山羊传染性胸膜肺炎是以纤维素性胸膜肺炎为主要特征的山羊的一种呼吸道传染病，感染羊群无年龄和性别差异，发病率和死亡率都很高，被世界动物卫生组织(OIE) 列入通报疫病名录，我国将其列为二类传染病[1-4]，该病以高热、卡他性鼻液、纤维素性胸膜炎等症状为主要临床特点。山羊传染性胸膜肺炎在我国流行已久，1947年流行于甘肃，随后，内蒙古、四川、山东等地都有临床病例报道[5]。万一元等[6]于贵州罗甸等地分离到丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc)，张双翔等[7]首次分离到绵羊肺炎支原体。铜仁沿河县为贵州白山羊的原产地和主产区，山羊传染性胸膜肺炎发生频繁，2岁内山羊最易感染，发病率为37.7%，病死率为36.4%[8]。山羊传染性胸膜肺炎已成为严重危害贵州省养羊业健康发展的主要传染病。

花了两个多小时，紫云把窗擦洗干净，桌子、床上都重新整理了，乱放的杂物装进纸箱里，然后再把地拖洗一遍，屋子亮堂多了。看见紫云累得满身是汗，蒋浩德有些心疼。

细胞核转录因子κB(NF-κB)存在于几乎所有类型细胞的胞质，一般以同源或异源二聚体p50/p65非活性形式存在，p65可提高调控基因的转录活性[9]。p50/p65二聚体在静态细胞与血浆中的I-κBα、I-κBβ和I-κBγ等NF-κB抑制家族蛋白结合，抑制NF-κB与靶DNA调节区的结合。前炎性因子TNF-α、IL-1β及脂多糖等在炎症反应中可诱导细胞NF-κB活化。NF-κB-IκBs复合物中突起的IκBs氨基末端第32、36位丝氨酸残基，易被IκBs蛋白激酶磷酸化，然后被蛋白酶降解，使NF-κB从复合物中解离出并转位于细胞核，与靶基因结合共同调控靶基因的转录。NF-κB是一种具有转录激活功能的蛋白质，可在炎症部位高度表达[10]，在调控炎症反应的基因表达方面NF-κB起关键性作用，是启动中性粒细胞炎症的关键因子[11]，调节NF-κB的活性将影响炎症细胞因子的表达。

一年多后，程瀚讲公安厅的房子也想装修，黄某某只得同意。2012年左右装修结束，大约花费20多万元，程瀚一直没有提过装修款结算的事情。

NF-κB存在于各种细胞中，是具有多项转录调控作用的转录因子。NF-κB不但参与介导免疫应答、炎症反应、细胞凋亡等多种基因的表达调控，而且与很多炎性疾病的发病机制关系密切。研究表明，受NF-κB调节的基因有200多种，其激活因子不少于150种[12]。近年来，通过利用siRNA技术干扰沉默NF-κB相应基因改变其对靶基因的调控以及对其炎性调控机制进行探索，使得一些疾病有望得以治疗[13]。尽管NF-κB与炎性反应关系密切，可提高多种炎性介质(TNF-α、IL-1β、IL-8以及黏附因子)转录，且可被TNF-α、IL-1β所激活，但利用NF-κB的干扰沉默来控制和治疗肺炎的研究较少。目前，NF-κBp65在Mmc感染山羊肺泡上皮细胞中的具体作用机制仍不清晰。为此，探讨了NF-κB抑制剂BAY11-7082对Mmc介导的山羊肺泡上皮细胞中凋亡因子和炎症因子的影响，研究抑制剂BAY11-7082在Mmc感染山羊肺泡上皮细胞中发挥的作用，旨在为抗山羊传染性胸膜肺炎新型药物和疫苗的研发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 支原体与细胞

