ItemsBD-ABD-RMean(y)34.20±11.2040.10±11.78Male/Female(n)6/45/5Diseaseduration(y)6.53±6.0610.70±8.19Oralulcers9(90)4(40)Genitalulcers4(40)1(10)Ocularlesions2(20)2(20)Erythemanodosum6(60)5(50)Folliculitis3(30)2(20)Jointinvolvement2(20)1(10)Intestinalulceration2(20)0Cardiovascularinvolvement2(20)1(10)Centralnervoussystem2(20)1(10)Pathergytest01(10)

荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription-PCR)　提取总RNA;按照cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA;参照Genbank中人TNF-α、IFN-γ和IL-17基因序列设计合成,所用引物见表1。按逆转录M-MLV1试剂盒(TAKARA公司)说明书依次加入以下试剂建立20 μL PCR反应体系:10 μL Subgreen mix (2×),正、反义引物各0.5 μL,1 μL RT反应液,8 μL的DEPC dH2O。于Applied Biosystems 7900HT荧光定量PCR仪(加拿大Funglyn Biotech公司)上进行扩增反应,绘制扩增曲线,通过2-△△Ct计算目的基因表达水平。

统计分析　采用Graphpad Prism5统计软件,计量资料以表示。年龄、病程组间比较采用单因素方差分析;性别比较采用Fisher确切概率法检验;使用双因素方差分析比较BD和抑制剂因素对细胞实验结果的影响;Bonferroni post hoc test事后检验比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。

讨　　　论

2.企图接近型：指行为人与被害人并不会当面接触，但就空间及距离而言，实际上行为人非常靠近被害人，被害人甚至得以知觉到自己被跟踪、纠缠而产生困扰，典型范例如尾随、跟追，站岗等候而造成被害人处于心理压力之下。

本文研究STAT3磷酸化特异性抑制剂Sattic对BD患者PBMC细胞STAT3、pSTAT3以及Th1、Th17相关细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17水平的影响。Stattic为卟啉类非肽小分子,是STAT3磷酸化的特异性[15-16],通过与STAT3的SH2功能区结合,抑制STAT3在Tyr705位点磷酸化,以抑制STAT3基因表达、蛋白质活化、二聚体形成而抑制STAT3核转运。近来研究提示,STAT3磷酸化作用增强可能与BD免疫应答相关,Wang等[17]研究发现,与免疫应答相关的芳烃受体基因(aryl-hydrocarbon receptor,AhR)基因在BD-A患者PBMC中表达比BD-R患者和HC减低,同时STAT3和STAT5的磷酸化作用增强。本研究结果显示,与HC比较,BD -A、BD -R组pSTAT3、STAT3蛋白质水平均升高;BD活动性增加,pSTAT3和STAT3蛋白质水平均增加;磷酸化作用被抑制时总体STAT3和pSTAT3蛋白质水平均减少;且BD -A患者的pSTAT3和STAT3蛋白质水平显著高于BD -R组。研究结果说明,STAT3通路在BD中激活且与BD活动性相关。

A:pSTAT3 and STAT3 expression analyzed by flow cytometry;B:Relative protein expression of pSTAT3;C:Relative protein expression of STAT3.HC:Health control;BD -R:BD -remission;BD -A:BD -active.(1)P<0.01.

图1　pSTAT3和STAT3在3组的空白对照亚组和Stattic抑制剂亚组PBMC细胞内蛋白质水平流式细胞术检测结果 Fig 1　pSTAT3 and STAT3 protein expression levels in PBMC of the blank control subgroup and theStattic subgroup from the three groups by flow cytometry

A:The protein bands of pSTAT3 and STAT3;B:Relative protein expression of pSTAT3;C:Relative protein expression of STAT3.HC:Health control; BD -R:BD -remission; BD -A:BD -active.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

图2　pSTAT3和STAT3在3组的空白对照亚组和Stattic抑制剂亚组PBMC细胞内蛋白质水平Western blot检测结果

Fig 2　pSTAT3 and STAT3 protein expression levels in PBMC of the blank control subgroup and theStattic subgroup from the three groups by Western blot

