虾红素(astacene，3,3′-dihydroxy-2,3,2′，3′-tetradehydro-b,b′-carotene-b,b-dione)，又名喇蛄素，是一种海洋生物体内主要的类胡萝卜素，主要存在于虾、蟹、鲑鱼等水产动物以及藻类中，纯天然虾红素呈暗红色粉末状，易溶于二硫化碳、丙酮、氯仿等有机溶剂，难溶于水[1].虾红素与虾青素(astaxanthin，3,3′-dihydroxy-β,β-carotene-4,4′-dinoe) 具有很相似的分子结构(图1)，后者在常规环境下易氧化为虾红素[1-2].研究表明，虾红素具有较为广泛的生物学功能，其抗氧化能力比β-类胡萝卜素高10倍，比维生素E高550倍，素有“超级维生素E”的美称[3]；另外，虾红素还具有抗肿瘤、降血糖、缓解体力疲劳等多种生物活性[4-8].

图1 虾红素与虾青素的分子结构 Figure 1 The molecular structure of astacene and astaxanthin

龙虾是人们非常喜爱的水产品，然而在生产加工和食用过程中，丢弃的龙虾壳固体废弃物会造成环境污染和资源浪费[9].龙虾壳中含有甲壳素20%～30%，蛋白质等有机物20%～30%，钙等无机物30%～40%，色素4%～5%[10]，为了保护环境使龙虾壳变废为宝，很多学者就甲壳素、蛋白质、壳聚糖等的提取与利用方面进行了大量研究[11-13].近年来，随着虾红素在医药、养殖和食品加工行业中应用范围的增加[14-15]，很多学者就虾红素的提取分离方法进行了大量工作，如酶法[16]、低温稀碱[17]、乙醇回流盐酸浓缩[18]、乙醇辅助超声波[19]等.但是，酶解法需要加抗氧化剂，且水解后可能出现苦涩虾味；有机溶剂提取法效果虽好，但在提取过程中存在少量毒性、易燃、易爆等问题，这均会影响后期的经济效益[17].

亚临界流体萃取法(sub-critical fluid extraction，SFE)是以亚临界状态的流体或亚临界流体的混合溶液为溶媒，与溶质在系统内相继经过浸提、蒸发脱溶、压缩、冷凝回收等过程，从天然产物中提取目标组分的一种新技术[20].亚临界流体以低沸点的有机物，如丁烷、丙烷等有机物作为萃取剂逆向萃取，萃取液低温减压蒸发，分离得到萃取物，萃取剂气化循环使用，该法试验环境属低温低压，能够很好保持天然物与活性物质的生物活性[21].目前，利用亚临界流体技术萃取薄荷精油[20]、花椒籽油[22]、牡丹籽油[23]等均有研究，但采用亚临界技术萃取虾壳中虾红素的研究还未见报道.本试验以丁烷为萃取溶剂，对龙虾虾壳中虾红素进行亚临界萃取，并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)对提取液抗氧化能力和虾红素含量进行测定，确定最佳工艺条件，研究结果将为龙虾壳废弃物的开发利用提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验材料

从龙虾加工生产车间收集新鲜的虾头壳和前大腿，用流水冲洗干净后，置于恒温鼓风干燥箱中80℃条件下干燥，烘干后粉碎过筛，过40目筛备用.

最后，推广先进的栽培技术。针对长期水稻栽培过程中普遍存在无效分蘖量增多、水肥运用不合理、病虫害发病严重和普遍出现倒伏等问题，应该在示范创建过程中，积极推广使用高效的绿色安全生产技术，并进一步对技术路线进行优化，实现水稻生产的全机械化操作，推广应用配方施肥技术和病虫害统防统治技术。进一步加快绿色增产增效生产技术推广应用，不断提高示范区内的种植效益和示范效果。

1.2 试验方法

1.2.1 虾红素的萃取 利用CBE-5L亚临界流体萃取试验装置(河南省亚临界生物技术有限公司)对虾壳中虾红素进行萃取，操作步骤按照仪器使用说明，大致步骤为：1)称取1.5 kg粉碎后过40目筛的虾壳样品，装入萃取器，关闭进料器，抽真空；2)注入液化的丁烷，设置温度和压力，进行萃取；3)萃取完成后，抽取萃取器中的丁烷，打开萃取器排气阀；4)收集萃取液，4 ℃ 8 000 r/min下离心10 min，上清液用无水乙醇定容至25 mL，用于抗氧化能力和HPLC测定.

1.2.2 单因素试验 分别称取1.5 kg样品，对萃取时间、料液比、萃取温度、萃取压力进行单因素试验，利用体外抗氧化能力确定各因素的提取效果.

传统的教学方法，只是应付已知的、重复的情景，解决的是整体化一的问题。尤其是英语教学费时多，收效低，说不出，听不懂。这种过于集中的思维决不会产生创新观念。因此，我们要重视发散思维训练，对培养学生创新思维是“知识爆炸”时代的需要。教师应从听、说、读、写中训练学生的发散思维，训练学生具有流畅性、变通性和独特性的英语语感习惯。

式中，A为样品溶液的吸光值，A0不加样品溶液的吸光值.

