糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，而大 血管并发症是其致死、致残最主要的原因［1］。高血糖引起血管内皮细胞（VECs）功能失调是血管病的始动因子［2-4］。探讨高血糖引起VEC损伤的病理生理机制对防治糖尿病血管病的发生极其重要。糖原合酶激酶-3（GSK-3）［5］及内质网应激（ERS）在糖尿病心血管并发症中的作用日益受到重视［6］。

GSK-3是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，被认为是多种细胞事件和信号通路的调节者，包括GSK-3α和GSK-3β两个成员。与大部分的蛋白激酶不同，GSK-3在磷酸化状态时是不活动的。GSK-3α结构中的Ser21或GSK-3β中的Ser9去磷酸化导致它们被激活并对各种刺激产生反应［7-8］。糖尿病肾病大鼠肾组织的GSK-3β活性增强，GSK-3β抑制剂可抑制GSK-3β活性，减轻肾组织的病理改变及尿蛋白量［9］。高糖引起H9C2细胞凋亡及GSK-3β活性增强，小干扰RNA沉默GSK-3β后能保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤［5］。在糖尿病大鼠，GSK-3β抑制剂通过调控Nrf2/TrxR2信号通路保护肾脏对抗缺血再灌注引起的损伤［10］。有关GSK-3β在高糖损伤血管内皮细胞的作用及其机制尚未见相关研究。

内质网应激（ERS）是指某些因素使ER生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理状态。高浓度的葡萄糖能激活内皮细胞，但长期高血糖则导致持续的ERS［11］。适当程度的ERS对维持细胞的稳定是有利的，而长期的ERS则能引起细胞凋亡及发生许多疾病［12］。ERS在T2DM的VECs损伤中起着重要的作用［13-15］。高糖能引起人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡、ERS及内皮素-1生成增多；Mir-149-5P能通过抑制ERS（降低GRP78、CHOP表达）及增加抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达等机制保护HUVECs对抗高糖引起的损伤［6］。在胰岛瘤细胞模型，ERS引起的凋亡与增加GSK-3β活性有关［16］。在脂多糖（LPS）诱发的肝损伤中，GSK-3β与促进ERS引起的凋亡有关［17］。因此，我们推测在高糖引起的VECs损伤中，可能存在GSK-3β与ERS相互作用，而且这种相互作用可能是高糖损伤VECs的一个重要的病理生理机制。

非甾体类药物对内脏痛效果更佳[23]，可以减少30%～50%阿片类药物量，降低阿片相关的副作用(包括恶心、瘙痒、镇静)[24]。有专家建议对于凝血功能正常的产妇应常规给予非甾体类药物。但是目前为止很少有研究比较不同非甾体类药物的镇痛效果，具体药物种类的选择、使用情况，是根据不同医院用药习惯。但注意对于合并子痫的产妇，应避免使用非甾体类药物，非甾体类药物可增加出血风险，导致肾功能损害[25]。高选择性环氧合酶-2抑制剂，例如塞来昔布，可降低非选择性非甾体类药物对胃肠道以及凝血功能的不良影响，减少阿片类药物的使用，且大大减少了恶心呕吐、便秘等不良反应的发生。

本研究拟建立高糖处理的HUVECs损伤模型，探讨GSK-3β与ERS是否存在相互作用；GSK-3β和ERS在高糖损伤血管内皮细胞中的多种作用，为深入阐明高糖对血管内皮细胞的损伤机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

HUVECs在24孔板中生长至约80%的融合度时，按照分组给予不同处理后，加入Rh 123染液，37℃温箱中作用30 min，荧光显微镜下随机照片记录5个高倍镜视野，应用图像分析软件计算绿色荧光的MFI（数值大小可反映MMP的高低），并对每组数据进行统计分析。实验重复5次。

1.2 细胞培养及实验分组

在含5%CO2的37℃恒温培养箱中、采用含10%FBS的DMEM培养HUVECs，当细胞生长至约80%的融合状态时可进行实验。实验分为6组：（1）Con组：DMEM培养基作用HUVECs 24 h；（2）高糖（HG）组：40 mmol/L葡萄糖作用HUVECs 24 h；（3）LiCl+HG组：10 mmol/L LiCl预处理HUVECs 60 min，再予40mmol/L葡萄糖作用24h；（4）4-PBA+HG组：20μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，再予40 mmol/L葡萄糖作用24 h；（5）LiCl组：10 mmol/LLiCl预处理HUVECs 60 min，再予DMEM作用24 h；（6）4-PBA组：20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60min，再予DMEM作用24h。

