目前，产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)仍然是引起人和动物腹泻的主要细菌性病原[1-2]。ETEC引起的腹泻每年造成30万～50万人死亡，同样也给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。ETEC引起腹泻的毒力因子主要包括黏附素和肠毒素。其中，肠毒素包括热稳定肠毒素(Heat-stable toxin，STa)和热敏肠毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)。ETEC菌株首先在粘附素介导下，粘附宿主小肠上皮细胞，定植于宿主小肠表面。然后通过分泌毒素，破坏宿主小肠上皮细胞内电解质平衡，从而引起腹泻[3]。疫苗被认为是预防ETEC引起腹泻最有效的方法，绝大多数ETEC疫苗抗原仅仅集中于粘附定植因子或LT，不能起到完全的保护效果。

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STa毒素是ETEC产生的一种主要肠毒素，是仅含有18个(猪源)或19个氨基酸(人源)的短肽，对儿童和幼龄动物均具有较强的毒性作用。流行病学调查发现，与腹泻相关的ETEC分离株中，超过60%的菌株均携带有STa基因[4-5]。因此，有效的ETEC疫苗，除了包含黏附素和LT外，还必须能诱导机体产生中和STa毒性的抗体。但是STa多肽本身免疫原性差，只有与载体蛋白偶联，才能够被机体识别并产生免疫应答[6-8]。鉴于此，本研究利用基因工程方法，将人源STa基因与优化后的鸡ovalbumin基因嵌合后融合表达，以期获得具有免疫原性的3×STa-ovalbumin融合蛋白，旨在为ETEC疫苗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及试剂

E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)和pET-28a质粒均由渭南职业技术学院微生物实验室保存。IPTG购于美国Sigma公司，IRDye标记的羊抗兔IgG购于美国NE公司，细菌蛋白质提取液购于美国Thermo Fisher公司，蛋白质复性试剂盒购于美国Novagen公司，STa阳性血清(兔源)由美国堪萨斯州立大学Ronald教授馈赠。

1.2 3×STa-ovalbumin融合基因的构建

首先截断鸡ovalbumin基因的内含子，然后优化其在E.coli中的表达密码子。3个拷贝的人源STa基因利用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)分别嵌合至优化后的鸡ovalbumin基因的N端、C端和中部。其中，第1个拷贝的STa基因通过GPVD接头连接于ovalbumin基因的5′端，第2个拷贝的STa基因位于ovalbumin基因的第191～192个氨基酸之间，而第3个拷贝的STa基因通过GPVD接头连接于ovalbumin基因的3′端(图1)。

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图1 3×STa-ovalbumin融合蛋白结构

1.3 3×STa-ovalbumin的原核表达与鉴定

采用间接ELISA方法对各组小鼠血清中抗STa特异性IgG抗体水平进行测定，结果表明，融合蛋白免疫组每只小鼠均能诱导产生高水平的抗STa抗体，抗体滴度平均达到了2.33；而对照组小鼠均无抗STa特异性抗体产生(图3)。

1.4 小鼠免疫试验

血清体外中和试验参照Ruan等[9]的方法进行操作。先取免疫组和对照组的血清各30 μL，预先与2 ng纯化的STa毒素于室温孵育30 min，然后混合加入24孔细胞培养板中已经长满的T-84细胞中，继续在CO2细胞培养箱孵育1 h。去除上清，PBS洗涤3次后，细胞用0.1 mol/L HCl+0.05% Triton X-100裂解。离心收集细胞上清，细胞内环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)浓度根据EIA cGMP试剂盒(Enzo Life公司，美国)说明书测定。以加入2 ng STa毒素的孔作为阳性对照孔；而只加入细胞培养基的孔作为T-84细胞内cGMP的基准浓度孔。

1.5 免疫血清抗体滴度检测

缺陷分析时需要计算一些分析指标，使分析结果得到定量描述，以便进行直观地对比。度量分析指标能够为定量分析缺陷提供基础。对软件产品发布后缺陷分析而言，分析指标主要包括：

