豆粕是大豆榨取豆油后的副产物，粗蛋白质含量高达30%～50%，并含多种氨基酸，是饲料工业中应用最为广泛的植物性蛋白质原料[1]，常用于家禽配方饲料[2]。未经处理的豆粕由于蛋白质分子质量较大，并且含抗营养因子成分[3]，被消化、分解速率缓慢，极大地影响了动物对豆粕的吸收利用。因此，消除大分子蛋白质的不利影响，提高动物对豆粕的消化吸收性能一直是人们关注的热点。豆粕经微生物发酵后，大分子蛋白质降解为易吸收的小分子蛋白质[4-5]，并产生大量具有独特生理活性功能的活性肽，促进消化、吸收，可调节整个消化道对饲料营养物质的分解、合成、吸收和利用，进而降低豆粕用量和养殖成本。

优良菌株的筛选是豆粕微生物发酵的关键技术之一。王伟等[6]筛选到可用于降解豆粕中大分子蛋白质的菌株B1，蛋白酶活性达111.8 U/mL。熊涛等[7-8]筛选到2株蛋白酶活性较高的细菌，分别为甲基营养型芽孢杆菌B1和耐酸的枯草芽孢杆菌A-12。刘旭辉等[9]也筛选到1株解淀粉芽孢杆菌，其蛋白酶活性达1 547.49 U/mL。表明以产蛋白酶活性为主要指标，可筛选到能降低豆粕大分子蛋白质结构的菌株，但目前上述菌株绝大多数处于实验室研究阶段，缺乏可用于豆粕工业化大规模发酵的菌株。

河北农业大学生命科学学院微生物实验室发酵饲草与饲料研究课题组从事多年饲料原料的微生物发酵工作，筛选和保存了大量产酸、产蛋白酶的菌株。鉴于此，拟利用现有菌种资源，筛选出适用于豆粕微生物发酵的高产蛋白酶菌株，并利用该菌株固体发酵豆粕，以期降解豆粕大分子蛋白质，从而提高豆粕饲用价值。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

供试菌株为河北农业大学生命科学学院微生物实验室保存的30株具有产蛋白酶功能的芽孢杆菌，编号分别为：β-2、β-11、20、57、M4、β-8、46、W-18、β-7、β-6、β-10、Lipro-1、J-4、DB-7-6、ED-3-7、Y-4、N-12、2-27、β-9、M-2、Lipro-2、N-2、β-3、β-4、2709-3、1398、G4、β-1、β-5、M10。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(NB)组成：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%，pH值7.0。牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)：在NB基础上加入琼脂2.0%。

脱脂牛奶培养基组成：葡萄糖1.0%、氯化钠0.5%、琼脂1.5%，pH值7.2。115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后加入脱脂牛奶(每100 mL加入20 mL脱脂牛奶)，待其凝固后使用。

由图2可知，菌株β-2、Lipro-1未检测到酸性蛋白酶活性，菌株β-3、β-4、20、β-5、M10和1398的酸性蛋白酶活性小于10 U/mL；菌株β-2、β-9、M-2、β-3、β-4、20、M4、β-5和M10的中性蛋白酶活性较低，小于50 U/mL。

以菌株在脱脂牛奶平板上透明圈的大小为指标，筛选具备高产蛋白酶能力的菌株。将活化的30株芽孢杆菌点接到脱脂牛奶平板上，每株芽孢杆菌设4个重复。将平板置于37 ℃培养箱培养48 h，并分别于24 h和48 h测量透明圈的大小，将从菌落边缘到透明圈边缘的距离作为透明圈的半径。

1.3 菌种活化

挑取斜面保存的菌株，采用三区划线法接种于NA培养基上，置于37 ℃培养箱中培养过夜。

以产生的中性蛋白酶和酸性蛋白酶的活性大小为指标，进一步对高产蛋白酶菌株进行筛选。将已活化的单菌落接种于NB培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养24 h后，于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取其上清作为粗酶液备用。参照《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定》[10]中关于酸性和中性蛋白酶活性的测定方法，测定蛋白酶活性。

1.4 产蛋白酶菌株初筛

固体发酵培养基组成：豆粕89.0%、玉米粉10.0%、硫酸铵1.0%。

对照组：对对照组疑似乳腺癌患者实施钼靶X线检查患者在诊断过程中保持仰卧体位，前胸紧贴线圈槽，对冠状位、矢状位和横断位进行常规扫描，对静脉进行强化扫描，主要观察患者乳房内的乳腺是否存在肿块，如果存在肿块，则观察肿块的体积、形态、结构及钙化情况。

