脑缺血卒中是一组急性起病的脑血液循环障碍性疾病，包括脑梗塞、脑出血、脑供血不足及短暂性脑缺血发作等类型，是血管疾病中最常见的类型[1]，约占脑血管病的75%～90%[2-3]，脑缺血卒中具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，严重危害人类的健康和生命。流行病学调查[4]发现，近年我国缺血性脑卒中发病率呈不断上升趋势。第二军医大学附属长征医院自制制剂“益气醒脑口服液”由黄芪、川芎、红花、桃仁、丹参、珍珠母、胆南星、枳实、炙远志、石菖蒲和生地黄十一味中药组成，以益气活血法为主，在临床治疗缺血性脑卒中方面取得良好的效果。近年来由于治疗时间窗“缺血半暗带”概念的提出，超早期治疗显得尤为重要。由于该制剂申报时间较早，目前所用制剂工艺存在较大缺陷，且质量标准仅检测黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，对工艺考察有较大局限性。本研究拟采用正交试验设计，以线栓法再灌注模型大鼠脑梗死面积、脑组织含水量、血脑屏障通透性、脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及脑组织病理形态学指标为评判标准，优选最佳提取工艺条件。

综上所述，压力超负荷和容量超负荷分别作用于心动周期的不同时段，引起向心性和离心性心脏肥大。但是，由于均为机械应力超负荷诱发，压力超负荷和容量超负荷心脏肥大在病因和病理改变上，并非泾渭分明的两类心脏重构，而是呈现相互交叉的特点，且在病变的不同阶段呈现动态变化。本文揭示了一些肥大相关信号在两类超负荷心脏重构中的差异，并初步提出了CaN和Akt信号通路可能分别是针对两类超负荷精准化治疗的靶点。其上下游调控因子在两类超负荷心脏重构中的调控差异，尚需进行深入研究。

1 材料与仪器

1.1 仪器

JA2003A型电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；DHP-9272型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；H-600透射电子显微镜，KY2000半自动生化分析仪(日本日立公司)；5415R离心机(德国Eppendrof公司)；1200LC高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.2 试药

益气醒脑口服液(中药材采购自铜陵禾田中药饮片有限公司，由第二军医大学长征医院制剂室制备)；药用酒精(太仓新太药用酒精厂，批号：160601)；脑血康(山东昊福药业集团制药有限公司，批号：20151106)；0.9%氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司，批号：D15101402)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160426)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(BIO BASICINC，批号：LJ0508B1009J)；伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160218)；甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160304)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111920-201505)；其余所用试剂均为分析纯。

1.3 动物

SPF级SD雄性大鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号码：SCYK(沪)2013-0016；饲养条件：室温20～25 ℃，湿度40%～70 %，标准饲料，动物自由饮食和饮水，光线12 h明暗自动转换。

2 方法与结果

2.1 正交设计观察益气醒脑口服液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响

受拼多多火热上市的影响，许多声音在探讨“消费降级”的事，认为当下经济形势不是“消费升级”而是“消费降级”，否则“拼多多”为什么低价品这么火？事实上广大低收入消费者，如农村消费者就是因为向往高的消费品质，喜欢用上中产及以上消费者用上的消费品，才在拼多多上拼团购物，哪怕是雷同于名品，只是有时不知是假货或山寨而已。就像化妆品消费者明明消费不起兰蔻，但包里要装上兰蔻的瓶子道理是一样的，这从消费形态上来说那是“消费降级”，而是“消费升级”好不好？只能兜里钱少了些，很无奈而已。

表1 正交影响因素设计

加水量(A)提取时间(B)提取次数(C)醇沉浓度(D)水平14倍1h1次40%水平28倍2h2次60%水平312倍3h3次80%益气醒脑1组1111益气醒脑2组1222益气醒脑3组1333益气醒脑4组2123益气醒脑5组2231益气醒脑6组2312益气醒脑7组3132益气醒脑8组3213益气醒脑9组3321

