普鲁兰多糖（pullulan）是1938年由R.Bauer发现的一种特殊的微生物多糖[1]，是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖普鲁兰多糖，具有无毒、水溶性好以及表面易于修饰等特点，目前正被逐渐应用于纳米药物载体的研究中。然而对普鲁兰进行疏水化修饰制备纳米药物载体的研究很少，且与形成的载药纳米粒的毒性、细胞摄取和体内生物效应相关的研究也很少[2]。

鉴此，文中采用透析法制备PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒[3]，合成还原敏感的经硬脂酸疏水改性的普鲁兰多糖，使其在水溶液中能够自组装形成纳米粒子，并结合纳米粒子体外细胞毒性试验综合评估其作为药物载体的效果。

1 材料和方法

1.1 PSSSA和PSA自组装水凝胶纳米粒的制备

采用透析法制备PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒：分别准确称取10 mg PSSSA和PSA样品溶于2 ml的D M SO中，然后转移至透析袋（M W CO 6000-8000），放置于1 L的超纯水中透析48 h，前12 h每3 h换水1次，后36 h每隔8 h换水1次，将D M SO熔剂彻底透析干净后，取出溶液，50 W超声波清洗2 min，于10 ml容量瓶中定容。用0.45 μ m滤膜过滤即得到PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒。

岩样采用薄壁金刚石钻头沿垂直于岩层方向钻取岩芯，经过锯、磨加工成直径为50 mm，高为100 mm，试样两端面不平行度不大于0.05 mm，满足《规程》要求，60组共计180个试样，制备部分试样，如图2所示，其中顶板岩石用A编号，底板岩石用B编号。试验在RMT-150B型电液伺服岩石力学试验系统进行单轴压缩试验，如图3所示。轴向荷载采用1 000 kN力传感器测量，轴向压缩变形采用5.0 mm位移传感器测量，变形精度为1.0×10-3 mm，采用位移控制方式，加载速率为0.002 mm/s，每组岩性重复进行3次试验。煤层顶底板岩石单轴压缩试验结果见表1。

1.2 PSA和PSSSA粒径、Zeta电位、临界胶束浓度（CMC）的测定

PSA和PSSSA自组装纳米粒的粒径、Zeta电位和多分散指数（PD I）根据动态光散射原理（D LS），在室温条件下用1 mg/ml浓度的PSA和PSSSA自组装纳米水凝胶通过纳米粒度与Zeta电位分析仪测得，每个样品测3次。采用稳态荧光探针法来测量PSA和PSSSA的CM C。

1.3 PSA/DOX和PSSSA载药纳米粒的体外细胞试验

2.2.1 细胞毒性能 利用CO S-7细胞作为正常细胞组进行空白纳米粒的毒性试验，以便对载体的安全性能进行评估。从图2可以看出，PSA与PSSSA在浓度达到500 μ g/μ l时，CO S-7细胞的存活率均在90%以上，说明空白纳米粒对CO S-7细胞基本无毒，即PSA和PSSSA载体均具有良的生物相容性。同时还能看出随着空白纳米粒浓度的升高，细胞毒性逐渐加大。

1.3.2 细胞溶血性试验 取健康新西兰大白兔新鲜血液8 ml，加入肝素抗凝，加入10 ml 0.9%生理盐水稀释，向1 ml的不同浓度PSSSA和PSA中加入100 μl稀释血液，于37℃中温育12 h，750 rpm离心5 min，加入2 ml乙醇/盐酸，再750 rpm离心5 min，测其在398 nm处的吸光值。阴性对照为0.9%生理盐水，阳性对照为水。公式为：

细胞存活率（%）=（O D损伤孔-O D损伤孔空白）/（O D对照孔-O D对照孔空白）×100%。

黑影跑远了，我也反应过来，赶紧回撤几步贴住墙，吓出了一身冷汗。四下里辨认了一阵，发现我站的地方正是李老黑家大门口。这人是谁呢，半夜三更在李老黑家门口干啥，撬门的小偷，还是想对李老黑实施打击报复的村民？我知道，李老黑当支书二十几年，好事干了几箩筐，坏事干了也有几箩筐，得罪过不少人，别看村民嘴上敢怒不敢言，背后扔个黑砖什么的也不稀罕。

溶血率（%）=（O D样品-O D阴性）/（O D阳性-O D阴性）×100%

2 结果与分析

2.1 PSA和PSSSA自组装纳米粒的基本性质

2.2.2 细胞溶血性 利用新西兰大白兔新鲜血液作为正常细胞组进行空白纳米粒的溶血性试验，从表2可以看出，随着PSA空白纳米粒浓度的增加，溶血率没有出现特别明显的趋势变化；而随着PSSSA空白纳米粒浓度的增加，溶血率逐渐增加。

