.0010.0020.110FJD0.0040.0000.0020.0010.0000.0000.0140.0000.0010.110FJP0.0060.0010.0020.0010.0000.0000.0140.0000.0010.110GX0.0100.0070.0070.0030.0020.0020.0130.0020.0030.110HNX0.0050.0010.0020.0070.0010.0010.0140.0010.0020.110HNQ0.0050.0010.0020.0070.0010.0000.0140.0000.0010.110SC0.0050.0010.0030.0080.0020.0020.0140.0000.0010.110YN0.0590.0590.0590.0530.0590.0600.0600.0140.0140.106TWH0.0050.0010.0010.0070.0020.0020.0020.0590.0010.110TWJ0.0050.0010.0020.0080.0020.0020.0020.0590.0020.110外群Out group0.2100.2080.2060.2080.2080.2080.2080.2120.2070.208

注: 下半矩阵为COⅠ，上半矩阵为16S rDNA。种群代码请参照表1，下同。

Note: The matrix in lower-left is COⅠ, the upper-right one is 16S rDNA. For population codes, please, refer to Tab. 1, and the same below.

2.3 单倍型、核苷酸多样性

对荒川库蠓10个不同地理种群COⅠ、16S rDNA及ITS基因序列进行分析，由表5可以看出，不同地理种群间存在一定的遗传差异。77个荒川库蠓标本的COⅠ基因共检测出26个单倍型，所有个体平均单倍型多样性Hd=0.706，平均核苷酸多样性Pi=0.005，核苷酸平均差异数K=3.408。16S rDNA基因数据集中，共检测出17个单倍型，所有个体平均单倍型多样性Hd=0.675，平均核苷酸多样性Pi=0.002，核苷酸平均差异数K=1.181。从总体上看，在线粒体数据集中，77个荒川库蠓样本共检测出39个单倍型，多态性位点S=77，单倍型多样性Hd=0.907，核苷酸多样性Pi=0.005，平均核苷酸差异数K=3.716。ITS基因数据集中共检测出54个单倍型，所有个体平均单倍型多样性Hd=0.985，平均核苷酸多样性Pi=0.006，核苷酸平均差异数K=5.692。相比其他各种群，GX与HNQ的核苷酸多样性或单倍型多样性在不同的基因内可能较高，如GX在COⅠ基因中的核苷酸多样性达0.012，在16S rDNA基因中达0.004，在核基因ITS中，该两个种群的单倍型多样性最高，分别为1.000及0.933。

利用DnaSP v5.10软件进行种群间与种群内的遗传多样性 (genetic diversity)分析，分别计算各种群单倍型数 (numbers of haplotypes, h)、单倍型多样性 (haplotype diversity, Hd)、核苷酸多样性 (nucleotide diversity, Pi)、核苷酸平均差异数 (Average number of nucleotide differences, K)。利用Arlequin v 3.01中的分子变异分析 (Analysis of molecular variance, AMOVA)分析遗传变异在各种群间、种群内与地理区间的分布模式与及不同种群间的遗传分化指数(F-statistics, FST)，以明确遗传分化的程度。FST值愈高，遗传分化程度越大。据分析，FST< 0.05，表示种群间无分化；0.05 < FST< 0.15，表示种群间呈现低度分化。

 

表4 荒川库蠓不同种群ITS基因的K2P遗传距离Tab.4 Genetic distance of ITS in the different populations of C. arakawai based on K2P model

  

种群代码CodeAHFJDFJPGXHNXHNQSCYNTWHTWJ外群 Out groupAHFJD0.006FJP0.0090.009GX0.0060.0060.009HNX0.0100.0100.0110.009HNQ0.0050.0050.0090.0040.009SC0.0050.0060.0060.0050.0090.005YN0.0060.0080.0090.0070.0110.0070.006TWH0.0050.0060.0090.0050.0090.0050.0050.007TWJ0.0050.0050.0090.0040.0090.0040.0050.0070.005Out group0.1650.1650.1670.1640.1680.1630.1640.1670.1640.164

2.4 遗传结构与遗传分化

本研究利用线粒体COⅠ、16S rDNA基因和核糖体ITS基因序列分析不同地理种群荒川库蠓的亲缘关系。从各基因的序列特征上看，3个基因都有明显的A+T碱基偏向性，其中，线粒体基因COⅠ和16S rDNA基因的A+T比例分别占总碱基的64.02%与75.31%，这与无脊椎动物线粒体DNA的基因特点一致(Wang et al., 2012; Ander et al., 2013; Tsai et al., 2014)。