HUVECs在24孔板中生长至约80%的融合度时，按照分组给予不同处理后，4%的多聚甲醛固定10 min，加入用Hoechst 33258染料稀释液，37℃温箱中作用30 min，荧光显微镜下可观察到：正常的细胞呈弥散均匀的低密度荧光，凋亡细胞则表现为细胞核呈现浓缩致密的固缩形态或颗粒荧光，随机照片记录5个高倍镜视野（放大200倍，以下同）。应用Image J 1.47i软件计算平均荧光强度（MFI），对每组数据进行统计分析。实验重复5次。

1.3 GSK-3β、GRP78、CHOP和cleaved caspase-3蛋白水平测定

利用SPSS 19.0软件进行数据分析，结果以均数±标准差表示，单因素方差分析用于多个样本均数间的比较，结果有统计学意义再采用SNK-q检验进行均数间的两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.4 细胞存活率测定

在96孔板中培养HUVECs，当细胞生长至约80%的融合度时，按各分组处理后，吸去细胞培养液，PBS液冲洗3次，加入CCK-8溶液10 μL/孔，37 ℃恒温培养箱内孵育2.5 h，酶标仪上读取A450 nm；细胞存活率按照以下公式计算：细胞存活率（%）=处理组A/对照组A×100%。实验重复5次。

1.5 细胞凋亡检测

以2007年通州区公路网里程为基准，分别采用指数平滑模型以及非指数平滑模型进行预测得到2020年公路网规模分别应到2 541 km和2 564 km.

1.6 细胞内ROS水平测定

HG作用HUVECs 24 h可激活GSK-3β，p-GSK-3β表达水平明显降低，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，图4A、B）。在HG产生作用前，应用20 μmol/L 4-PBA（ERS抑制剂）预处理HUVECs 60 min，p-GSK-3β表达水平升高，与单独HG组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。单独20 μmol/L 4-PBA处理HUVECs 60min，p-GSK-3β表达水平的影响不显著。

1.7 线粒体膜电位（MMP）水平测定

抗 GSK-3β、抗磷酸化（p）-GSK-3β（Ser9）、抗GRP78、抗CHOP和抗cleaved caspase-3抗体购自Cell Signaling；双氯荧光素（DCFH-DA）、罗丹明123（Rh 123）、Hoechst 33258染料、氯化锂（LiCl，GSK-3β的抑制剂）、4-苯基丁酸（4-PBA，ERS的抑制剂）购自Sigma-Aldrich；特级胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL；细胞计数试剂盒 8（CCK-8）由 Dojindo Lab（Japan）提供；DMEM培养基由Hyclone供应。HUVECs由中山大学实验动物中心细胞库供应。

肿瘤转移或复发之前，往往经历较长时间的休眠期，这个阶段的转移灶被称为沉睡的转移灶（肿瘤细胞休眠）。当适宜的转移前微环境形成，循环肿瘤细胞会从休眠状态释放并扩散，从而导致肿瘤转移。将治未病理论合理应用到肿瘤3级预防中，在恶性肿瘤防治策略中运用中医治未病理念和措施，具有重要的现实意义。

1.8 统计学处理

HUVECs在60 mm培养皿中生长至约80%融合度时，给予不同的处理后加入细胞裂解液作用30 min后，高速离心10 min后取上清液进行蛋白定量（BCA法）。等量蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳分离后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉常温孵育1 h后加入Ⅰ抗稀释液[包括抗GSK-3β、抗p-GSK-3β（Ser9）、抗 cleaved caspase-3、抗 GRP78、抗CHOP和GAPDH，浓度均为1∶1000]，4℃作用过夜后加入Ⅱ抗稀释液（浓度为1∶3000）孵育1.5 h。ECL法使PVDF膜显色，暗室中曝光到X线片上，凝胶成像扫描系统分析结果。实验重复5次。

(2)在是否成立创业学院(或创新创业中心)方面，省属公办本科高校和省属民办本科高校以及省属公办高职高专学校做的较好，而省属独立学院和省属民办高等职业学校做的不好，反映了这些学校对这方面不太重视。

  

图1 高糖对HUVECs的GSK-3β的激活作用Fig.1 Effect of high glucose(HG,40 mmol/L)exposure for 24 h on activation of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).A:Expression levels of p-GSK-3β and GSK-3βsemi-quantified by Western blot analysis;B,C:Densitometric analysis of p-GSK-3β and GSK-3β expression levels.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group(n=5).

