支气管哮喘(哮喘)是一种影响到全球所有年龄组的严重疾病[1]，其以气道高反应性为主要表现的变态反应性疾病，可能存在Th2细胞活化亢进的免疫学异常、辅助性T细胞(Th)亚群功能失衡，近年发现Th17细胞及调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)在支气管哮喘的发病中也占重要地位。哮喘特异性免疫治疗(allergen-SIT)是目前唯一针对其病因的有效的预防、治疗手段[2]，SIT治疗是可以改变过敏性疾病病程的主要方法之一[3]。目前认为，SIT哮喘治疗的主要机制可能是诱导机体外周抗原特异性免疫耐受的形成[4]。Th17细胞在哮喘的呼吸道炎症中发挥着极其重要作用，IL-23在Th17细胞增殖和稳定中起着重要作用，有研究已证实IL-23/Th17轴在支气管哮喘的发病中起着重要作用[5-7]。由此我们推测，在SIT治疗免疫应答过程中，DC摄取抗原并提呈信号给T淋巴细胞，导致IL-23/Th17轴变化参与了SIT免疫治疗的过程，而且这一过程与SIT治疗效率相关，由于口服耐受与皮下特异性免疫治疗(SCIT)的免疫应答场所、应答细胞及免疫应答过程均可能不同，而SCIT是目前临床上应用最广泛，最主要的免疫疗法[8-9]。为进一步研究SIT的机制，我们建立大剂量卵白蛋白(ovalbumin,OVA)皮下注射建立SCIT治疗哮喘模型，通过检测气道高反应性(AHR)、气道炎症及血清IgE水平等情况，证实建立免疫治疗模型成功，并发现在免疫治疗组中，Treg细胞比例明显增高，IL-23表达水平降低，而Th17细胞比例明显降低，这为通过调控IL-23/Th17细胞途径的分化来增强SIT治疗效果提供了新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 18只清洁级BALB/c雌性小鼠，6～8周龄，质量16～20 g，由北京华阜康生物科技有限公司提供，采用随机数字法分成3组：哮喘免疫治疗组、哮喘对照组、空白对照组3组，每组6只。

第三种情况是以“合法权益”代替正当利益。《私募投资基金监督管理暂行办法》《网络借贷信息中介机构业务活动管理暂行办法》都把保护融资主体“合法权益”作为目标，但“合法权益”与正当利益不是一个概念。正当利益是只要不违背法律禁止性规定即可拥有的利益，而合法权益必须得到法律确认，前者范围远大于后者。我国民间融资立法缺失，“法”的形式多为监管者制定的政策法规，正当利益实际变为政府认可才能拥有的利益。正因为正当利益不是协调双方行为动机的均衡点，监管者的保护职责异化，融资者正当利益成为监管者任意取舍的对象，导致双方行为动机非理性现象。

1.1.2 主要试剂及设备 由美国Sigma公司提供鸡卵白蛋白；Mouse Th2 Cell Multi-Color Flow Cytometry Kit、氢氧化铝[Al(OH)3]由美国R&D公司Catalog Number：FMC012提供；Flow XTM Mouse Regulatory TCell Multi-Color Flow Cytometry Kit由美国R&D公司Catalog Number：FMC022；德国百瑞 Pari-Master雾化器，可以雾化颗粒直径大小为0.5～0.5 μm；美国宝特公司的标准酶标仪；德林诊断产品有限公司的自动平衡离心机；日本Olympus公司的光学显微镜；流式细胞仪购自美国BectonDickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 建立哮喘小鼠免疫治疗模型 哮喘小鼠免疫模型建立按文献[10]进行(图1)。哮喘免疫治疗组在0、7 d予溶于100 μL无菌生理盐水的OVA 10 μg+Al(OH)3 2.25 mg混合液，予腹腔注射致敏BALB/c小鼠，予大剂量OVA(V级)皮下注射[含1 mg OVA+Al(OH)3 2 mg的生理盐水200 μL]21～27 d持续7 d(注：预实验中小鼠对1 mg OVA可完全耐受，无严重或致死性过敏反应发生，故用1 mg OVA行皮下免疫治疗)；在35～41 d采用1% OVA雾化激发。10% OVA在50 d加强激发1次。在0、7 d予哮喘对照组OVA 10 μg+Al(OH)3 2.25 mg溶于100 μL无菌性生理盐水混合液，采取腹腔注射致敏BALB/c小鼠，21～27 d给予等量生理盐水皮下注射，35～41 d予1% OVA雾化激发，50 d予10% OVA加强激发1次。空白对照组予等量生理盐水和生理盐水雾化激发、加强激发。所有动物在末次激发后观察活体反应及气道反应性24 h后并于50 d处死、解剖。