以线粒体数据集及核糖体数据集为资料的遗传分化计算结果均显示，不同地理种群间的FST较低(表6)。在线粒体数据集中，以AH与FJD、AH与TWH、HNX与TWJ、HNQ与TWJ的分化程度中等且达显著水平(P<0.05)，其余地理种群间的遗传分化程度均较低，显著的FST值在0.093～0.127之间；在总体上，FST值为0.033，各种群之间的平均基因流Nm为1.86。在核糖体基因数据集中，以SC与TWJ的遗传分化指数最高(0.325)，显著的FST值在0.030～0.151之间；在总体上，FST值为0.086，各种群之间的平均基因流Nm为1.23。

中性测验(neutrality test)和种群变异分布检测(mismatch distribution)均利用DnaSP v5 进行运算，以测验种群是否经历种群扩张以及借助种群内遗传多样性的资料，推估种群大小变动的历史(population demographic history)。

 

表5 荒川库蠓不同地理种群各基因遗传参数表Tab.5 Genetic parameters of each gene in C. arakawai populations

  

COⅠ16S rDNAITShHdPiKhHdPiKhHdPiKAH70.8670.0074.71140.6440.0010.75660.9110.0054.133FJD20.3560.0010.35630.6000.0010.667101.0000.0068.489FJP1n/cn/cn/c1n/cn/cn/c1n/cn/cn/cGX50.7560.0128.15640.5330.0042.156101.0000.0056.156HNX60.7270.0021.09170.8730.0031.52760.8730.01213.200HNQ40.5330.0010.80030.3780.0010.40080.9330.0044.267SC60.8330.0021.55630.6670.0020.77860.8890.0044.556YN1n/cn/cn/c1n/cn/cn/c1n/cn/cn/cTWH40.7500.0021.03630.6790.0020.78660.8930.0069.357TWJ50.8570.0021.61950.9050.0042.19030.7620.0022.571All260.7060.0053.408170.6750.0021.181540.9850.0065.692

 

表6 基于线粒体和核糖体基因数据集的FSTTab.6 Population pairwise Fst value for mitochondrial and nuclear gene dataset

  

AHFJDGXHNXHNQSCTWHTWJAH0.0720.1510.1500.1430.1080.0690.303FJD0.0990.0290.0180.0250.0670.0040.096GX0.016-0.0050.104-0.0080.1590.0300.062HNX0.0410.0510.0160.1120.0970.0710.143HNQ0.0610.0250.0180.0010.1520.0160.113SC0.0410.0110.004-0.0060.0100.0570.325TWH0.100-0.047-0.0300.0670.0770.0450.099TWJ0.0940.035-0.0160.0930.1270.046-0.024

注：下半矩阵为基于线粒体联合数据集的FST，上半矩阵为基于核基因的FST. 粗体表示P< 0.05.

Note: The matrix in lower-left is the FST value of mitochondrial gene dataset, the upper-right one is that of nuclear gene. Values with P< 0.05 are in bold.

 

表7 荒川库蠓种群COⅠ+16S rDNA基因的地理区间遗传分化Tab.7 AMOVA of COⅠ+16S rDNA in populations of C. arakawai

  

变异来源Source of variation自由度(df)平方和Sum of squares方差分量Variance components变异百分率Percentage variation种团间Among groups38.0570.0341.81种群间Among populations within groups48.2220.0271.44种群内Within populations67121.2281.80996.75总和Total74137.5071.870100.00

 

表8 荒川库蠓种群ITS基因的地理区间遗传分化Tab.8 AMOVA of ITS in populations of C. arakawai

  

变异来源Source of variation自由度(df)平方和Sum of squares方差分量Variance components变异百分率Percentage variation种团间Among groups315.595-0.152-4.08种群间Among populations within groups430.8050.47112.64种群内Within populations67228.3873.40991.44总和 Total74274.7873.728100.00

2.5 系统发育分析

以环斑库蠓作为外群，利用COⅠ+16S rDNA+ITS构建荒川库蠓个体间的系统发育树。结果显示，邻接法 (NJ)、最大似然法 (ML)、贝叶斯法 (MrBayes) 三种方法构建的系统树拓扑结构基本一致。以BI树为例进行说明，所有的个体在系统树上分为三支，分别是AH5与AH7形成的lineageⅠ，YN1与GX9形成的lineage Ⅲ，及其他个体聚类形成的lineage Ⅱ。各个地理种群分散在各个支系中，呈现出较为复杂的分布格局(图1)。

2.6 荒川库蠓的种群历史分析

结果共获得77个荒川库蠓标本的COⅠ、16S rDNA以及ITS序列，经多序列比对后，三种基因用于分析的片段长度分别为658(共编码219个氨基酸，无碱基插入与缺失，也未出现终止密码子)、512、952 bp。在碱基组成方面，T、C、A、G的平均含量分别为：39.07%、18.56%、24.95%、17.42%(COⅠ)；40.99%、9.20%、34.32%、15.49%(16S rDNA)；34.86%、12.90%、35.07%、17.17%(ITS)，各基因均有明显的A+T偏向性。可变位点(variable sites)分别为：55 (COⅠ)、19 (16S rDNA)、109 bp(ITS)，其中简约信息位点(parsimony informative sites)分别为42(COⅠ)、9 (16S rDNA)、34 bp(ITS)。