2 结果

2.1 高糖激活人脐静脉内皮细胞GSK-3β

HG作用HUVECs 1 h可明显地增加GRP78的表达水平，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2A、B）。随着作用时间的延长（3、6、9 、12、24 h），HG对GRP78表达水平的促进作用呈显著的时间-剂量依赖关系，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；HG作用HUVECs 3 h开始引起CHOP蛋白表达显著增多，随着作用时间的延长，这种作用呈显著的时间-剂量依赖关系（P＜0.01，图2A、C）。

2.2 高糖诱发人脐静脉内皮细胞ERS

40 mmol/L葡萄糖（HG）作用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）1～24 h对磷酸化（p）-GSK-3β的影响（图1A、B）。当HG作用HUVECs 3 h可使p-GSK-3β的表达水平明显下降（反映GSK-3β被激活），与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；随着作用时间的延长（6、9、12、24 h），呈显著的时间-剂量依赖关系，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。在上述作用时间段，HG对HUVECs的GSK-3β表达水平无明显的影响。

2.3 活化的GSK-3β参与高糖引起的人脐静脉内皮细胞的ERS

当HG作用HUVECs 24 h可明显地诱发ERS，GRP78和CHOP的表达水平明显升高（P＜0.01）。在HG产生作用前，应用10 mmol/L LiCl（GSK-3β抑制剂）预处理HUVECs 60 min，HG对GRP78和CHOP表达的促进作用明显减弱，与HG组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，图3）。单独应用10mmol/LLiCl处理HUVECs 60min，HG对GRP78和CHOP表达水平影响不明显。

2.4 ERS参与高糖对人脐静脉内皮细胞GSK-3β的激活作用

HUVECs在24孔板中生长至融合度约80%时，经不同处理后，加入DCFH-DA染液后于37℃温箱中作用30 min，荧光显微镜（TE-2000 Nikon）下随机照片记录5个高倍镜视野，应用Image J 1.47i计算出绿色荧光的MFI（数值大小能间接反映ROS水平的高低），并对每组数据进行统计分析。实验重复5次。

2.5 GSK-3β和ERS介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞存活率降低

HG处理HUVECs 24 h可引起明显的细胞毒性作用，细胞存活率明显降低，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，图5）。在HG处理前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L4-PBA预处理HUVECs 60 min，可分别对抗HG引起的细胞毒性，使细胞存活率升高，与单独HG组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。单独用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA处理HUVECs 60min，对细胞存活率影响不明显。

  

图2 高糖引起HUVECs的ERSFig.2HG(40 mmol/L)exposure for 24 h induces endoplasmic reticulum stress(ERS)in HUVECs.A:Expression levels of GRP78 and CHOP semi-quantified by Western blot analysis;B,C:Densitometric analysis of GRP78 and CHOP expression levels.*P＜0.05,**P＜0.01vscontrolgroup(n=5).

  

图3 活化的GSK-3β介导HG引起的HUVECsERSFig.3 Activated GSK-3β mediates HG-induced ERS in HUVECs.HUVECs were pre-treated with 10 mmol/L LiCl for 60 min before exposure to 40 mmol/L glucose(HG)for 24 h.A:Expression levels of GRP78 and CHOP semi-quantified by Western blot analysis;B,C:Densitometric analysis of GRP78 and CHOP expression levels.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG-treatedcels(n=5).HG:Highglucose.

