目前肺癌的发病率及死亡率居所有恶性肿瘤之首。而且近些年来肺癌,尤其是晚期肺癌治疗后的5年生存率提高并不大,分子靶向药物在肺癌治疗中的地位逐年提高,因此,新的分子靶向基因及药物的研究十分必要。FHL1(four and a half LIM domain protein 1)是近年来研究发现的一种肿瘤抑制因子,表达于人体的多种正常细胞以及肿瘤细胞中[1]。FHL1在多种实体肿瘤细胞中呈低表达,而且其表达水平与肿瘤的进展呈负相关[2]。我们通过在体外细胞实验中改变FHL1在肺腺癌细胞株中的表达,研究其对肺腺癌细胞株生物学特性的影响,为进一步的实验研究提供基础,以期将来能为肺腺癌的诊断治疗提供新的思路。

材 料 和 方 法

材料和试剂　本实验所用肺腺癌细胞株A549、人源FHL1-mRNA慢病毒及人源FHL1 shRNA慢病毒套装购自上海匠莱生物科技有限公司;FHL1抗体购自美国Abcam公司(批号ab58067);CCK8试剂盒、Takara逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mixes 试剂盒、Transwell小室等实验试剂器材均购自上海丰能医药科技有限公司。

实验方法

FHL1在非小细胞肺癌中的本底表达　选取A549细胞进行实验,检测FHL1基因在mRNA水平上的表达情况,即本底表达水平。接种细胞,取对数期A549细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成单细胞悬液,计数,接种至6孔板中,于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中预培养24 h。

收集细胞,使用Trizol/三氯甲烷/异丙醇法提取细胞总RNA,定量,将RNA逆转录成cDNA,以U6 为内参,以cDNA 为模板进行RT-PCR扩增FHL1。由PCR 反应曲线得到的Ct 值计算,按公式2-△△Ct计算细胞株中FHL1 mRNA 相对表达量。

书次号是索书号的组成部分之一，是采用数字、字母等符号对同类图书进行区分，使图书排列有序。20世纪50年代至今出现了三次研究热潮，主要研究采用著者号还是种次号，以及书次号的标准化问题[1]。书次号有三种：著者号、种次号和出版年月号。目前，我国80%的图书馆使用种次号，10%的大馆使用著者号，还有10%的小馆使用其他方法[2]。现在书次号的统一和标准化问题仍未妥善解决,仍然是图书馆界的研究热点之一。

FHL1稳转过表达和低表达细胞株构建及鉴定针对之前的结果,我们设计过表达和低表达实验,合成FHL1 mRNA慢病毒过表达载体和FHL1 shRNA慢病毒低表达载体,分别以空载体和shRNA-NC为空白对照,侵染A549细胞,侵染方法按照说明书进行,侵染4～6 h后更换新鲜培养液。72 h后于荧光显微镜下观察并拍摄荧光图片,然后收集细胞,通过RT-PCR及Western blot检测FHL1基因的过表达情况和不同低表达片段的低表达效率,刷选出FHL1-shRNA稳转表达细胞株备用。

Transwell实验检测FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞迁移的影响　所有细胞培养试剂和Transwell小室放在37 ℃温育;待稳转过表达载体和低表达慢病毒载体的A549细胞培养至对数生长期,常规消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤1次,用无血清培养基重悬细胞,计数,调整浓度为2×105/mL,以稳转空载体的A549细胞为对照;在下室(即24孔板底部)加入600～800 μL 含10%胎牛血清的培养基,上室加入100～150 μL 上述4种细胞悬液,继续在温箱培养24 h;取出小室,吸干上室液体,移到预先加入约800 μL甲醇的孔中,室温固定30 min;取出小室,吸干上室固定液,移到预先加入约800 μL 0.1%结晶紫染液的孔中,室温染色15～30 min;用清水冲洗浸泡数次,取出小室,吸去上室液体,用湿棉棒擦去上室底部膜表面上未迁移的细胞;用小镊子揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;于400倍显微镜下取5个随机视野计数,统计结果。