Mmc、山羊肺泡上皮细胞为铜仁学院梵净山特色动植物资源重点实验室保存。

1.2 主要试剂

将不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染细胞，将Mmc感染组细胞和PBS作用组细胞作为对照组，于24 h收集细胞，利用实时定量PCR检测胞内TNF-α mRNA的相对表达量。结果显示，Mmc可显著提高TNF-α mRNA表达水平(P<0.01)，而抑制剂在5 μmol/L和10 μmol/L浓度下可以显著降低Mmc介导的TNF-α mRNA相对表达量(P<0.05)(图3)。结果表明，BAY11-7082可抑制Mmc介导的TNF-α mRNA表达水平。可见，NF-κB与细胞凋亡有一定的关系。

取细胞上清液，4 ℃、12 000 r/min离心7 min，按照试剂盒说明书检测NO浓度。

1.3 细胞处理

将不同浓度的抑制剂BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)与细胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染细胞，将Mmc感染组细胞和PBS作用组细胞作为对照组，于24 h收集细胞，检测Mmc对细胞内NO的影响。结果显示，Mmc可显著提高NO水平(P<0.01)，抑制剂BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L浓度下可以显著降低Mmc介导的NO分泌水平(P<0.05)(图5)。NO是一个非常关键的信号分子，在细胞凋亡过程中起着重要作用。结果表明，抑制剂BAY11-7082可以降低Mmc引起的细胞凋亡。

1.4 实时定量PCR检测NF-κBp65、TNF-α、IL-8 mRNA

从NCBI网站GenBank查找NF-κBp65、TNF-α、IL-8和β-actin公布的基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(表1)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

TNF-α、IL-8 mRNA实时定量PCR检测细胞样品包括24 h Mmc感染组细胞、Mmc-抑制剂BAY11-7082 1 μmol/L组细胞、Mmc-抑制剂BAY11-7082 5 μmol/L组细胞、Mmc-抑制剂BAY11-7082 10 μmol/L组细胞及PBS对照组细胞。

NF-κBp65 mRNA实时定量PCR检测细胞样品包括4 h、8 h、12 h和24 h Mmc感染组细胞及PBS对照组细胞。

 

表1 目的基因扩增引物序列

  

引物名称引物序列(5′—3′)NF-κBp65-FGCTATGTCCGTGTTCAGC NF-κBp65-RTGGGTTTAGACGCAGTTAT TNF-α-F GCCAACTCCCTCTGTTTATGTTNF-α-R GGACACCTTGACCTCCTGAATIL-8-FGCTGGCTGTTGCTCTCTT IL-8-RGTGGAAAGGTGTGGAATGT β-actin-F GCTCTCTTCCAGCCTTCCTβ-actin-R AGGTCTTTGCGGATGTCG

将不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染细胞，将Mmc感染组细胞和PBS作用组细胞作为对照组，于24 h收集细胞，利用实时定量PCR检测胞内IL-8 mRNA的相对表达量。结果显示，Mmc可显著提高IL-8 mRNA表达水平(P<0.01)，而抑制剂BAY11-7082在抑制5 μmol/L和10 μmol/L浓度条件下可显著降低Mmc介导的IL-8 mRNA表达量(P<0.05)(图2)。结果表明，BAY11-7082可以抑制Mmc介导的IL-8 mRNA表达水平。

1.5 H2O2浓度检测

把H2O2检测试剂在冰上融化，在检测孔加入50 μL样品或标准品。在每个孔内加入100 μL H2O2检测试剂。轻轻振荡混匀，室温放置30 min，然后立即测定A560。计算出样品中H2O2的浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。

比如，当教师在讲解课文《小蝌蚪找妈妈》时，首先，教师可以结合自己对文章的理解，制作出教学的大纲：小蝌蚪找妈妈的起因、小蝌蚪找妈妈的过程、找错妈妈的原因、最终的结果。其次，教师可以针对教学大纲制作教学视频，帮助学生形成知识脉络，降低学生的学习难度。在正式教学的过程中，教师可以要求学生按照视频中所体现的知识结构对课文进行学习，加深对知识的理解，提升自身的学习质量。