2.6 GSK-3β和ERS介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞凋亡

HG作用HUVECs 24 h可引起凋亡细胞数量显著增加，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，图6A、B）。在HG作用前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，均能明显地减小凋亡细胞数量，与单独HG组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。用10 mmol/LLiCl或20 μmol/L4-PBA处理HUVECs 60 min，对凋亡细胞数量无明显的影响。HG处理HUVECs 24 h引起cleaved caspase-3[为凋亡效应器）表达水平明显升高，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，图6C～F）]。在HG处理前，应用10mmol/L LiCl或20 μmmol/L 4-PBA预处理60 min，均能明显地减少cleaved caspase-3的表达水平，与HG处理组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。用10 m mmol/L LiCl或 20 μmmol/L 4-PBA 处理 HUVECs 60 min，对cleavedcaspase-3的表达水平无明显的影响。

2.7 GSK-3β和ERS介导高糖引起的HUVECs的氧化应激

应用DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧（ROS）水平。HG处理HUVECs 24 h，胞内DCFH-DA的MFI明显升高，与Con组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，图7A、B）。在HG处理前，应用10 mmol/LLiCl或20 μmol/L4-PBA预处理HUVECs 60 min，均能降低胞内DCFH-DA的MFI，与HG组分别比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA处理HUVECs 60 min，对胞内ROS水平表达无明显影响。

2.8 GSK-3β和ERS介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞线粒体膜电位丢失

HG处理HUVECs 24 h引起线粒体损伤，线粒体膜电位（MMP）丢失，即Rh123荧光染料的MFI降低，与Con组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01，图8A、B）。在HG产生作用前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，均能拮抗HG引起的MMP丢失，与HG处理组分别比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。单独应用10mmol/LLiCl或20μmol/L4-PBA处理HUVECs 60min，对MMP水平表达无明显影响。

巷道周边围岩开挖后损伤不同，其蠕变特性也有较大差异，为此进行了不同峰后位置(即图2中B点位置)的蠕变试验。由于对岩样施加轴压至峰后不同的B点位置对应的荷载不同，当B点越接近峰值，对应荷载越接近峰值，则损伤越小；当B点越远离峰值，对应荷载越远离峰值，则损伤越大。取对应荷载占峰值荷载的百分比为荷载比，则荷载比越大即越接近峰值，损伤越小；荷载比越小即越远离峰值，损伤越大。在此基础上，进行不同荷载比下峰后蠕变试验，试验参数及结果整理在表1中，不同荷载比下峰后蠕变曲线如图3所示。

  

图4 ERS参与高糖对HUVECsGSK-3β的激活作用Fig.4 ERS is involved in HG-induced GSK-3β activation in HUVECs.HUVECs were pre-treated with 20 μmol/L 4-PBAfor 60 min before exposure to 40 mmol/L glucose(HG)for 24 h.A:Expression levels of p-GSK-3β and GSK-3βsemi-quantified by Western blot analysis.B,C:Densitometricanalysis of p-GSK-3β and GSK-3β expression levels.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG-treatedgroup(n=5).HG:Highglucose.

  

图5 GSK-3β和ERS参与高糖引起的HUVECs存活率降低Fig.5 GSK-3β and ERS are implicated in HG-induced decrease in HUVEC viability.HUVECs were treated with 40 mmol/L glucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBA for 60 min.Cell viability was detected using the Cell counting Kit-8(CCK-8)assay.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG-treated group(n=5).HG:Highglucose.

3 讨论

高血糖是引起糖尿病心血管并发症的最重要因素［17-19］。高血糖可通过引起细胞凋亡、细胞毒性、炎症、氧化应激、损伤线粒体等作用引起血管内皮细胞功能障碍［20-22］。内皮素-1［6］、氧化应激［21］、瘦素/瘦素受体通路［21］、JAK/STAT通路［22］及沉默信息调节子1［23］等参与高糖对血管内皮细胞的损伤。GSK-3（特别是GSK-3β）［5］及ERS［6］在糖尿病心血管并发症中的作用受到学者们的关注。

  

图6 GSK-3β和ERS参与高糖引起的HUVECs凋亡Fig.6 GSK-3β and ERS participate in HG-induced apoptosis in HUVECs.HUVECs were treated with 40 mmol/L glucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/LLiCl or 20 μmol/L4-PBAfor 60 min.A:Detection of cell apoptosis using Hoechst 33258 nuclear staining followed by fluorescence imaging;B:Percentage of apoptotic cells in different groups analyzed using Image J 1.47i software;C,E:Expression levels of cleaved caspase-3 semi-quantified by Western blot analysis;D,F:Densitometric analysis of cleaved caspase-3 expression levels.**P＜0.01vsthe control group;##P＜0.01vsHG-treated group(n=5).HG:Highglucose.