Western blot方法　细胞裂解匀浆液在4 ℃离心(13 000×g,15 min)。离心后吸取上清液转移至另一个EP管中,BAC法测蛋白浓度。向EP管中按4∶1的比例加变性蛋白上样缓冲液,95 ℃水浴箱内变性5 min。变性后的样品在4 ℃保存备用或立即进入下一步实验。SDS-PAGE法电泳。将漂洗后的膜置于含5%BSA的封闭液中,室温下摇床轻摇1～2 h。然后TBST液中轻摇洗4次,每次10 min。一抗孵育:将膜按照marker指示带位置裁剪目标条带和内参相应条带,分别置于稀释好的一抗中,FHL-1抗体稀释浓度为1∶1 000;β-actin抗体(CST,4967)稀释浓度1∶4 000。4 ℃孵育过夜。TBST液轻摇洗4次,每次10 min。将膜放于二抗中(IRDye羊抗鼠或羊抗兔抗体,1∶10 000),室温下摇床轻摇1 h。TBST液轻摇4次,每次10 min。将膜用LI-COR Odyssey系统扫描获取图像,用Image J软件分析目标带的净光密度值,内参为β-actin。

我院围手术期质子泵抑制剂使用情况调查及合理性评价…………………………………………………… 马志会等（12）：1715

设置时间梯度,分别于固定的培养时间点6、12、24、48、72、96 h 向每孔中加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃细胞培养箱中共孵育1～4 h后终止培养,然后测定各孔450 nm下的吸光度(D450)值。采集数据后,绘制A549细胞的增殖曲线。

流式实验检测FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞凋亡和周期的影响　常规消化稳转低表达载体和过表达慢病毒载体的A549细胞,制备悬液,以稳转shRNA-NC和空载体的A549细胞为对照,计数,接种等量细胞至6孔板中,培养48 h,弃培液,用不含EDTA的胰蛋白酶消化贴壁的4组细胞。弃胰蛋白酶,加入2 mL细胞培养液,混匀,转移到离心管内,300×g离心5 min,弃上清,收集细胞,用预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均在300×g、4 ℃离心5 min。收集1～5×105细胞。 加入100 μL 1×缓冲液重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液,轻轻混匀。避光室温静置孵育10 min。

加入400 μL 1×缓冲液,混匀,随即样品在1 h内用流式细胞仪检测,分析低表达对细胞的影响。

CCK-8实验检测FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞增殖的影响　接种稳转FHL1低表达和过表达慢病毒载体的A549细胞,分别以稳转shRNA-NC和空载体的A549细胞为对照,将细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成单细胞悬液,以每孔5 000～8 000细胞量接种到96孔板中,每个时间点设6个平行复孔,每孔100 μL,于细胞培养箱(37 ℃,5%CO2)中预培养。

随着我国社会经济的快速发展，我国的城市化进程得到了快速的推进，城市人口随之快速增加，为了给市民提供良好的居住环境，市政府也在不断加大对基础设施建设的投资[1]。市政道路属于城市交通建设的重要构成，对于城市发展和交流有着重要意义。城市道路由于巨大的车流量长期碾压，如果质量不达标就容易造成路面塌陷等问题，使得道路使用寿命缩短。我国有不少城市道路属于软土地基，如果没有进行软基加固，就容易造成道路在使用过程中出现形变、沉降等问题，危及来往车辆安全[2]。对此，在市政道路施工中就需要采取软基加固来提高市政道路施工质量。

（3）科学资金的出资方将预付一笔论文处理费给期刊社，确保论文永久开放，而不只是混合开放获取模式中的开放选择；作者不仅不需要付费，而且还拥有著作权益。

A:FHL1 mRNA expression in groups of shRNA;B:FHL1 mRNA expression in groups of overexpression.(1)P<0.001.