JAK/STAT 通路对Th1和Th17细胞分化具有重要作用[4-7]。而既往研究提示Th1和Th17细胞在BD中表达均增强,并与BD疾病发生与活动性相关[7,9,18-20],且Th1和Th17相关细胞因子如IL-17、IL-23和TNF-a在BD发病机理中起关键作用[9,21-22]。Tulunay等[7]发现,STAT3信号通路在BD中的激活可能是通过上调Th1 / Th17相关细胞因子(如IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-23)的水平。IFN-γ是经典的Th1类细胞因子。Zhou等[9]研究表明,BD葡萄膜炎患者房水中的IFN-γ水平显著高于白内障等疾病引起的葡萄膜炎患者。IL-17是Th17细胞最具代表性的细胞因子,在BD-A患者血清中显著升高,可通过诱发T细胞黏附而导致炎症反应和组织损伤[10]。TNF-a主要由Th1细胞和巨噬细胞产生,通过诱导促炎因子和黏附分子表达而导致局部炎症,且TNF-a升高与BD活动性相关。近年来,TNF-α抑制剂已应用于难治性BD的临床治疗[22]。本研究中,BD-A和BD-R组TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白质和mRNA水平均高于HC;Stattic抑制剂则下调TNF-α、IFN-γ和IL-17水平。其中BD-A组TNF-α和IFN-γ水平在空白对照亚组显著高于BD-R组,抑制STAT3磷酸化后与BD-R组相比差异无统计学意义;IL-17蛋白质则在空白对照亚组中差异无统计学意义,而Stattic抑制亚组中BD-A组显著高于BD-R组。IFN-γ是经典的Th1类细胞因子,TNF-a主要由Th1细胞和巨噬细胞产生;IL-17是Th17细胞相关细胞因子。由此,STAT3通路激活时Th1细胞相关细胞因子在BD-A组中水平较BD-R组高;STAT3通路抑制后,Th17细胞相关细胞因子在BD-A组中水平高于BD-R组。本文结果提示,STAT3磷酸化可能对Th1和Th17细胞活化均有促进作用,且对Th1细胞活化影响较大。抑制STAT3磷酸化可降低BD患者Th1、Th17相关细胞因子水平,STAT3通路激活可能介导BD患者Th1、Th17活化且与BD活动性相关。由此推测,抑制BD患者STAT3磷酸化可延缓BD进程,改善患者症状。

财务会计与管理会计作为会计学科的重要组成部分，两者的核算对象就是对企业各项经营活动。以企业经营活动为主体，通过科学的手段进行核算和管理，确保企业经营活动能够顺利开展。

抑制IL-6、JAK等上游信号通路、干扰STAT3二聚体形成、阻碍STAT3核内转移、干扰STAT3对靶基因启动子结合均能有效抑制STAT3的转录活性[23]。JAK3抑制剂托法替布(Tofacitinib)为STAT3信号通路的间接抑制剂[24],目前,托法替布已用于类风湿关节炎和炎症性肠病的治疗,并在2015年首次纳入美国风湿协会类风湿关节炎治疗指南[25]。推测以托法替布为代表的STAT3通路间接抑制剂可应用于BD治疗。本研究提示,STAT3通路激活介导BD患者TH1、TH17活化且与BD活动性相关,STAT3磷酸化有望成为BD治疗研究新靶点。

HC:Health control;BD -R:BD -remission;BD -A:BD -active.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

图3　TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白质和mRNA水平在3组的空白对照亚组和Stattic抑制剂亚组PBMC细胞内的表达 Fig 3　TNF-α,IFN-γ and IL-17 protein and mRNA relative expression levels in PBMC of the blank control subgroupand the Stattic subgroup from the three groups

参　考　文　献

[1]　HAMEDI M,BERGMEIER LA,HAGI-PAVLI E,et al.Differential expression of suppressor of cytokine signalling proteins in Behcet’s disease[J].Scand J Immunol,2014,80(5):369-376.

[2]　CANSU DÜ,KASIFOGLU T,KORKMAZ C.Do clinical findings of Bahcet’s disease vary by gender?A single-center experience from 329 patients[J].Eur J Rheumatol,2016,3(4):157-160.

[3]　BALTA I,AKBAY G,KALKAN G,et al.Demographic and clinical features of 521 Turkish patients with Bahcet’s disease[J].Int J Dermatol,2014,53(5):564-569.

[4]　HU K,HOU S,JIANG Z,et al.JAK2 and STAT3 polymorphisms in a Han Chinese population with Behcet’s disease[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(1):538-541.

[5]　MATHUR AN,CHANG HC,ZISOULIS DG,et al.Stat3 and Stat4 direct development of IL-17-secreting Th cells[J].J Immunol, 2007,178(8):4901-4907.

[6]　SHIM J,BYUN HO,LEE YD,et al.Interleukin-6 small interfering RNA improved the herpes simplex virus-induced systemic inflammation in vivo Behcet’s disease-like mouse model[J].Gene Ther,2009,16(3):415-425.