1.6 NO浓度检测

在科拉科夫斯基看来，所有可能的认识对象都限制在实践的范围之内，幻想摆脱实践关系而认识“纯粹的自我”或“纯粹的‘外物’”，这根本是不可能的。因此，离开实践而谈论思维的现实性或非现实性是无意义的虚假问题。“实践功效不是用以证实知识之独立于人的真理性的工具，而是创造真理的东西。”[10]实践是构成真理概念的因素。

为解决学生课外阅读量少，阅读范围窄等问题，教师可定期为学生拟定课外阅读计划，汇编补充阅读资料，推荐电影、纪录片、新闻、演讲等，贴合学生自身兴趣，适应学生心理发展，提升阅读能力。

1.7 Caspase-3活性检测

取细胞上清液，4 ℃、12 000 r/min离心8 min，按照试剂盒说明书检测Caspase-3活性。

1.8 Mmc对细胞的致病力检测

用Triton X-100裂解细胞10 min，释放出细胞内Mmc，梯度稀释后涂布固体平板进行计数。

1.9 数据处理与分析

数据采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，用平均数±标准差描述，多组样本间平均数进行方差分析，2组间比较采用两样本平均数的t检验或q检验。

2 结果与分析

2.1 Mmc对NF-κBp65 mRNA表达的影响

Mmc感染肺泡上皮细胞后，PBS作用组细胞作为对照组，于4 h、8 h、12 h和24 h收集细胞，提取细胞的总RNA，用实时定量PCR检测NF-κBp65mRNA水平。结果发现，4 h时Mmc感染组细胞与PBS对照组相比NF-κBp65 mRNA表达水平无明显变化，而在8 h、12 h和24 h时，Mmc可以显著提高NF-κBp65 mRNA表达水平(P<0.01)(图1)。结果表明，Mmc感染可以提高NF-kBp65 mRNA表达水平。

  

**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)

 

图1 Mmc感染细胞后NF-κBp65 mRNA表达变化

2.2 BAY11-7082对Mmc介导的IL-8 mRNA水平的影响

用Trizol一步法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。内参β-actin为对照，在罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪上进行相对定量PCR反应，反应体系为2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，双蒸水6 μL。PCR反应条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃(NF-κBp65、IL-8)或61 ℃(TNF-α、β-actin)30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每组细胞每个时间点分别做3个重复，样本基因NF-κBp65、TNF-α、IL-8的表达强度用其对应的β-actin的量进行校正，即ΔCt=Ct(NF-κBp65/TNF-α/IL-8)-Ct(β-actin)，相对表达量用2-ΔΔCt法进行分析。

  

*、**分别表示B组与其他组相比差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)，下同

 

图2 Mmc感染细胞后IL-8 mRNA表达变化

2.3 BAY11-7082对Mmc介导的TNF-α mRNA水平的影响

胎牛血清和DMEM细胞培养液购自GIBCO公司；酵母提取物、蛋白胨购自上海生工生物技术有限公司；Triton X-100细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；Caspase-3活性检测试剂盒、NO检测试剂盒、H2O2检测试剂盒和BAY11-7082抑制剂购自碧云天公司；SYBR Green Ⅰ荧光染料购自罗氏公司。

  

图3 Mmc感染细胞后TNF-α mRNA表达变化

2.4 BAY11-7082对Mmc介导的H2O2分泌的影响

将不同浓度的抑制剂BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)与细胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染细胞，将Mmc感染组细胞和PBS作用组细胞作为对照组，于24 h收集细胞，检测Mmc对细胞内H2O2分泌的影响。结果显示，Mmc可显著提高H2O2分泌水平(P<0.01)，而抑制剂BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L浓度下可以显著降低Mmc介导的H2O2分泌(P<0.05)(图4)。结果表明，抑制剂BAY11-7082可以降低Mmc引起的细胞损伤。