统计学方法　运用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。实验结果中,两组比较采用t检验方法,多组比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

结　　　果

RT-PCR检测结果(图2)　我们利用RT-PCR技术验证病毒转染的效率,FHL1 shRNA-1、2低表达组FHL1 mRNA表达水平分别为0.015±0.002、0.017±0.003,FHL1 shRNA空白组表达为0.999±0.083,差异具有统计学意义(P<0.000 1),说明两个干扰病毒转染后均可以明显降低FHL1 mRNA水平,干扰病毒作用可靠。FHL1过表达组FHL1 mRNA表达水平为5.330±0.578，明显高于FHL1空白组(0.545±0.016,P<0.000 1),说明过表达组可以提高FHL1 mRNA水平,病毒效果可靠。

我们一齐生在扒锅街，眼睛还没睁开时就认识了，我妈说头一次见面，他就尿了我一身，后来我总算明白了，我为什么一直不爽他。可是扒锅街的小孩子越来越少，我只好拉上许飞充数，但是每次我们玩过家家游戏，我从来不和许飞扮夫妻。

FHL1的过表达及低表达的验证

慢病毒载体转染后的细胞株　首先，我们利用免疫荧光技术观察了各组转染后细胞的形态，FHL1 shRNA低表达组(图1A)相对FHL1 shRNA空白组(图1B)细胞数量较多，提示干扰FHL1蛋白表达后可能减少细胞凋亡，进而细胞存活增加。而FHL1过表达组(图1D)相比FHL1本底表达(空白组)组(图1C)细胞数量减少，提示过表达FHL1蛋白后可能通过促进细胞凋亡,进而导致细胞数量减少。

Transwell实验检测结果　为了验证FHL1干扰或过表达后对A549细胞侵袭能力是否有作用，我们通过 Transwell实验观察干扰和过表达FHL1蛋白后对A549细胞侵袭能力的影响(图6A～E)。结果显示，FHL1过表达组平均细胞数为58.6±6.4，空白组为122.4±12.8 (P<0.001,图6G)。而低表达组FHL1 shRNA-1、FHL1 shRNA-2分别为215.6±21.3、200.2±23.7,明显高于空白组，差异具有统计学意义(P=0.004 8,图 6F)。

A:Imaging of A549 cell in shRNA-NC group;B:Imaging of A549 cell in FHL1-shRNA group;C:Imaging of A549 cell in empty vector group;D:Imaging of A549 cell in FHL1 mRNA group.

图1　慢病毒转染后的细胞形态 Fig 1　Cellular morphology after the transfection of lentivirus vector

细胞集落形成实验检测FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞克隆形成的影响　分别取稳转FHL1过表达和低表达慢病毒载体及空载对照的A549细胞,用胰蛋白酶常规消化,吹打成单细胞悬液,调整细胞悬液密度为1×103个/mL,计数后接种于6孔培养板中,每孔接种1 mL细胞悬液,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养2周,每48 h更换新鲜培养基,至细胞形成典型集落(多数集落细胞数在50个以上),然后弃去培养基,分别经甲醇固定10 min和0.1%结晶紫染色15 min后,计数集落数,拍照并保存图像。

图2　FHL1 mRNA表达水平的RT-PCR检测结果 Fig 2　RT-PCR test result of FHL1 mRNA expression

A:FHL1 protein levels in groups of shRNA;B:FHL1 protein levels in groups of overexpression.

图3　FHL1 表达水平的Western blot检测结果 Fig 3　Western blot test result of FHL1 expression

CCK-8实验检测FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞增殖的影响 　我们利用CCK-8实验观察了干扰或过表达FHL1后是否会影响A549细胞的增殖。结果显示,FHL1 shRNA-1、2低表达组96 h后的平均D值分别为0.291±0.007和0.272±0.005,增殖率分别为103.4%和98.1%,空白组96 h后的平均D值为0.218±0.004,增殖率为65.2%,差异具有统计学意义(图4A)。该结果表明,干扰FHL1后细胞的增殖较空白组增多。与之相反,FHL1过表达96 h后的平均D值为0.194±0.003,增殖率为43.2%,过表达组细胞的增殖明显低于空白组,差异具有统计学意义(P=0.002 2,图4B)。

细胞流式术检测FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞凋亡的影响　为了验证FHL1影响A549细胞的增殖是否通过影响细胞凋亡而实现的,我们利用流式细胞术观察了FHL1在过表达和低表达情况下A549细胞的凋亡情况(图5A～F)。结果显示,FHL1 shRNA-1、2组的总体凋亡率分别为16.41%和20.12%,低于空白组的26.38% (P=0.004 5、0.032 3)。FHL1过表达组的总体凋亡率为50.48%,高于空白组的25.90% (P=0.003 6),且明显高于低表达组,差异具有统计学意义(P<0.001,图5G)。

A:Growth rate of A549 cell in FHL1 low expression groups;B:Growth rate of A549 cell in FHL1 overexpression groups.