2.2 栓线法制备动物模型

实验大鼠随机分为12组，每组6只，提前7 d给药；假手术组、模型对照组分别给予0.9%NaCl灌胃(3 mL/kg)；阳性对照组给予脑血康(45 mg/kg)；益气醒脑1～9组分别给予不同提取工艺的益气醒脑口服液(3 mL/kg)。第7天给药1 h后，将大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，分离、结扎左侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉，根部结扎该分枝。分离左侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉切口，插入栓线，深度为18 mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1 cm长线头，缝合皮肤。脑缺血2 h后，轻轻提拉所留线头至颈总动脉切口处，血流再灌注[5-7]。假手术组除不插线处理外，其余步骤同上。术后放入笼中饲养观察。各组在脑缺血后30 min灌胃给药1次。脑缺血2 h再灌注24 h后对存活大鼠行TTC染色，采用Photoshop软件计算脑梗死和全脑面积比例，计算脑组织含水量，生化分析仪测定血脑屏障通透性及脑组织SOD、MDA的影响。

2.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行差异显著性检验，检验水准ɑ除特别说明外均设定为0.05。

2.4 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑梗死面积的影响结果

大鼠脑缺血2 h再灌注24 h脑组织出现梗死，模型组大鼠的脑梗死比例为(30.32±2.12)%；与模型组相比，益气醒脑口服液各组和阳性对照组脑梗死比例均降低，其中益气醒脑5组梗死比例为(18.25±1.86)%，益气醒脑7组为(18.68±1.15)%，益气醒脑9组为(18.41±3.07)%，阳性对照组为(19.1±1.78)%，与其他治疗组相比疗效最佳，差异具有统计学意义(P<0.01)(图1)。

图1 各组大鼠缺血性再灌注后脑组织梗死面积结果 注：与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05

2.5 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织含水量的影响结果

光镜结果显示：假手术组大鼠脑组织皮层各神经元层次清楚、排列整齐，未见水肿及出血，脑内神经元核仁清晰，神经细胞无肿胀，间质小血管无充血和水肿。模型组大鼠梗塞侧脑组织皮层结构排列紊乱、神经元肿胀，出现大量炎细胞浸润，血管周围间隙扩大，细胞周围明显水肿；神经元结构不清晰，细胞呈皱缩状、细胞核固缩消失；益气醒脑1～9组和阳性对照组大鼠梗塞侧脑组织病理改变有不同程度减轻，部分神经元呈不规则形态，神经元皱缩，细胞核浓染，细胞周围间隙增宽，毛细血管扩张充血减轻。其中益气醒脑5组大部分突触泡正常，少量轻度扩张，但前后膜结构较清晰，神经元细胞未见脂褐素颗粒，血管正常；益气醒脑7组神经元细胞染色质分布较为均匀，血管结构较为正常，较益气醒脑其他各组效果更好(图4)。

图2 各组大鼠缺血性再灌注后脑大脑含水量结果 注：与模型对照组比较，*P<0.05

2.6 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血脑屏障通透性的影响结果

模型大鼠经尾静脉注射2%的伊文思蓝-0.9%NaCl溶液(4 mL/kg)。注射2 h后，腹腔注射10%水合氯醛生理盐水溶液(3 mL/kg)麻醉大鼠，打开胸腔，从左心室插入注射针头，于右心耳部处剪一小口，向内注入0.9%氯化钠注射液，至右心耳流出液变清亮，打开颅腔取脑损伤部位约100 mg脑组织，加入3 mL甲酰胺中，50 ℃水浴72 h，1 500 rpm/min，离心10 min，上清液630 nm测定其OD值。