 

表9 荒川库蠓各种群的Tajima′ s D 中性检验Tab.9 Tajima′s D neutrality test among different populations of C. arakawai

  

线粒体基因(Mitochondrial genes)核基因(Nuclear gene)Tajima's DTajima's D p-valueTajima's DTajima's D p-valueAH-0.918P>0.100.282P>0.10FJD-0.691P>0.10-1.2940.10>P>0.05GX-1.955**P<0.01-2.047**P<0.01HNX-2.011**P<0.01-0.412P>0.10HNQ-1.741*P<0.05-1.628*P<0.05SC-1.767*P<0.05-0.571P>0.10TWH-0.727P>0.10-1.3950.10>P>0.05TWJ-0.963P>0.101.354P>0.10All-1.347P>0.10-0.714P>0.10

注：* 差异显著； **差异极显著。Note： * Different; ** Significantly different.

  

图2 荒川库蠓COⅠ+16S序列单倍型错配分布图Fig.2 Mismatch distribution of COⅠ+16S haplotype of C. arakawai

3 讨论

分别以线粒体基因COⅠ+16S rDNA和核糖体ITS为资料，利用Arlequin对个体数大于3的种群进行AMOVA分析，以明确荒川库蠓不同地理种群间的遗传分化程度及其遗传结构。

我明白，一个人只有在帮助他人站起时才有权利俯视他。我能够从你们身上学到的东西是如此之多，可事实上已经意义寥寥，因为当人们将我敛入棺木时，我正在死去。

2.2.1 基质种类的筛选 通过前期穿心莲内酯的不同乳化剂、助乳化剂及油相的溶解度试验[8]，初步筛选出基质种类配伍组合，并按“2.1”项下方法制备穿心莲内酯自微乳，以外观、滴入水相中颜色为评价指标，进一步筛选基质结果，结果见表1。

本实验以线粒体基因数据集及核基因数据集为资料的遗传分化计算结果均显示，不同地理种群间的FST较低，具有显著性的FST值分别在0.093～0.127之间与0.030～0.151之间；在总体上，线粒体基因数据集及核基因数据集FST值分别为0.033与0.086。据统计分析，FST<0.05表示种群间无分化；0.05<FST<0.15，表示种群间低度分化；FST>0.15则表示种群间分化程度较大。因此，本研究中荒川库蠓核基因在种群间已出现低度分化，而线粒体基因在不同的地理种群间并无明显的分化。

主要仪器：FA1004A精密电子天平，上海菁海仪器有限公司；722型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；手持式折光仪，上海勃基仪器仪表有限公司；CT质构仪，美国Brookfield公司。

  

图1 系统发育BI树Fig.1 Phylogenetic inferences based on COⅠ+16S rDNA+ITS by Bayesian inference (the branch labels represent for bootstraps acquired from NJ, MP and posterior probability acquired from BIs, respectively)

基因流 (Nm) 是指生物个体的基因从一个种群转移至另外一个种群的过程，它通常是个体迁移的结果，其基本作用是削弱了不同种群间的遗传差异。一般认为：当Nm>1时，群体之间没有明显的遗传分化或遗传分化程度很低；当Nm<1时，表示存在着遗传漂变而发生了分化；通常Nm>4时，表明种群间的遗传交流比较充分(Allendorf, 1983)。本研究中基于线粒体基因数据集及核基因数据集的荒川库蠓的基因流Nm分别为1.86与1.23，说明各种群间的基因交流程度较高。

根据地理区划，本研究将荒川库蠓分为华中、东南、西南和华南4个种群。基于线粒体基因数据集和核基因数据集的AMOVA分析均显示，种群内的遗传变异明显高于不同地理区及地理区内的种群间，在线粒体基因数据集和核基因数据集中分别占总变异的96.75%和91.44%。COⅠ+16S rDNA+ITS联合基因建树也显示各个地理种群没有按照地理区划形成明显的结构，而是分散在各个支系中，呈现出较为复杂的分布格局，这些结果也显示荒川库蠓不同种群间的基因交流频繁。