  

图4 Mmc感染细胞后H2O2分泌变化

2.5 BAY11-7082对Mmc介导的NO的影响

(1)NF-κBp65 mRNA检测组：将细胞传代于六孔板中培养，当单层细胞生长至80%覆盖度时，更换无双抗的细胞培养液，Mmc与细胞比例按10∶1感染细胞，在5%CO2、37 ℃环境中孵育。于4 h、8 h、12 h和24 h收集细胞；(2)TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、Caspase-3活性、H2O2浓度及NO浓度检测组：将细胞传代于六孔板中培养，当单层细胞生长至80%覆盖度时，更换无双抗的细胞培养液，不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞提前孵育1 h后，将Mmc与细胞按10∶1感染细胞，在5%CO2、37 ℃环境中孵育，于24 h收集细胞；(3)Mmc致病力检测组：将细胞传代于六孔板中培养，当单层细胞生长至80%覆盖度时，更换无双抗的细胞培养液，不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞提前孵育1 h后，将Mmc与细胞按10∶1感染细胞，在5%CO2、37 ℃环境中孵育40 min，PBS漂洗后将50 μg/mL庆大霉素与感染细胞共同孵育60 min，PBS漂洗后在含有25 μg/mL的庆大霉素的培养基中继续培养，于24 h收集细胞。不同的细胞处理组分别用以下字母表示，A：PBS对照组，B：支原体感染组，C：Mmc+抑制剂BAY11-7082(1 μmol/L)组，D：Mmc+抑制剂BAY11-7082(5 μmol/L)组，E：Mmc+抑制剂BAY11-7082(10 μmol/L)组。

  

图5 Mmc感染细胞后NO浓度变化

2.6 BAY11-7082对Mmc介导的Caspase-3活性的影响

将不同浓度的抑制剂BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)与细胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染细胞，将Mmc感染组细胞和PBS作用组细胞作为对照组，于24 h收集细胞，检测Caspase-3的活性。结果显示，Mmc可显著提高Caspase-3活性(P<0.01)，而BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L浓度下能够显著降低Mmc介导的Caspase-3的活性(P<0.05)(图6)。结果表明，抑制剂BAY11-7082可显著降低Mmc引起的凋亡相关蛋白Caspase-3的活性。

  

图6 Mmc感染细胞后Caspase-3活性变化

2.7 BAY11-7082可降低Mmc对细胞的致病力

将不同浓度的抑制剂BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)与细胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染细胞，将Mmc感染组细胞和PBS作用组细胞作为对照组，于24 h收集细胞，检测胞内Mmc的数量。结果显示，抑制剂BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L浓度下的细胞内Mmc数量显著低于未添加BAY11-7082的Mmc感染组(P<0.05)(图7)。结果表明，抑制剂BAY11-7082可显著降低Mmc在细胞内的存活量。

资产在评估中的过分夸大或者缩小，都会给整个金融体系运行带来顺周期性风险，怎么来遏制金融机构在资产评估中的随意性，这是国际上很多国家在金融监管中的难题。公允会计计量原则运行不好，容易在金融实践中产生顺周期性，而通过建立科学的公允会计计量来缓释这一评估监管制度带来的顺周期性是各国通行的做法。

夏天温度湿度较高，是有害物质释放的最好环境，材料是否环保，在夏天更容易辨别。夏季刷油漆，气味容易挥发，油漆干得快，打磨也就及时，油漆的光泽度能充分显现。另外，夏季是家装行业的传统淡季，常常有一些促销活动，不仅价格实惠，而且手艺好的工人在这段时间更有“档期”，他们不用同时干几家的装修活，更能慢工出细活。

  