突出政治标准选拔干部，是党的十九大和全国组织工作会对干部队伍建设提出的新要求，为新时代选人用人工作树立了时代“标尺”，提供了根本遵循。由于干部政治表现的内在性、复杂性、可变性等特点，政治表现考准考实难、考深考细难。如何落实好突出政治标准选拔干部的要求，成为摆在各级组织部门面前一个亟待研究的重大课题。2018年以来，湖北省枣阳市委组织部结合高素质专业化干部队伍建设、“落实年”活动，组织市镇两级力量开展干部政治标准专题调研，形成了此调研报告。

图3 各组大鼠脑血脑屏障通透性EB含量的影响结果 注：与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05

2.7 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织病理形态学结果

大鼠缺血再灌注损伤后出现脑水肿，脑组织含水量增加。模型组大鼠脑含水量明显高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，益气醒脑1～9组和阳性对照脑血康组的脑组织含水量均不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但各组间差异不大，组间比较差异无统计学意义(图2)。

图4 光镜下大鼠闭合性颅脑损伤的脑组织病理形态学照片

2.8 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织SOD、MDA变化的结果

脑缺血2 h再灌注24 h后存活大鼠，用10%水合氯醛生理盐水溶液(3 mL/kg)麻醉，取少量脑损伤部位脑组织，匀浆，测定SOD、MDA含量。结果显示，各治疗组与模型对照组比较，脑组织SOD的含量均有明显上升：阳性对照组、益气醒脑5组、益气醒脑7组、益气醒脑9组nmol/mgprot，以上4组脑组织SOD含量上升程度较其他各治疗组更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

CRD法虽然已经被广泛地应用于大断面浅埋偏压隧道的建设，但仍存在一定的技术问题，主要包括施工指导问题和防排水技术问题，这或多或少地导致大断面浅埋偏压隧道建设存在一些问题。

图5 大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织SOD、MDA变化的结果

注：与模型对照组比较，*P<0.05

2.9 各益气醒脑组毛蕊异黄酮葡萄糖苷的检测结果

第二遍，核对答案，找出错误习题，参考纠错。通过孩子的自我查错、反思才能自我提高。后续复习能更有针对性的学习。

实验结果显示，模型对照组大鼠脑EB含量明显高于假手术组；与模型组比较，益气醒脑各组和阳性对照组(34.66±12.95)μg/g的脑组织EB含量均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示益气醒脑口服液可有效降低缺血性再灌注模型大鼠的脑EB含量；益气醒脑各组中，益气醒脑5组为(36.64±19.80)μg/g，益气醒脑7组为(36.86±9.21)μg/g，益气醒脑9组为(32.45±12.30)μg/g，此3组减低程度最大，差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。

水提醇沉法是广泛应用于中药的提取方法，其操作方法简单，生产成本低廉，适合规模化运用。本实验对工艺采用正交设计，以对中药提取影响最大的提取加水量、提取时间、提取次数为影响因素，参照L9(34)设计正交实验：加水量(A)为药材总量的4、8、12倍；提取时间(B) 1、2、3 h，提取次数(C)1、2、3次；醇沉浓度(D)40%、60%、80%；以大鼠脑梗死面积、血脑通透性、损伤脑匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)变化、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为指标，优选最佳提取工艺(表1)。

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，用20%乙腈溶解并稀释制成每1 mL中含20 μg的溶液，即得。精密量取各组益气醒脑口服液10 mL，离心(14 000 r/min)5 min，取上清液2 mL置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，每个样品测定3次。专属性试验、精密度考察(RSD 0.11%)、重复性考察(RSD 5.74%)、稳定性试验(RSD 2.19%)、 加样回收率(93.40%，RSD 3.59%)。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在Y=44.15X-16.20(R2>0.999 9)，即3.30～132.00 μg/mL范围内线性良好，杂质及基质对益气醒脑口服液的含量测定无影响，符合定量分析要求。

结果显示，益气醒脑5组、益气醒脑6组、益气

各益气醒脑组毛蕊异黄酮葡萄糖苷的检测采用色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相以乙腈为A相，0.2%甲酸溶液为B相，梯度洗脱(0～0.5 min,5%～10%A;0.5～22.0 min,10%～18%A),检测波长为250 nm,流速1 mL/min;柱温30 ℃；进样量为20 μL。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷计算应不低于5 000。