1.2.3 BALF细胞计数及肺部组织学分析 末次激发各组小鼠24 h后，麻醉采用腹腔注射1.5%戊巴比妥钠，摘除各组小鼠眼球放血收集血清，保存在-80 ℃待检。采取颈椎脱位处死，然后暴露颈部，插入静脉留置针并分离各小鼠气管，注入1 mL PBS至灌洗区，然后反复灌洗5次后，抽吸各组小鼠的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)逐一注入离心管中计量(回吸率在80%为合格)，4 ℃、1 500 r/min离心10 min后，收集好上清液保存到-80 ℃备用。沉淀细胞重悬后用计数板计数细胞。剩余细胞涂片，HE染色，在光学显微镜下进行各种细胞分类计数。将处死的小鼠开胸取出肺组织盛入4%多聚甲醛瓶中固定，酒精脱水，石蜡包埋、切片，HE染色，采用显微镜观察小鼠肺组织中的支气管及其细支气管的周围炎症、支气管血管周围的炎症、肺泡周围组织炎症的病理特点。

1.2.2 检测气道反应性 末次激发各组小鼠后检测24 h内气道反应性，检测小鼠自主呼吸在小鼠清醒状态下采取体积描述法，然后待检测的小鼠以倍增质量浓度(3.125、12.5、50 ng/mL)的乙酰胆碱(Ach)雾化3 min，然后休息2 min，连续记录读数5 min并取各组数据平均值，气道高反应性水平均以相应Ach浓度激发下的增强呼吸间歇(enhanced pause，Penh)值来反映，Penh：PEP/PIP×pause。

总而言之，地表覆盖和施肥的处理方式能够有效改善陕北土壤质量和环境，对于陕北枣树生长、提高枣树果实产量和品质均具有积极的作用和影响，值得推广和利用，但是需要在科学的指导下结合土壤现实和气候环境进行科学的配比，切忌“一刀切”，如此才能最大限度的保障枣农的利益，助推陕北经济的发展。

这个简单标准在家就可以很容易进行判断。自己可以买个听诊器，网上有听诊的教学视频，很简单，干罗音湿罗音之类的异常音很容易分辨，感冒咳嗽了及时听听，发现异常及时去医院。

  

图1 哮喘免疫治疗模型的建立

1.2.4 ELISA 血清OVA特异性IgE检测；BALF中IL-5、IFN-γ、IL-10检测(检测参照试剂盒说明书进行)。

支气管哮喘是辅助性T细胞(T helper cell，Th cell)调节的气道慢性炎症性疾病，Th1/Th2的失衡曾被认为是哮喘的发病机制。目前认为，除Th1/Th2的失衡外，其他的免疫学原理在解释控制哮喘及过敏的发病中具有非常重要的价值，其中通过外周抗原诱导机体特异性免疫耐受形成的机制，这个免疫机制可能是支气管哮喘特异性SIT免疫治疗的比较重要机制之一，但至今其机理未完全阐明。

50 d处死小鼠，取各组小鼠剩余肺组织标本q-PCR检测Foxp3、RORγt表达水平。结果表明，在Th17及Treg细胞关键转录因子水平发现，免疫治疗组肺组织CD4+RORγt+T细胞及CD4+Foxp3+T细胞与哮喘对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

1.3 统计学分析

血清IL-23和脾的Th17细胞百分率呈正相关(n=18，r=0.908，P<0.05);血清IL-23和肺Th17细胞百分率呈正相关(n=18，r=0.922，P<0.05)。大剂量OVA免疫治疗引起的Th17细胞下降伴随IL-23表达的降低。这与在支气管哮喘的免疫发病机制的研究中发现其中IL-23/Th17轴起重要作用的相关研究相一致。已有临床研究证实，收集到的支气管哮喘患者的肺泡灌洗液、痰液或血清液中，Th17细胞及其细胞因子均明显升高，以及Th17细胞的数量及IL-17A的表达水平与呼吸道高反应性及疾病的严重程度呈正相关[12]。

2 结果

2.1 大剂量OVA SCIT免疫治疗抑制致敏哮喘小鼠气道高反应性

在50 d末次激发后24 h内检测呼吸道反应性，先于清醒状态测定各组小鼠基础Penh值，随之采用不同Ach浓度激发，分别记录在质量浓度为3.125、12.5、25 ng/mL时对应的Penh值，然后雾化3 min，休息2 min，连续记录5 min，将所得各组数值取其平均值。各组实验小鼠随吸入Ach浓度的逐渐增加，各自的气道反应性也逐渐增高，但是各组气道反应性增加的幅度比不相同，Ach的浓度从3.125 ng/mL开始升至25 ng/mL，哮喘对照组较哮喘免疫治疗组的气道反应性明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