表1 正交试验因素与水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

水平因素A:时间/mimB:料液比/(g·mL-1)C:温度/℃D:压力/MPa1401∶2.0400.52501∶2.5450.63601∶3.0500.7

抑制率(I%)=[(A0-A)/A0]×100%

1.2.4 抗氧化能力测定 采用DPPH法进行体外抗氧化能力的测定[24-25].具体步骤为：吸取1.2.1中萃取液20.0 μL，加到提前制备好的5.0 mL 10-4 mol/L DPPH 甲醇溶液中，室温黑暗振荡反应 30 min，取出在515 nm 下测定反应液的吸光值A(以不加样品溶液为参比对照，吸光值A0；以无水乙醇为空白对照).计算公式为：

寒光暴闪，武成龙剑舞回龙护住全身。只听“嘭！嘭！嘭！”掌剑相触的声音震耳欲聋，人影消失了，看到的只有剑影、掌影，掌影、剑影。“嘭！”一声巨响，掌影消失了，剑影也消失了。

1.3 数据分析

2.1.4 萃取压力对萃取液抗氧化能力的影响 图5为萃取时间40 min、料液比1∶2、温度45 ℃，不同萃取压力下萃取液的抗氧化能力.由图5可知，在萃取压力0.2 MPa条件下，萃取液的抑制率为11.80%，随着萃取压力的增加，抑制率显著增加，在0.5 MPa时达到90.71%，与0.6，0.7 MPa条件下萃取液的抑制率92.91%，92.66%，无显著差异(P<0.05).考虑到压力的增加会提高工业化生产过程能耗的成本，最佳的萃取压力可选择0.5 MPa.

2 结果与分析

2.1 亚临界丁烷萃取龙虾壳虾红素的单因素试验

由表2可知，各因素对虾壳虾红素萃取液抗氧化能力影响的主次排序为B>D>C>A，即料液比 >萃取压力>萃取温度>萃取时间.工艺参数最佳组合为A3B3C2D2，即萃取时间60 min、料液比1∶3.0、萃取温度45 ℃、萃取压力0.6 MPa.由于萃取时间对虾壳虾红素萃取液抗氧化能力影响较小，从节约能耗的角度考虑，选取萃取时间为50 min.

1.2.5 虾红素的HPLC测定 参考苗凤萍[26]的方法采用HPLC法，测定虾红素的含量.具体步骤为：将1.2.1中萃取液用0.22 μm有机滤膜过滤，滤液在476 nm下进行HPLC检测(Agilent 1 100，C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相位A，丙酮B，H2O，洗脱梯度为：83%A，17%B(0～8 min)； 90%A，10%B(9～16 min)；95%A，5%B(17～30 min).流速：0.8 ml/min，进样量5.0 μL.

2.1.2 料液比对萃取液抗氧化能力的影响 图3为萃取时间40 min、温度40 ℃、压力0.5 MPa，不同料液比下萃取液的抗氧化能力.由图3可知，在料液比1∶0.5时，萃取液的抑制率为40.57%，随着料液比的增加，抑制率显著增加，在1∶2时达到84.34%，当料液比在1∶2.5～1∶3范围时，虽然抑制率相对于1∶2有所增加，但未达到显著差异(P>0.05).考虑到工业化生产过程成本的优化，最佳的料液比可选择1∶2.

图2 萃取时间对龙虾壳提取液抗氧化能力的影响 Figure 2 The effect of extraction time on antioxidant capacity of extracts from lobster shell

图3 料液比对龙虾壳提取液抗氧化能力的影响 Figure 3 The effect of material solvent ratio on antioxidant capacity of extracts from lobster shell

2.1.3 萃取温度对萃取液抗氧化能力的影响 图4为萃取时间40 min、料液比1∶2、压力0.5 MPa，不同温度下萃取液的抗氧化能力.由图4可知，在30 ℃萃取条件下，萃取液的抑制率为18.86%，随着萃取温度的增加，抑制率显著增加，在45 ℃时达 到最大值92.19%，然后随着温度的增加，抑制率在50 ℃和55 ℃条件下显著下降.以上结果表明，最佳的萃取温度可选择45 ℃.

1.2.3 正交试验 在单因素试验的基础上，以虾壳萃取液抗氧化能力为评价指标，以萃取时间、液料比、温度和压力作为影响因素，采用L9(34)正交试验优化亚临界萃取虾壳虾红素的工艺，正交试验因素与水平见表1.

图4 萃取温度对龙虾壳提取液抗氧化能力的影响 Figure 4 The effect of temperature on antioxidant capacity of extracts from lobster shell

每个试验重复3次，采用SPSS 11.5软件进行One-Way ANOVA Duncan数据差异显著性分析.