待放蓓蕾的形成非一日之寒，转化教育工作更不会得之朝夕。出现反复是正常的。只要我们沉住气，以更高的热情，更执着的爱心去面对，耐心疏导，不怕反复，坚持到底，就没有熔化不了的钢板；只要我们园丁再付出一些努力，就没有催不开的秋冬蓓蕾。

1.6 体外毒素中和试验

为验证3×STa-ovalbumin融合蛋白的免疫原性和结构完整性，将12只8周龄的BALB/c雌性小鼠随机分为试验组和对照组。试验组注射：表达融合蛋白(50 μg)+2 μg 热敏肠毒素双突变体(Double mutant heat-labile enterotoxin,dmLT)佐剂；对照组注射：PBS(50 μL)+2 μg dmLT佐剂。采用皮下多点注射方式进行首次免疫。随后每隔2周用相同的剂量进行第2次免疫和第3次免疫。第3次免疫后14 d，CO2处死小鼠，心脏取血，分离血清，保存于-20 ℃待用。

1.7 数据处理

3×STa-ovalbumin融合蛋白经IPTG诱导表达后，主要以包涵体的形式存在。通过包涵体洗涤的方法对目的蛋白进行纯化，得到纯度超过90%的融合蛋白。用12%SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白分子质量约为42 ku，与预期的大小一致(图2)。用STa阳性血清通过Western blot检查融合蛋白的反应原性，结果表明，特异性的目的条带能够被STa阳性血清识别(图2)，说明融合蛋白具有良好的反应原性。

2 结果与分析

2.1 3×STa-ovalbumin融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析结果

试验数据以平均值±标准差表示，采用Student’s t-test软件进行处理。

  

M.蛋白质Marker; 1.SDS-PAGE融合蛋白条带；2.Western blot融合蛋白条带

 

图2 3×STa-ovalbumin融合蛋白的表达

2.2 免疫血清STa抗体滴度检测

将3×STa-ovalbumin嵌合基因克隆至表达载体pET-28a，构建重组质粒pET28a-3×STa-ovalbumin，然后转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，次日挑取单个菌落于37 ℃过夜培养，取2 mL过夜培养的菌液接种于200 mL含卡那霉素的YT培养基中，培养至OD600 nm达到0.5时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG继续诱导4 h。收集的菌体根据细菌蛋白质提取液说明书进行提取，蛋白质复性根据Novagen蛋白质复性试剂盒说明书进行具体操作。纯化后的融合蛋白进行12%SDS-PAGE电泳分析；以STa阳性血清(兔源)为一抗(1∶3 000)，IRDye标记的羊抗兔IgG(1∶10 000)为二抗进行Western blot分析。

采用间接酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测免疫血清中STa抗体的滴度。以3×STa-ovalbumin化学偶联物作为包被抗原，包被剂量为10 ng/孔；倍比稀释的待检血清为一抗，1∶3 300倍稀释的羊抗鼠HRP-IgG二抗(Sigma公司，美国)为二抗。TMB显色后，光密度(OD)采用微孔过氧化物酶底物2-C系统(KPL公司，美国)于650 nm波长处测定。以待测血清OD值减去空白对照OD值大于0.3的最高稀释倍数(OD×稀释倍数)计算免疫血清抗体滴度，以lg值表示。同时以对照组血清作为阴性对照。

  

图3 小鼠血清STa抗体滴度

2.3 STa抗体体外中和作用

体外毒素中和试验表明(表1)，来源于免疫组的血清能在体外中和STa毒素的毒性作用。2 ng STa阳性对照组和2 ng STa+对照血清组中cGMP浓度分别为50.05 pmol/mL和45.95 pmol/mL，而2 ng STa+免疫血清组中cGMP浓度显著降低，为13.76 pmol/mL。

 

表1 体外免疫血清对毒素的中和作用

  