图7 Mmc感染细胞后存活量变化

3 结论与讨论

天然免疫系统是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。Toll样受体(TLR)在其中发挥主导作用，绵羊肺炎支原体在山羊肺泡上皮细胞感染过程中，支原体激活宿主细胞Toll样受体信号通路后，细胞会释放大量促炎因子从而使IL-8、NF-κB等表达量均显著上调，导致炎症因子释放进而激活机体的炎症反应，最终会导致组织损伤和疾病[14]。可通过抑制NF-κB活性，减少炎症因子的表达而发挥抗炎作用[15]。

绝大多数哺乳类细胞中都有Caspases家族，在Caspase级联反应中居于重要位置的Caspase-3与Caspase-8是致使细胞发生凋亡的关键因子和所有凋亡信号传导的中枢[16-17]。Caspase-8是凋亡途径中的起始因子，可以直接激活下游效应Caspase，Caspase-3处于凋亡级联反应的下游，也是细胞程序性死亡的主要效应因子[18]。本试验结果显示，Mmc可显著提高Caspase-3的活性，而BAY11-7082能够显著降低Caspase-3的活性，削弱Mmc对Caspase-3活性的促进作用。

H2O2是活性氧的代谢副产物，是很多反应过程中的主要因子。而近年来研究发现，ROS会参与激活NF-κB等因子，赵进军等[19]的研究结果表明，H2O2损伤能导致肝细胞核中NF-κB蛋白表达量增加。赵宏伟等[20]的研究结果表明，氧化损伤使NF-κB活化后进入细胞核，进一步激活某些凋亡路线使细胞凋亡。本试验中，Mmc感染使NF-κBp65 mRNA表达水平显著提高，同时可提高NF-κBp65的磷酸化水平。在抑制剂BAY11-7082作用下，可以抑制Mmc介导的IL-8 mRNA表达水平，降低了机体内的炎症因子表达量和H2O2分泌量，减轻了Mmc对细胞的损伤。

NO在不同浓度下对细胞存在促进凋亡和抑制凋亡2种功能。己有研究发现，支原体不仅介导机体产生免疫反应，同时也诱导单核细胞和巨噬细胞坏死或凋亡[21]。细胞凋亡是通过一系列生化与细胞因子变化导致细胞死亡的过程。NO作为一种多功能分子参与机体各种生理和病理过程。在低浓度下，可保护细胞免受凋亡，然而，NO的过度分泌则会导致多种细胞类型发生凋亡。此外，许多类支原体能够通过诱导过量NO的表达来触发凋亡[22-23]。而NO的表达是由低剂量抑制因子一氧化氮合酶所调控的[24]，过量的NO与超氧阴离子自由基形成过氧亚硝酸盐，从而导致细胞凋亡的级联激活[25]。综上可知，NF-κB信号通路在Mmc致病机制中发挥重要作用。

参考文献:

[1] Kusiluka L J,Ojeniyi B,Friis N F,et al.Mycoplasmas isolated from the respiratory tract of cattle and goats in Tanzania [J].Acta Vet Scand,2000,41(3):299-309.

[2] 倪莉,徐强,赵俊,等.山羊传染性胸膜肺炎病原的分离鉴定和生物学特性[J].中国兽医杂志,2011,47(3):26-27.

[3] 曹玉璞, 叶元康.支原体与支原体病[M].北京:人民卫生出版社,2000:151-162.

[4] Hernandez L,Lopez J,St-Jacques M,et al.Mycoplasma mycoides subsp.capri associated with goat respiratory disease and high flock mortality[J].Can Vet J,2006,47(4):366-369.

[5] 汪代华,徐刚毅.山羊传染性胸膜肺炎的流行现状和防制技术[J].四川畜牧兽医,2005,32(10):48-49.

[6] 万一元,龙鳖,万晴姣,等.贵州山羊传染性胸膜肺炎病原的分离鉴定[J].中国草食动物,2001,3(4):44-46.

[7] 张双翔,周碧君,姜汉雯,等.山羊传染性胸膜肺炎继发大肠埃希氏菌感染的诊断[J].贵州农业科学,2011,39(6):144-146.