线粒体基因联合数据集和核基因数据集对荒川库蠓进行中性测验的结果显示：荒川库蠓总体上在较近的历史时期内未经历明显的种群扩张，其Tajima′s D值虽然为负值但不显著(P>0.10)；而2个数据集均显示GX、HNQ 2个种群的Tajima′s D为负值并达到显著水平(P<0.01或P<0.05)，因此我们推测该两个种群在近期曾发生过种群扩张的现象。相比其他种群，GX和HNQ的核苷酸多样性或单倍型多样性在不同的基因内较高(GX: COⅠ-Pi=0.012, 16S rDNA-Pi=0.004, ITS-Hd=1.00; HNQ: ITS-Hd=0.933)。系统发育树的聚类结果也显示GX种群的部分样本与YN种群形成一个lineage Ⅲ，而AH的部分样品单独形成了lineageⅠ，在地理区位上，GX(广西)与YN(云南)均属于西南地区，而AH(安徽)则属于华中地区，为本实验样品采集地的最北部，因此，推测广西和云南一带可能是大陆地区荒川库蠓的分化中心，而安徽则可能是荒川库蠓分化为南北支系的过渡带，但由于代表的样本较少，还需进一步探讨。

在大陆地区，荒川库蠓主要分布在华中以南一带，本实验在该区域广泛采集标本，并采用线粒体COⅠ、16S rDNA基因结合核基因ITS对10个不同种群进行亲缘关系研究，结果显示不同种群间的荒川库蠓遗传分化程度低。这可能是由于以下几种原因所造成：(1)荒川库蠓在我国大陆及台湾地区的定殖时间较短，所积累的变异较小导致遗传多样性较低；(2)荒川库蠓体型较小，常定居在寄主动物血源附近，主动扩散能力弱，气流及人为因素是造成其远距离扩散的主要原因。不同地区间的家禽、牲畜或其他农产品的调运可能导致同一地区存在多个不同来源的荒川库蠓；(3)不同种群所受的自然选择的压力及方向可能大体相同，使得各种群在短的历史时期内无法形成明显的遗传分化。为进一步明确荒川库蠓的亲缘地理格局今后还需广泛补充广西、云南及其南部及安徽以北一带的标本，结合合适的遗传标记，以系统全面地研究荒川库蠓的遗传分化情况及其可能的扩散路径。

参考文献

Akiba K. Studies on the Leucocytozoon found in the chicken in Japan.Ⅱ. On the transmission of L. caulleryi by Culicoides arakawae. Jap. J. Vet. Sci., 1960, 11: 308-318.

Allendorf FW. Isolation, gene flow and genetic differentiation among population. In: Schonewald-Cox CM, Chambers SM, MacBryde B, Thomas L, editors. Genetics and conservation: a reference for managing wild animal and plant population. Menlo Park, California: Benjamin Cummings Publishing Company. 1983, 51-65.

Ander M, Troell K, Chirico J. Barcoding of biting midges in the genus Culicoides: a tool for species determination. Med Vet Entomol, 2013, 27(3): 323-331.

Avise JC, Arnold J, Ball RM et al. Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 1987, 18: 489-522.

Avise JC, Walker D, Johns GC. Speciation durations and Pleistocene effects on vertebrate phylogeography. Proc Biol Sci, 1998, 265(1407): 1 707-1 712.

Burland TG. DNASTAR′s Lasergene sequence analysis software. Methods Mol Biol., 2000, 132: 71-91.

Cetre-Sossah C, Baldet T, Delecolle JC, Mathieu B, Perrin A, Grillet C, Albina E. Molecular detection of Culicoides spp. and Culicoides imicola, the principal vector of bluetongue (BT) and African horse sickness (AHS) in Africa and Europe. Vet Res., 2004, 35(3): 325-337.

Flomer O, Black M. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol Biotech., 1994, 3: 294-299.

Katoh K, Standley DM. MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Improvements in Performance and Usability. Mol Biol Evol., 2013, 30(4): 772-780.

Ronquist F, Teslenko M, van der Mark P et al. 2012. MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Syst Biol., 61(3): 539-542.

Sun WKC. Laboratory colonization of two biting midges. Culicoides arakawae (Arakawa) and C. schultzei (Enderlein) (Diptera: Ceratopogonidae). Biol. Bull. Tunghai Univ., 1969, 39: 1-8.

Swofford DL. PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. In. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. 2001.

Tamura K, Peterson D, Peterson N et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol., 2011, 28(10): 2 731-2 739.

Tsai CL, Wan X, Yeh WB. Differentiation in stag beetles, Neolucanus swinhoei complex (Coleoptera: Lucanidae): Four major lineages caused by periodical Pleistocene glaciations and separation by a mountain range. Molecular Phylogenetics and Evolution. 2014, 78: 245-259.

Wang G, Li CX, Guo XX et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA Barcoding. PLoS ONE, 2012, 7(10): 1-11.

Yeh WB, Chang YL, Lin CH, Wu FS, Yang J. Genetic differentiation of Loxoblemmus appendicularis complex (Orthoptera: Gryllidae): Speciation through vicariant and glaciation events. Ann. Ent. Soc. Amer., 2004, 97(4): 613-623.