组别cGMP浓度/(pmol/mL)培养基0.94±0.162 ng STa 毒素50.05±1.23对照小鼠血清组45.95±1.77免疫小鼠血清组13.76±0.86∗∗

注：**表示与对照组差异极显著(P<0.01)。

3 结论与讨论

疫苗是预防ETEC感染最有效和最经济的策略，但是至今仍无有效的商品疫苗。目前，ETEC疫苗的研发仍面临着诸多技术挑战[10]。首先是不同ETEC菌株表达的毒力因子(黏附素和毒素)的异质性，造成相互之间缺乏交叉保护力。其次是由于LT和STa的毒性作用，不能直接作为疫苗抗原。此外，STa毒素本身的免疫原性差，机体不能诱导针对STa毒素的抗体，从而对产生STa毒素的ETEC菌株的感染缺乏有效的保护。STa毒力因子在ETEC分离菌株中普遍存在[4-5]，由此推测，一种具有广泛保护力且有效的ETEC疫苗必须能诱导产生针对STa毒素的中和抗体。

STa多肽本身免疫原性差，只有与具有强免疫原性的载体蛋白融合或化学偶联后才能获得免疫原性[6-8]。但是STa的抗原性和毒性在与载体遗传融合或化学偶联的过程可能发生改变，而这是诱导产生中和STa毒素毒性作用抗体所需要的。本研究中，将3个拷贝的STa基因和优化的鸡ovalbumin基因嵌合后表达的融合蛋白免疫小鼠，能够诱导机体产生高水平的抗STa特异性的中和抗体，并且产生的抗STa抗体在体外具有中和STa毒素毒性的效果。这表明当人源的STa毒素与强免疫原性的载体鸡ovalbumin蛋白融合后，获得了免疫原性，并且STa本身的结构并没有发生改变。融合蛋白的稳定性以及蛋白质结构等理化性质有待进一步的研究。

综上所述，构建的3×STa-ovalbumin融合蛋白能够通过E.coli原核表达系统高效表达，具有良好的免疫原性和反应原性，免疫后能够诱导小鼠产生高水平的抗STa特异性的中和抗体，可以作为ETEC疫苗的候选抗原进行深入研究。

参考文献:

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[2] Duan Q D,Yao F H,Zhu G Q.Major virulence factors of enterotoxigenic Escherichia coli in pigs[J].Ann Microbiol,2012,62:7-14.

[3] Nataro J P,Kaper J B.Diarrheagenic Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev,1998,11(1):142-201.

[4] Zhang W P,Zhao M,Ruesch L,et al.Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US[J].Vet Microbiol,2007,123:145-152.

[5] Wolf M K.Occurrence,distribution and associations of O and H serogroups,colonization factor antigens and toxins of enterotoxigenic Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev,1997,10:569-584.

[6] Zhang W,Zhang C,Francis D H,et al.Genetic fusions of heat-labile (LT) and heat-stable (ST) toxoids of porcine enterotoxigenic Escherichia coli elicit neutralizing anti-LT and anti-STa antibodies[J].Infect Immun,2010,78(1):316-325.

[7] 郭乐，刘昆梅，李敏，等.产肠毒素大肠杆菌亚单位疫苗3STa～M(G)-K99和3STa～M(S)-K99的纯化及其免疫学性质的研究[J].中国生物工程杂志，2013，33(7):18-24.

[8] Liu W X,Yuan C W,Bao J,et al.Generation of an attenuated strain oral vaccine candidate using a novel double selection platform in Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(2):855-867.

[9] Ruan X,Robertson D C,Nataro J P,et al.Characterization of heat-stable (STa) toxoids of enterotoxigenic Escherichia coli fused to a double mutant heat-labile toxin peptide in inducing neutralizing anti-STa antibodies[J].Infect Immun,2014,82:1823-1832.

[10] Zhang W P,Sack D A.Current progress in developing subunit vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) associated diarrhea[J].Clin Vaccine Immunol,2015,22(9):983-991.