各治疗组与模型对照组比较，脑组织MDA的含量均下降：阳性对照组(11.82±7.29) nmol/mgprot，益气醒脑5组、益气醒脑7组、益气醒脑9组nmol/mgprot，以上四组脑组织MDA含量下降幅度较大，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

醒脑7组和益气醒脑9组毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量较其他各组高。结合正交设计发现，当醇沉浓度达到80%时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量明显大幅度降低，而60%的醇沉浓度较40%的醇沉浓度，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量虽有降低，但幅度不大，而用40%乙醇醇沉后，液体较为浑浊，沉淀较多影响成品质量，故采用60%乙醇醇沉处理(图6)。

图6 益气醒脑各组毛蕊异黄酮葡萄糖苷的检测结果

2.10 提取工艺优化结果

正交试验结果显示，益气醒脑5组、益气醒脑7组和益气醒脑9组综合药效结果较佳，考虑到益气醒脑口服液为中药口服液，需保证液体澄明度，而益气醒脑5组、益气醒脑9组的液体澄明度较益气醒脑7组沉淀较多，液体较为浑浊，故结合药效结果，选定益气醒脑7组工艺条件，即正交组合A3B1C3D2为最优提取工艺。

由表6可见，粗选时为保证精矿回收率应在较粗磨矿细度条件下(41.41%-0.074mm)进行分选；细磨不能大幅度提高精矿品位，反而使尾矿品位及金属损失率增高。

2.11 3批中试样品药学效实验验证

根据上述工艺扩大10倍量，生产3批中试样品，通过缺血性再灌注大鼠模型的以脑梗死面积、脑组织含水量、血脑屏障通透性、脑组织SOD、MDA、样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量和病理切片，考察提取工艺的稳定性，结果显示，按筛选的最优工艺提取的益气醒脑口服液，药效明确，质量稳定，适合作为本制剂的提取工艺(表2、图7)。

表2 3批中试样品的结果

组别脑梗死面积/%含水量/%EB/(μg/g)SOD/(nmol/mgprot)MDA/(nmol/mgprot)毛蕊异黄酮葡萄糖苷/(μg/mL)假手术组 -71.44±2.05*11.65±5.03*90.26±14.22*7.51±4.34*-模型组28.90±2.1777.87±1.7175.02±7.7255.38±7.6126.51±6.15-益气醒脑(170214)19.02±3.44*75.20±0.82*32.47±2.98*80.60±7.74*13.06±2.21*147.6益气醒脑(170216)19.88±2.61*74.10±1.45*32.01±4.26*76.60±9.33*11.47±4.58*159.2益气醒脑(170220)18.64±5.25*73.50±2.32*31.88±2.17*82.14±5.94*15.66±6.69*160.6

注：与模型对照组比较，*P<0.05

图7 3批中试样品的病理切片结果

3 讨论

大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)是临床上缺血性脑血管疾病的易患部位，现代医学认为，神经功能行为异常、脑梗死面积增大、脑组织形态结构改变是脑缺血再灌注导致脑损伤的主要表现，是研究急性缺血性脑中风发病机制的首要问题[8]。从中医角度认识中风病的病因，其一与“气滞血瘀”有关，类似于现代医学缺血性脑血管病；二是认为与风、火、痰有关，如肝风内动、肝火上炎、风火挟痰，类似于现代医学出血性脑血管病[9]。随着我国中药配方的不断科学化、合理化，中药成为治疗中风病的主要途径之一，益气醒脑口服液对治疗中风病疗效确切。中医传统复方的开发是现代中药产业化研究的热点，工艺研究是其难点之一[10]。由于中药组成复杂，药效成分尚未进行深入研究，有学者认为，目前多数研究采用单一的指标物质来衡量一个复方中药制剂的疗效存在客观片面性。因此，本研究尝试采用正交试验设计，评价模型大鼠脑梗死面积、脑组织含水量、血脑屏障通透性、脑组织SOD、MDA及脑组织病理形态学指标，为优选益气醒脑口服液的最佳提取工艺条件提供科学方法。