图5 萃取压力对龙虾壳提取液抗氧化能力的影响 Figure 5 The effect of extraction presure on antioxidant capacity of extracts from lobster shell

2.2 亚临界萃取龙虾壳虾红素的正交试验

2.1.1 萃取时间对萃取液抗氧化能力的影响 图2为料液比1∶2.0、萃取温度40 ℃、压力0.5 MPa，不同萃取时间下萃取液的抗氧化能力.由图2可知，在萃取10 min时，萃取液的抑制率为8.67%.随着萃取时间的延长，抑制率显著增加，在40 min时达到86.50%.至50 min和60 min时，抑制率没有显著增加，且延长萃取时间会造成能耗的增加及工序时间的延长，因此，最佳的萃取时间为40 min.

(4)在砂土中进行静压沉桩时,桩-土界面土体与桩体共同下沉约0.2 mm即开始脱离桩体逐步稳定,因此桩体受到的桩侧摩阻力主要来自桩与土的摩擦力.

摸摸脖子，脖子冰凉。翻翻衣兜，衣兜里空空如也。那里本应该有一沓崭新的老头票子来着。但是他找错了人。不但钱没捞着，还挨了顿臭揍……

表2 正交试验设计与结果

Table 2 Design and result of orthogonal experiments

序号因素A 时间/mimB 料液比/(g·mL-1)C 温度/℃D 压力/MPa抑制率/%1111190.452122291.283133392.364212393.575223191.966231294.807313290.868321391.689332192.06k190.7786.6890.6589.17k290.8491.2491.2591.92k390.8994.5090.7291.18R0.137.350.632.78

2.3 验证性试验和虾红素的HPLC测定

取同一批次虾壳原料，在萃取时间50 min、料液比1∶3.0、萃取温度45 ℃、萃取压力0.6 MPa条件下进行3组平行试验，对萃取液进行抗氧化能力和虾红素的HPLC测定(图6).结果显示，萃取液的平均抑制率为95.22%，虾红素的平均含量达到24.05 mg/g.

2014年5月，山东高速集团接替山东黄金集团，成为山东男篮的又一任东家。时任高速集团董事长孙亮在签约仪式上表示接手山东男篮是山东高速集团进军文体产业的第一步，高速集团高层也表示，高速集团不会为了打球而打球，会力争将山东男篮做成一个品牌，进军体育产业，通过篮球扩大高速品牌的影响力，用篮球带动相关产业的发展，反哺篮球。

A和B分别为标准品和样品的色谱图. 图6 龙虾壳虾红素的HPLC色谱图 Figure 6 HPLC chromatogram of astacene in lobster shell

3 讨论与结论

伴随人民生活水平的提高，食品保鲜问题越来越受到公众的重视，抗氧化剂对于保持食品原有的风味和质量有重要作用，而天然抗氧化剂对于消除消费者内心不安有着积极作用，同时也具有很大的消费市场潜力，越来越受到国内外研究机构及专家们的关注[27].虾青素作为色素添加剂，有很多功能，主要包括：作为抗氧化剂、维生素的前体物质、增强免疫、促进生长和繁殖、利于成熟和具光保护作用等，广泛应用于水产养殖业、蛋禽和家畜养殖业饲料添加剂，功能食品、化妆品、药品等方面[26].

对于虾红素的提取，很多学者已进行了大量研究.比如，杨左海等[17]利用NaOH浸提龙虾壳中红色素，考察了NaOH用量、浸提浓度、浸提温度等因素对浸提溶液的吸光度，以及沉淀虾红素pH和在不同酸碱性溶液中的还原性和稳定性；肖伟敏等[18]用乙醇回流提取龙虾壳红色素，并通过加入1 mol/L盐酸使浓缩液中的红色素沉淀；田龙等[19]采用95%食用乙醇作溶剂，辅助超声波条件下对龙虾壳红色素进行提取，确定最佳提取工艺条件为超声功率90%、超声时间75 min、超声温度50 ℃，在此条件下龙虾壳红色素的提取率可达85%.在虾红素提取液抗氧化能力研究方面，单微娜等[28]采用超声微波协同95%乙醇提取龙虾壳中虾红素，研究虾红素在清除羟基自由基、DPPH自由基、过氧阴离子和抑制猪油自氧化的能力，结果发现虾红素能有效抑制猪油的氧化，对羟自由基的清除率比维生素C高，对DPPH的清除率，当质量浓度升高至60 μg/mL时与维生素C接近.以上均为提取方法或抗氧化能力鉴定等方面的研究，而对虾壳中具体活性物质——虾红素含量的测定与分析还未见报道.

本研究采用先进的亚临界流体萃取技术，以丁烷为萃取溶剂，首先选择料液比、萃取时间、温度和压力进行单因素试验，以萃取液抗氧化能力为评价指标，然后采用正交试验优化工艺条件，并对优化后获得虾红素含量进行HPLC检测，结果表明，虾红素的最佳工艺条件为：萃取时间50 min，料液比1∶3.0，萃取温度45 ℃，萃取压力0.6 MPa，在此条件下，萃取液的体外抗氧化能力抑制率达到95.22%，虾红素含量为24.05 mg/g.

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