图4　FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞增殖的影响 Fig 4　The effects of FHL1 overexpression and low expression on A549 cell growth

A-F:Representative graph of apoptosis in different groups;G:Statistics graph of apoptosis in different groups.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

图5　过表达和低表达FHL1下对A549细胞凋亡的影响 Fig 5　The effects of FHL1 overexpression and low expression on A549 cell apoptosis

Western blot检测结果(图3)　利用Western blot技术在蛋白表达水平上检测了干扰组和过表达组的FHL1蛋白表达，FHL1 shRNA-1、2低表达组相对FHL1 shRNA空白组FHL1蛋白表达显著减少(图3A)。FHL1过表达组相比FHL1本底表达(空白组)组FHL1蛋白表达明显增加(图3B)。进一步从蛋白表达水平上验证了干扰与过表达病毒的效率。

A-E:Low expression of FHL1 on A549 cell proliferation;F-G:Overexpression of FHL1 on A549 cell proliferation.(1)P<0.01,(2)P<0.001.

图6　FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞迁移的影响 Fig 6　The effects of FHL1 overexpression and low expression on A549 cell proliferation

成集落实验结果　每孔接种细胞数103个,将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,在显微镜(低倍镜)下计数各组大于50个细胞的集落数。FHL1低表达组shRNA-1、shRNA-2的平均集落数分别为157.0±6.4、150.7±9.5,空白组为82.0±7.0,而过表达组的集落数为28.7±6.0,明显少于空病毒对照组及FHL1低表达组，差异具有统计学意义(P<0.000 1,图7)。

在美国和日本披露环境会计信息的过程中，国家环保部门充分发挥了政府职能部门的作用。我们国家必须加强环境执法。主要有两种手段：一是以立法形式使用法律手段，对企业污染物的处理和排放实行强制性管制，并处以同等的行政处罚和刑事处罚；其次，它使用经济手段来使用补贴和补贴。税收，费用和排放交易系统形成对企业污染物处置的间接控制。通过加强环境执法和处罚，企业不得不承认环境问题给企业带来的风险，让更多的企业关注环保，接受绿色管理的理念，引导企业自觉履行环境保护和责任环境会计信息披露。

N2关于变量 Lipschitz连续，常数为 ω；B (u)是Lipschitz连续，常数为 λB，则

A-E:Low expression of FHL1 on A549 cell colony formation;F-G:Overexpression of FHL1 on A549 colony formation.(1)P<0.001.

图7　FHL1在过表达和低表达情况下对A549细胞克隆形成的影响 Fig 7　The effects of FHL1 overexpression and low expression on A549 cell colony formation

讨　　　论

肺癌发生于支气管黏膜上皮,根据显微镜下细胞的大小,肺癌可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)两大类,其中,后者约占80%～85%,而NSCLC根据细胞类型又分为腺癌、鳞状细胞癌及大细胞癌等,近年来的流行病学统计显示,腺癌的发病率明显增高,在NSCLC中占比超过50%。手术、化疗、放疗一直以来被作为NSCLC的主要治疗手段,但是目前对于进展期NSCLC的治疗效果仍然较差,5年生存率仅为16%～20%。而分子靶向药物的出现,给NSCLC的治疗指引了新的方向。近年来,NSCLC分子生物学研究成为热点,新的肿瘤标志物、治疗靶点及有效的肿瘤抑制因子可以为NSCLC的诊断和治疗提供更多的手段。