本研究通过再灌注损伤的大鼠模型，以脑梗死面积、脑组织含水量、血脑屏障通透性[11-12]、脑组织SOD、MDA及脑组织病理形态学[13]结合有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量来评判工艺优越性，可以有效规避这一缺陷。本研究显示，以提取时间为3 h，加12倍量水提取1次，60%乙醇醇沉(即A3B1C3D2)对大鼠再灌注损伤的大鼠模型疗效确切，显著优于其他制备工艺，是益气醒脑口服液的最佳工艺条件，通过三批样品在缺血性再灌注大鼠模型上的实验结果也显示工艺稳定，同时也符合质量标准对于样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量要求(>50 μg/mL)。受限于本研究样本量较小，尚需大量样本进一步研究。

综上所述，应用提取时间为3 h，加12倍量水提取1次，60%乙醇醇沉可显著改善益气醒脑口服液的疗效，同时保证其产品质量。

参考文献

[1]刘青萍, 晏峻峰, 刘芳, 等. 补阳还五汤精简方对脑缺血模型大鼠神经功能及脑梗死面积的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2014, 21(10): 54-57.

[2]Morsi N M, Ghorab D M, Badie H A. Brain targeted solid lipid nanoparticles for brain ischemia: preparation and in vitro characterization[J]. Pharm Dev Technol, 2013, 18(3): 736-744.

[3]Maxwell H, Hanby M, Parkes L M, et al. Prevalence and subtypes of radiological cerebrovascular disease in late-onset isolated seizures and epilepsy[J]. Clin Neurol Neurosurg, 2013, 115(5): 591-596.

[4]谭华丹. 急性脑血管病合并脑心综合征的临床分析[J]. 山西中医学院学报, 2008, 9(5): 46-47.

[5]吴国泰, 王瑞琼, 曾立斌, 等. 大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型的制作规范与评价[J]. 甘肃中医学院学报, 2006, 23(6): 46-50.

[6]贾淑伟, 夏青. 线栓法建立局灶性脑缺血模型的方法与探讨[J]. 中国医药导报, 2014, 11(24): 33-35.

[7]赵涓涓, 柯国平, 汤俊, 等. 线栓法大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血再灌注鼠模型的脑水肿和脑梗死比的变化[J]. 数理医药学杂志, 2006, 19(4): 366-369.

[8]中华中医药学会．中医体质分类及判定[M]．北京:中国中医药出版社, 2009: 1-7．

[9]姚巧林. 中风病的病因病机及历史形成过程[J]. 中国临床康复, 2006(27): 131-133.

[10] 杨培民, 曹广尚. 药效学结合正交实验优选重楼克感滴丸的提取工艺[J]. 中华中医药学刊, 2016, 34(1): 11-13.

[11] 王利苹, 奉建芳, 胡凯莉. 芳香开窍中药对血脑屏障通透性的调节作用及其机制研究进展[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(6): 949-954.

[12] 滕伟禹, 高岩, 田力, 等. 大鼠实验性脑出血后水通道蛋白4 mRNA表达与血脑屏障通透性的关系[J]. 中国动脉硬化杂志, 2006, 14(4): 330-332.

[13] 姜习灸, 陆国才, 顾长虹, 等. 醒脑饮药效学实验观察[J]. 中药新药与临床药理, 1994, 5(3): 34-36,65.

对于企业发展而言，一个优势的企业人力资源整体必须具备一个科学合理的薪酬设计，促进企业内部薪酬制度的公平、透明。其中，企业薪酬制度的透明程度越高，员工对于薪酬公平性感知也就越具体。