GSK-3β是导致胰岛素缺失和胰岛素抵抗的一个重要因素［24］。高糖引起H9C2心肌细胞GSK-3β活性增强，抑制GSK-3β能减轻高糖引起心肌细胞凋亡［5］。在高糖处理的HUVECs模型，GSK-3β活性增强、细胞凋亡增多、线粒体膜通透性丢失及细胞色素C释放增多［25］。该研究没有应用GSK-3β抑制剂或小干扰RNA沉默GSK-3β等方法进一步证实GSK-3β在高糖损伤HUVECs中的作用［25］。本研究观察到高糖能引起HUVECs多种损伤，表现为细胞存活率降低、凋亡细胞数量增多、ROS生成增多及MMP丢失；另外，高糖能增加HUVECs GSK-3β活性，这与Liu等人的报道相一致［25］。本研究应用GSK-3β抑制剂后，高糖引起的上述内皮细胞损伤明显减轻，提示GSK-3β参与高糖引起的细胞毒性、细胞凋亡、氧化应激及线粒体损伤，进一步证实了GSK-3β在高糖损伤血管内皮细胞中的作用［25］。

  

图7 GSK-3β和ERS参与高糖引起的HUVECs的氧化应激Fig.7 GSK-3β and ERS are involved in HG-induced oxidative stress in HUVECs.HUVECs were treated with 40 mmol/Lglucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBA for 60 min.A:Intracellular ROS generation measured by 2'7-dichlorodihydr of luoresein diacetate(DCFHDA)staining followed by photofluorography;B:Quantitative analysis of the mean fluorescence intensity(MFI)using Image J1.47i software.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG-treated group(n=5).HG:Highglucose.

  

图8 GSK-3β和ERS参与高糖引起的人脐静脉内皮细胞MMP丢失Fig.8 GSK-3β and ERS contribute to HG-induced dissipation of mitochondrial membrane potential in HUVECs.HUVECs were treated with 40 mmol/L glucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBAfor 60 min.A:MMP detected using the fluorescent dye Rh123;B:Quantitative analysis of the mean fluorescence intensity(MFI)usingImageJ1.47isoftware.**P＜0.01vscontrolgroup;##P＜0.01vsHG-treatedgroup(n=5).HG:Highglucose.

抑制ERS能减轻2型糖尿病心肌梗塞［26］。高糖能引起HUVECs发生ERS和细胞凋亡［27］。本研究证实糖能在HUVECs诱发ERS，表现为GRP78和CHOP蛋白表达增多，这与高糖作为应激刺激激发ERS有关。4-PBA能保护血管内皮细胞对抗高糖引起的损伤，表现为细胞存活率升高，凋亡细胞数量、ROS生成及MMP丢失减少，提示ERS参与高糖引起的血管内皮细胞多种损伤［28-30］，这为把ERS作为一个靶点来防治高糖引起的血管并发症提供了实验依据。

2) 计算CEI。确定可能的化学品泄漏事故，确定ERPG-2，确定各种可能场景下的大气泄漏量(AQ)，选择AQ最大的场景，计算CEI，计算安全距离(HD)，汇总报告。

每一次大型豪华轿车的换代带来的不仅是技术上的升级和产品力的提升，更向我们展示了母品牌对于未来的前瞻。如果你想知道10年之后普通家用轿车会装备哪些配置，找一辆最新的大型豪华轿车看一下就好。可假如你找来一辆全新奥迪A8L，这个时间点可能要在往后推一推。

综上所述，在高糖处理的HUVECs，应用LiCl能抑制高糖引起的ERS，4-PBA能抑制高糖对GSK-3β的激活作用。这证明GSK-3β与ERS在高糖损伤HUVECs过程中，存在着相互作用，即激活的GSK-3β能加强ERS，ERS也能促进GSK-3β激活，这可能是高糖损伤血管内皮细胞的作用机制，为防治糖尿病血管并发症提供了一个新思路。

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