FHL1是FHL家族的一员,在该家族中表达最为广泛,该家族是一类含有4个半LIM结构域的蛋白家族[1]。研究发现,其成员包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5/ACT,它们表达分布于不同组织中[2]。它们通过活性结构域LIM,与某些结构蛋白、转录调控因子、激酶等多种物质产生相互作用,从而对一些基因的表达、细胞的分化发育进行调控[3-4]。FHL1在心、肾、卵巢、肌肉、肺和脑等多种人体正常组织细胞中均有表达[5-6]。研究还发现,FHL1基因缺失可以恢复细胞多态性[7-8],FHL1 在多种人体肿瘤细胞中表达是下降的,可被认为是一种新的肿瘤标志物[9-12]。

本研究通过慢病毒载体转染肺腺癌细胞株A549,改变肿瘤细胞内FHL1的表达,构建了FHL1高表达和低表达细胞株模型,通过RT-PCR及Western blot检测均证实其表达差异明显。CCK-8实验检测提示FHL1低表达组的细胞增殖情况明显高于FHL1高表达组,表明FHL1的表达下调能加快肺腺癌细胞株A549的细胞增殖,而上调FHL1的表达将减缓细胞株的增殖。Niu等[13]的研究中发现FHL1能诱导肺癌细胞周期G1及G2/M停滞,同时下调细胞周期蛋白D1和B1,而上调周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制因子p21,从而对肿瘤细胞的增殖生长产生抑制作用。流式细胞术检测发现FHL1过表达组的细胞凋亡率明显高于低表达组及空白对照组,表明FHL1能够诱导加速肺腺癌细胞的凋亡。研究表明,FHL1以转录共调控因子的角色参与细胞增殖分化、转录调节、信号转导、凋亡等多种细胞活动[14-15]。在Transwell实验中,FHL1过表达组细胞表现出的侵袭性明显低于低表达组及空白组,表明FHL1对于肿瘤细胞的侵袭性也有影响。在吴成利等[9]、刘哲等[10]及Kashyap等[11]的研究中均发现FHL1的表达与肿瘤的侵袭性呈负相关。细胞集落形成实验中,FHL1过表达组细胞株在培养基上形成的集落数明显少于FHL1低表达组,说明FHL1对肺腺癌细胞株的锚定非依赖生长有抑制作用,而锚定非依赖生长是肿瘤发生局部或远处转移原因之一[16],因此,FHL1表达对于肺腺癌的转移亦有影响。细胞的黏着斑对肿瘤细胞的转移有着重要的影响[17],而Sakashita等[18]研究表明,FHL1在肿瘤中的生物学机制是形成黏着斑。

Niu等[13]的研究中,在体外细胞实验中发现了FHL1的表达对肺癌细胞的增殖及锚定非依赖性生长有抑制作用,也进一步对其作用机制进行了研究。而本研究的结论与其研究一致,重复验证了这一现象,但重点主要集中在干扰或过表达FHL1后A549细胞一系列细胞生物学特性的改变,以期更全面地了解FHL1作为肺腺癌肿瘤抑制因子在肿瘤的发生、发展中所起的作用,为深入了解FHL1基因调控A549细胞提供基本的实验数据。

综上所述,慢病毒载体转染肺腺癌细胞株A549能成功构建FHL1过表达及低表达细胞株模型。FHL1对于肺腺癌细胞株A549的增殖、侵袭及转移均有抑制作用,并且能诱导加速肿瘤细胞凋亡,因此,FHL1作为一种新型的肺腺癌肿瘤抑制因子值得关注。虽然已有动物实验[13]证实FHL1可抑制裸鼠体内肺癌的生长,但目前FHL1能否作为靶向基因用于人体肺腺癌的治疗,尚有待进一步研究。

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肛周脓肿病因为肠道内细菌感染,“肠道菌”是源头,是致病的要素。“肛窦”是感染的入口,也是脓肿和成瘘后的内口。“肛腺”是感染的途径,它先发生感染,然后蔓延[2-4]。而肛周脓肿是病变最终的表现形式,一般来说,脓腔越大越深,发热的概率就大,严重影响患者的正常生活。