2.1 脂蛋白定义与分类 脂蛋白由蛋白质结合脂类形成，它们通过淋巴和循环系统输送脂质，是诱发认知障碍甚至痴呆的危险因素[20]。2016年修订版《中国成人血脂异常防治指南》将脂蛋白分为乳糜微粒、HDL、LDL、中密度脂蛋白、极低密度脂蛋白5大类，此外还有一种脂蛋白称为脂蛋白a[21]。脂蛋白内的蛋白质组分称为载脂蛋白(apolipoprotein，apo)，如apoA、apoB等。

实施地下水超采综合治理是一项艰巨复杂的系统工程，涉及节水、调水、挖潜、治污、管理等多项措施，坚持突出重点、综合施策、强力推进，重点在“节、引、蓄、调、管”五个方面下功夫、做文章、要效益。

1.5 产蛋白酶菌株复筛

取配制的标准系列工作溶液进样检测，以峰面积Y对浓度X（μg/ml）作标准曲线，以那西肽峰得出回归方程为Y=6.001 6×105X-2.988 7×104，相关系数R2为0.999 9，那西肽在 0.1～25.0 μg/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系，能够满足那西肽预混剂含量的测定。

1.6 固体发酵效果试验

以酸溶蛋白质含量为指标，采用豆粕固体发酵对筛选到菌株的发酵效果进行测定。将筛选的蛋白酶活性较高的菌株接种于NB培养基中，37 ℃培养24 h，按6%接种量接种于未灭菌的豆粕固体发酵培养基中，含水量50%～60%。以NB培养基代替发酵液为空白对照。将发酵料装入塑料桶中压实、密封，于室温下发酵。参照《饲料原料中酸溶蛋白的测定方法研究》[11]中的方法分别于第15 天和30 天测定酸溶蛋白质含量，并按V物料∶V水=1∶5测其pH值。

1.7 菌落、菌体形态观察

参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《微生物学实验教程》[13]中的方法观察菌落形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度等特征和经革兰氏染色后的显微镜下的菌体形态。

1.8 16S rDNA扩增

综合上述结果，选出9株透明圈半径大于4 mm、酸性蛋白酶活性大于10 U/mL、中性蛋白酶活性大于50 U/mL的菌株，分别为β-1、ED-3-7、46、N-12、Y-4、2709-3、β-8、G4和W-18，采用豆粕固体发酵法从上述9株芽孢杆菌中进一步筛选发酵效果好的菌株。

1.9 生理生化特性分析

按照《常见细菌系统鉴定手册》[12]结合16S rDNA序列比对结果对细菌进行生理生化特性试验。试验中所用试剂均为国产分析纯试剂。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株初筛结果

以脱脂牛奶的降解能力作为筛选指标，筛选出透明圈半径较大的菌株，结果见图1。细菌培养48 h的透明圈半径较大，其中，菌株β-2、β-11、20、57、M4培养24 h后透明圈半径小于2 mm，48 h小于 4 mm，β-8、46、W-18、β-7、β-6、β-10、Lipro-1、J-4、DB-7-6、ED-3-7、Y-4、N-2、2-27、β-9、M-2、Lipro-2、N-12、β-3、β-4、2709-3、1398、G4、β-1、β-5、M10透明圈半径在4～10 mm。整体上，β-8、46、W-18、ED-3-7、Y-4、2709-3、N-12、β-1和M10等透明圈半径较大。

  

图1 菌株在脱脂牛奶平板上生长的透明圈半径大小

2.2 产蛋白酶菌株复筛结果

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基因组的提取、16S rDNA的扩增及系统发育树的构建参照文献[14]的方法进行。

  

图2 菌株酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性大小

2.3 菌株固体发酵效果

采用固体发酵法对筛选到的9株芽孢杆菌的发酵效果进行验证，分别在发酵的第15天和30天检测其酸溶蛋白质含量的变化，结果见图3。发酵15 d后，酸溶蛋白质含量为9.54%～11.94%，发酵30 d后，酸溶蛋白质含量在11%左右，其中N-12菌株最高，达到13.47%，其与对照组和未发酵豆粕组相比分别提高2.36个百分点和9.81个百分点。根据中华人民共和国农业行业标准NY/T 2218—2012中关于《饲料原料发酵豆粕》的要求，酸溶蛋白质含量应大于等于8%，该菌株可用于豆粕大规模发酵，其发酵效果较好。