媳妇缓过点神来。但脸还蜡黄着，嘘嘘地喘着气。哥们儿朝洛蒙想媳妇在老家是个有名的假小伙子。媳妇身体壮硕，冒冒失失，天不怕地不怕。春天敢独自一人爬悬崖捋榆钱儿，夏天敢一个人驾着犟牛去山坡种荞麦（那可是顶死过人的公牛呵！），现在却被城里小小的虫子吓倒了！他下地把媳妇扶起来，替她掸掉身上的土。

  

*:与其他两组比较，P<0.05

图2 各组小鼠吸入不同浓度乙酰胆碱时呼吸道反应性的变化

2.2 大剂量皮下OVA SCIT哮喘免疫治疗减轻气道炎症反应

大剂量皮下OVA免疫治疗减轻肺组织炎症细胞浸润。相比空白对照组，哮喘小鼠组见肺组织各支气管下，血管周围明显出现炎症改变，肺泡管腔内及肺间质可见嗜酸性粒细胞，支气管的管腔内可见较多黏液栓，可见较多炎性细胞浸润，血管壁水肿充血，上皮细胞明显脱落坏死；哮喘小鼠免疫治疗组较哮喘对照组的炎症反应明显减轻(图3)。结果表明，SIT治疗针对轻中度哮喘早期治疗，可以避免朝重度哮喘发展。并且可减轻气道重塑。

表1 各组小鼠BALF中细胞总数及炎症细胞计数(n=6，×106ng/mL)

  

组别 细胞总数嗜酸性粒细胞淋巴细胞中性粒细胞空白对照组75.83±8.21∗26.00±5.22∗35.67±4.41∗5.67±1.97∗哮喘对照组207.33±15.6369.17±11.02106.17±7.3132.33±3.61免疫治疗组128.17±11.48∗40.00±3.90∗55.67±5.24∗11.50±1.87∗

*:与哮喘对照组比较，P<0.05

大剂量OVA SCIT免疫治疗降低BALF中炎症细胞数。50 d收集各组实验小鼠的BALF，离心，重悬细胞，计数细胞总数及HE染色计数细胞分类数量。与哮喘对照组比较，空白对照组细胞总数及嗜酸性粒细胞计数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；免疫治疗组中BALF的细胞总数，嗜酸性细胞(EC)及淋巴细胞(LC)较哮喘对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中性粒细胞计数较哮喘对照组差异有统计学意义，见表1。

  

a：空白对照组；b：哮喘对照组；c：免疫治疗组

 

图3 各组小鼠肺组织病理变化(HE染色)

2.3 大剂量OVA SCIT免疫治疗降低血清OVA特异性IgE及调节BALF炎症因子分泌

50 d处死各组小鼠，取每组小鼠BALF及外周血标本，进行检测BALF中IL-5、IFN-γ、IL-10及血清OVA特异性IgE浓度(按试剂盒说明进行)。结果显示，空白对照组与哮喘对照组相比较，BALF中的IL-10浓度升高，而IL-5浓度降低，血清OVA特异性IgE浓度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；哮喘对照组与哮喘免疫治疗组比较：BALF中IL-10浓度降低，而IL-17A、IL-5、IL-6及血清OVA特异性IgE浓度均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。INF-γ在哮喘对照组与哮喘免疫治疗组差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。本研究发现IL-10、IL-17A均有改变，说明Treg、Th17参与SIT免疫机制。

表2 各组小鼠BALF中细胞因子及血清OVA特异性IgE浓度(n=6)

  

组别空白对照组哮喘对照组免疫治疗组IL-5(pg/mL)19.23±3.27∗516.28±21.1874.71±6.13∗INF-γ(pg/mL)98.55±17.63∗202.33±12.66180.73±28.98∗IL-10(pg/mL)155.17±8.75∗80.67±34.55230.50±9.44∗IgE(×103ng/mL)156.72±11.14∗711.16±33.95422.00±6.60∗IL-17A(pg/mL)20.37±4.02∗95.10±2.9035.02±5.00∗IL-6(pg/mL)8.92±1.80∗39.62±2.8617.89±1.88∗IL-23(pg/mL)1.920±0.202.868±0.122.618±0.12

*:与哮喘对照组比较，P<0.05

2.4 大剂量OVA SCIT免疫治疗改变肺组织及脾Th17及Treg 细胞比例

50 d处死小鼠后，取出各组小鼠脾组织及肺组织进行流式细胞仪检测Treg占Th17细胞的百分率，检测结果示哮喘免疫治疗组Treg/Th17细胞百分率明显高于哮喘对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5 免疫治疗大剂量OVA调节肺组织Th17和Treg转录因子的表达