 

表1 PSA和PSSSA自组装纳米粒的基本性质

  

样品 粒径∥nm Zeta电位∥mV CMC∥μg/ml PSA 189.53±9.42 -12.9±0.3 98.5 PSSSA 216.05±6.03 -10.4±0.4 133.35

2.2 PSSSA/DOX和PSSSA/DOX载药纳米粒的体外细胞试验结果

1.3.1 MTT法检测PSA和PSSSA载药纳米粒的细胞毒性 将指数生长期的CO S-7细胞用细胞胰酶消化，调节细胞浓度为5×104个/ml，以200 μl/孔接种于96孔板，37℃，5%CO2培养24 h后加入一定浓度梯度的空白纳米粒或载药纳米粒悬液于培基中，37℃，5%CO2培养48 h，弃掉培养液，每孔加100 μl M TT溶液（终浓度为0.5 mg/ml）于5%CO2，37℃培养4 h。小心吸去培养液并加入D M SO（100 μl/孔）溶解蓝紫色的甲瓒，震荡2 min待结晶充分溶解后用酶标仪测定570 nm的O D值，参考波长为630 nm，分别设计正常对照和空白对照（不加药物为正常对照组，空白培养基为空白组），每个样品平行测定3次，计算细胞存活率。公式为：

从表1可以看出，透析法制备的PSA和PSSSA自组装纳米粒在超纯水中的平均粒径分别为189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm，Zeta电位分别为－12.9±0.3 mV和－10.4±0.4mV。结合作图（图1）计算得出PSA在胶束浓度 98.5 μg/ml以上时成球，PssSA在胶束浓度133.35 μg/ml以上时成球，即可形成自组装纳米粒。可见，PSA的粒径和CM C小于PSSSA，但其Zata电位大于PSSSA，这可能是由于PSSSA中加入了二硫键，使其电位降低。

光子沿Z轴正方向发射，初始坐标为(0,0,0)，第一次碰撞点为(0,0,l1)，l1为第一次光子行进步长.根据Lambert-Beer定律，对分布函数进行抽样，得到光子发生下次碰撞需要行进的步长l为

  

图1 PSA和PSSSA自组装纳米粒的荧光发射光谱I372/I383比值与浓度对数之间的关系

  

图2 载药纳米粒对COS-7细胞的细胞毒性

 

表2 载药纳米粒对新西兰大白兔血液的溶血性

  

样品 实际浓度∥mg/ml 溶血率PSA 0.25 0.418 467 0.50 0.031 607 1.00 0.419 908 PSSSA 0.25 0.284 550 0.50 0.318 695 1.00 0.622 902 PBS - 0 WATER - 0.952 153

3 结论

（1）采用透析法制备经硬脂酸修饰的普鲁兰多糖（Pullulan）衍生物PSA和PSSSA自组装水凝胶纳米粒，粒径大小分别为189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。经稳态荧光探针法测得PSA和PSSSA临界胶束浓度分别为0.0 985 mg/ml和0.13 335 mg/ml。表明PSA和PSSSA衍生物在水溶液中均能够自组装形成水凝胶纳米粒。

（2）M TT法测定的细胞毒性试验结果显示，当空白纳米粒的浓度高达500 μg/μ l时，CO S-7细胞在48 h后存活率依然在90%以上；溶血性试验中，PSA和PSSSA浓度达到1 mg/ml时，溶血率依然在5%左右，表明PSA和PSSSA载体均基本无毒，生物相容性较好。

本研究显示，不同疾病分期的缺血性股骨头坏死患者，其经微创减压植骨生物陶瓷棒植入术治疗12个月后的Harris评分明显高于术前。表明微创减压植骨生物陶瓷棒植入术的应用，可较好改善患者的髋关节功能，为其预后的改善奠定基础。本文研究结果与尚炜，赵刚，舒钧等研究结果相比，一致性较高，表明本文研究具有一定的参考价值。

参考文献

[1]王浩，张晓军，沈佳佳，等.一种新型的胞外多糖——普鲁兰[J].中国食品添加剂，2005（6）：60-63.

[2]崔双.生育酚改性普鲁兰自组装纳米胶束用于抗癌药物的传递[D].大连：大连理工大学，2013.

[3]蒋丽琴.胆固醇基普鲁兰自组装纳米粒与肝癌细胞相互作用的研究[D].北京：北京协和医学院中国医学科学院；北京协和医学院；中国医学科学院；清华大学医学部，2013.