[7]　TULUNAY A,DOZMOROV MG,TURE-OZDEMIR F,et al.Activation of the JAK/STAT pathway in Behcet’s disease[J].Genes Immun,2015,16(2):170-175.

[8]　PINETON DE CHAMBRUN M,WECHSLER B,GERI G,et al.New insights into the pathogenesis of Behcet’s disease[J].Autoimmun Rev, 2012,11(10):687-698.

[9]　ZHOU ZY,CHEN SL,SHEN N,et al.Cytokines and Behcet’s disease[J].Autoimmun Rev,2012,11(10):699-704.

[10]　HAMZAOUI K,BOUALI E,GHORBEL I,et al.Expression of Th-17 and RORγt mRNA in Behcet’s disease[J].Med Sci Monit,2011,17(4):CR227-CR234.

[11]　O′SHEA JJ,HOLLAND SM,STAUDT LM.JAKs and STATs inimmunity,immunodeficiency,and cancer[J].N Engl J Med,2013,368(2):161-170.

[12]　SCUTO A,KUJAWSKI M,KOWOLIK C,et al.STAT3 inhibition is a therapeutic strategy for ABC-like diffuse large B-cell lymphoma[J]. Cancer Res, 2011,71(9):3182-3188.

[13]　FUKUDA S,ABEMATSU M,MORI H,et al.Potentiation of astrogliogenesis by STAT3-mediated activation of bone morphogenetic protein-Smad signaling in neural stem cells[J].Mol Cell Biol,2007,27(13):4931-4937.

[14]　IHLE JN.Cytokine receptor signalling[J].Nature,1995,377(6550):591-594.

[15]　UEHARA Y,MOCHIZUKI M,MATSUNO K,et al.Novel high-throughput screening system for identifying STAT3-SH2 antagonists[J].Biochem Biophys Res Commun, 2009,380(3):627-631.

[16]　SCHUST J,SPERL B,HOLLIS A,et al.Stattic:a small-molecule inhibitor of STAT3 activation and dimerization[J].Chem Biol,2006,13(11):1235-1242.

[17]　WANG C,YE Z,KIJLSTRA A,et al.Decreased expression of the aryl hydrocarbon receptor in ocular Behcet’s disease[J].Mediators Inflamm, 2014,2014:195094.

[18]　WU L,WEN H,ZHOU Y,et al.Activation of the liver X receptor inhibits Th17 and Th1 responses in Behcet’s disease and Vogt-Koyanagi-Harada disease[J].Curr Mol Med,2014,14(6):712-722.

[19]　SHIMIZU J,TAKAI K,FUJIWARA N,et al.Excessive CD4+ T cells co-expressing interleukin-17 and interferon-γ in patients with Behcet’s disease[J].Clin Exp Immunol,2012,168(1):68-74.

[20]　YE Z,WANG C,KIJLSTRA A,et al.A possible role for interleukin 37 in the pathogenesis of Behcet’s disease[J].Curr Mol Med,2014,14(4):535-542.

[21]　JIANG Z,HENNEIN L,TAO Y,et al.Interleukin-23 receptor gene polymorphism may enhance expression of the IL-23 receptor,IL-17,TNF-α and IL-6 in Behcet’s disease[J].PLoS One,2015,10(7):e0134632.

[22]　DEUTER CM,KÖTTER I,WALLACE GR,et al.Behcet’s disease:ocular effects and treatment[J].Prog Retin Eye Res,2008,27(1):111-136.

[23]　FURTEK SL,BACKOS DS,MATHESON CJ,et al.Strategies and approaches of targeting STAT3 for cancer treatment[J].ACS Cheml Biol,2016,11(2):308-318.

[24]　SMOLEN JS,ALETAHA D,GRUBEN D,et al.Brief report:remission rates with tofacitinib treatment in rheumatoid arthritis:a comparison of various remission criteria[J].Arthritis Rheumatol,2017,69(4):728-734.

[25]　SINGH JA,SAAG KG,BRIDGES SL,et al.2015 American college of rheumatology guideline for the treatment of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheumatol,2016,68(1):1-26.

(2) 简单灯光引导标志的增加，可显著提升疏散效率。标准站台模拟仿真结果显示，疏散通道增加1个引导标志，人员疏散效率提升4.2%；增加2个引导标志，人员疏散效率提升15%；增加3个引导标志，人员疏散效率提升36%；增加4个标志，人员疏散效率提升47%。具体关系如图3所示。