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合适的pH值不仅利于发酵豆粕的保存，而且可以提高动物采食量和消化吸收能力。本试验检测了豆粕发酵15 d和30 d的pH值，如图4所示，15 d的pH值为4.5～4.6，而30 d的pH值则更低，为4.3～4.4。

  

图3 豆粕接种芽孢杆菌发酵15 d和30 d后酸溶蛋白质含量

  

图4 豆粕接种芽孢杆菌发酵15 d和30 d后pH值变化

2.4 菌株鉴定结果

使用N-12菌株进行固体发酵产生的酸溶蛋白质含量最高、发酵效果最好，后续试验中通过菌落菌体形态、16S rDNA序列和菌株生理生化特性对N-12菌株进行种属鉴定。

2.4.1 菌落、菌体形态观察 N-12在NA培养基上培养24 h后，菌落形态较小、圆形、表面光滑隆起、白色不透明且具有整齐边缘。经革兰氏染色后，镜下可见两端钝圆、有芽孢的革兰氏阳性杆菌。

2.4.2 系统发育树构建 根据1.8中的方法，以N-12的基因组为模板对其16S rDNA序列进行扩增，并将其PCR产物送深圳华大基因科技有限公司测序，得到1 402 bp的序列。测序结果提交到NCBI生物信息学网站(基因登录号：MG066462)，经Blast分析后用MEGA 6构建系统发育树(图5)，N-12与Bacillus siamensis KCTC 13613T的同源性最高，达99.86%。

  

图5 基于16S rDNA序列构建的系统发育树

2.4.3 菌株生理生化特性 根据《常见细菌鉴定手册》对N-12进行生理生化性质分析，结果见表1。N-12的V-P测定、丙二酸利用、柠檬酸利用、糖醇类发酵、硝酸盐还原、淀粉水解、产氨试验、卵磷脂酶、耐盐(2%NaCl、5%NaCl、7%NaCl、10%NaCl)、运动性检测、甲基红反应、明胶液化等试验结果均显阳性。荧光色素、吲哚试验和脲酶试验为阴性。结合菌落菌体形态学观察、16S rDNA序列、菌株生理生化特性鉴定， N-12菌株为芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。

 

表1 N-12菌株生理生化鉴定结果

  

项目结果项目结果革兰氏染色+硝酸盐还原+V-P试验+2%NaCl+丙二酸利用+5%NaCl+柠檬酸利用+7%NaCl+荧光色素-10%NaCl+糖醇类发酵+接触酶+淀粉水解+运动性+产氨试验+甲基红反应+卵磷脂酶+明胶液化+吲哚试验-脲酶试验-

注：+表示阳性；-表示阴性。

3 结论与讨论

豆粕是畜禽重要的植物性蛋白质饲料，其蛋白质含量高，但大豆蛋白质分子结构复杂，分子质量大，影响其消化吸收利用率。经微生物发酵后的豆粕更利于动物吸收利用，具有更大的应用价值[15]。用于豆粕发酵的微生物通常为产蛋白酶的菌株，对这些菌株的筛选普遍采用酪素平板或脱脂牛奶平板[16]，并已筛选出乳酸菌[17]、曲霉菌[18]、酵母[19]和芽孢杆菌[20]等多种可用于豆粕发酵的菌株。本试验中结合脱脂牛奶平板和蛋白酶活性测定，更直观反映出菌株产生蛋白酶能力的大小。

豆粕固体发酵受到菌种、接种量、环境、发酵时间等多方面因素的影响[21-24]，并且由于技术条件限制和成本约束，大规模豆粕发酵一般采用生料发酵。何勇锦等[25-26]分别采用黏红酵母和乳酸短杆菌KLDS-1发酵豆粕粉生料，使发酵豆粕中的小肽含量达到27.00%和26.12%。董伟洁等[27]采用B.methylotrophicus SD48菌株深层发酵豆粕生料，使酸溶蛋白质相对含量达26.24%。本研究中N-12发酵豆粕后酸溶蛋白质含量为13.47%，其发酵条件还有待于进一步优化。

本试验通过脱脂牛奶平板和蛋白酶活性测定方法，结合豆粕固体发酵效果，最终筛选到1株产蛋白酶较高、发酵效果好的菌株N-12，经鉴定该菌株为芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，为豆粕发酵提供了新的菌种资源，为发酵豆粕的进一步开发利用提供了理论基础。

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