[8] 杨光,李忠全,崔玉林,等.贵州白山羊传染性胸膜肺炎流行病学调查报告[J].草业与畜牧,2012,204(11):46-49.

[9] Remick D G,Call D R,Ebong S J,et al.Combination immunotherapy with soluble tumor necrosis factor receptors plus interleukin 1 receptor antagonist decreases sepsis mortality[J].Crit Care Med,2001,29(3):473-481.

[10] Hilliard B,Samoilova E B,Liu T S,et al.Experimental autoimmune encephalomyelitis in NF-kappa B-deficient mice:Roles of NF-kappa B in the activation and differentiation of autoreactive T cells[J].J Immunol,1999, 163(5):2937-2943.

[11] Tak P P,Firestein G S.NF-kappa B:A key role in inflammatory diseases[J].Clin Invest,2001,107(1):7-11.

[12] Roman-Blas J A,Jimenez S A.NF-kappa B as a potential therapeutic target in osteoarthritis and rheumatoid arthritis[J].Osteoarthritis Cartilage,2006,14(9):839-848.

[13] Carayol N,Campbell A,Vachier I,et al.Modulation of cadherin and catenins expression by tumor necrosis factor-alpha and dexamethasone in human bronchial epithelial cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2002,26(3):341-347.

[14] 薛頔.MO感染ALI绵羊支气管上皮细胞过程中MyD88依赖TLR信号调节与ROS诱导细胞凋亡的研究[D].银川:宁夏大学, 2016.

[15] Dusilová-Sulková ánek R, Vávrová J,et al.Low-dose cholecalciferol supplementation and dual vitamin D therapy in haemodialysis patients[J].Int Urol Nephrol,2015,47(1):169-176.

[16] Marani M,Tenev T,Hancock D,et al.Identification of novelisoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis [J].Mol Ceil Biol,2002,22(11):3577-3589.

[17] 毛德文,陈月桥,王丽,等.Caspase-8及Caspase-3与细胞凋亡[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(10):148-150.

[18] 曾明,丁媛媛,王金萍,等.可舒胶囊对酒精性肝损伤小鼠肝组织Caspase-3与Caspase-8活性的影响[J].中国医药导报,2013,10(27):22-24.

[19] 赵进军,吕志平,张绪富,等.保肝宁对急性肝细胞损伤过程中核转录因子-κB的影响[J].中医杂志,2004,45(6):457-458.

[20] 赵宏伟,唐罗生,游志鹏,等.PDTC对过氧化氢诱导鼠晶状体上皮细胞NF-κB活化表达的影响[J].眼科新进展,2004,24(1):26-29.

[21] Weldearegay Y B,Pich A, Schieck E,et al.Proteomic characterization of pleural effusion, a specific host niche of Mycoplasma mycoides subsp.mycoides from cattle with contagious bovine pleuropneumonia (CBPP)[J].J Proteomics,2016,10(131):93-103.

[22] Bin L,Luping D,Bing S,et al.Transcription analysis of the porcine alveolar macrophage response to Mycoplasma hyopneumoniae[J].PLoS One,2014,9(8):e101968.

[23] Xu X,Zhang H,Song Y,et al.Strain-dependent induction of neutrophil histamine production and cell death by Pseudomonas aeruginosa[J].J Leukoc Biol,2012,91(2):275-84.

[24] Mitsunari M,Yoshida S,Shoji T,et al.Macrophage-activating lipopeptide-2 induces cyclooxygenase-2 and prostaglandin E(2) via toll-like receptor 2 in human placental trophoblast cells[J].J Reprod Immunol, 2006,72(1/2):46-59.

[25] Bai F,Ni B,Liu M,et al.Mycoplasma hyopneumoniae-derived lipid-associated membrane proteins induce inflammation and apoptosis in porcine peripheral blood mononuclear cells in vitro[J].Vet Microbiol,2015,175(1):58-67.