1.2.6 q-PCR检测肺组织转录因子 用q-PCR技术检测剩余肺组织中Foxp3、RORγt表达水平。采用RNAzol试剂Trizol法提取肺组织总RNA，根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA，反转录使用using oligo (dT18)引物，q-PCR用Quanti Fast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN，Germany)、ABI Step One Plus System (Applied Biosystems，USA)。反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，扩增40个循环；95 ℃变性5 s，65 ℃延伸60 s，97 ℃酶瞬间灭活；40 ℃冷却10 s。数据用2-△△Ct法分析基因表达相对定量，使用β-actin作为内参照，最后用基因表达与内参照的比值表示。引物序列如下：Foxp3 5’-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3’；5’-GGCATGGGCATCCACAGT-3’ RORγt 5’-TGCGACTGGAGGACCTTCTA-3’；5’-TCACCTCCTCCCGTGAAAAG-3’ β-actin 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’

表3 q-PCR检测各组小鼠肺组织Th17和Treg转录因子的表达(n=6)

  

组别 mRNA Foxp3+/β-actinmRNA RORγt+/β-actin空白对照组5.95±0.23∗0.46±0.04∗哮喘对照组2.18±0.073.06±0.09免疫治疗组3.18±0.08∗1.75±0.14∗

*:与哮喘对照组比较，P<0.05

2.6 相关性分析

所得计量资料采用均数±标准差表示，用SPSS 13.0统计软件行分析。多组间的样本量采用单因素方差分析，两组间样本比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

 

a:脾流式细胞仪检测结果;b:脾Treg和Th17细胞数;c:脾Treg/Th17比值;d:肺流式细胞仪检测结果;e:肺Treg和Th17细胞数;f:肺Treg/Th17比值 *：与哮喘对照组Treg细胞数比较，P<0.05；#：与哮喘组Th17细胞数比较，P<0.05

图4 流式细胞仪检测各组小鼠肺及脾组织Treg及Th17细胞比例

3 讨论

1.2.5 流式细胞技术检测脾、肺组织Treg、Th17细胞比例 根据文献[11]，无菌取小鼠脾，捣碎，于40 μm金属网过滤，收集细胞用冷RPMI-1640洗涤细胞2次，加入红细胞裂解液，离心500 g 2 min，去上清液，用含10%FBS的RPMI-1640培养液混匀，在37 ℃、5%CO2下培养满12 h后，离心去除上清，加入含10%FBS的RPMI-1640 培养液后，按使用说明加入FITC标记的抗小鼠CD4抗体，然后固定、加入打孔剂，分别加入Foxp3-PE和RORγt-PE的抗体，随后用FACS检测。取用于观察肺组织学检测的剩余肺叶组织，机械捣碎，用3 mgU/mL胶原酶(collagenase D)37 ℃，消化2 h，将消化的肺组织用RPMI 1640培养液重悬，用70 μm尼龙筛过滤细胞后用红细胞裂解液去除红细胞，37 ℃、5%CO2的环境中培养满12 h后，离心后去上清液，先后加入含10%FBS的RPMI-1640培养液及FITC标记后的抗小鼠CD4抗体，然后固定、加入打孔剂，分别加入PE标记抗鼠Foxp3抗体及PE标记的抗鼠IL-17抗体，之后用FACS检测。用PBMC 1×106个，2 mL Flow Cytometry Staining Buffer洗细胞1次，在blocking IgG避光4 ℃孵育10 min后阻断细胞，各管细胞中加入10 μL CD4-FITC、10 μL CD25-APC antibodies或同型对照的对应的避光4 ℃孵育30 min。采用预冷的1×PBS洗涤细胞2次，在1×FoxP3 Fixation Buffer细胞重悬4 ℃孵育30 min。采用预冷的1×FoxP3 Permeabilization and Wash Buffer洗涤细胞2次，然后各管细胞加入10 μL FoxP3 antibody或rabbit IgG-PE isotype 4 ℃孵育30 min。用预冷的1×FoxP3 Permeabilization and wash Buffer反复洗涤细胞2次，最后予流式细胞仪检测。

海域油气作为陆上常规油气的接替，成为最现实的油气开发新领域。据统计，2000年以来，全球年度勘探新增储量中，海域占比均大于50%，且有逐年增大的趋势。2016年，全球勘探新增储量中，海域油气占比高达86.3%。海域油气产量当量从2007年的19.51亿吨增长到2017年的22.24亿吨，占全球油气当量总产量的28.33%。

其中CD4+调节性T(Th)细胞在哮喘中扮演着重要的角色，Th17细胞是新近在CD4+T(Th)细胞中的一个新发现的亚群，Th17细胞主要分泌IL-17A，通过刺激气道上皮细胞和炎性细胞，导致机体释放各种炎症介质参与支气管哮喘气道炎症反应[12-14]。临床研究中发现，收集到的支气管哮喘患者的外周血液中的单核细胞内，Th17细胞及其受体CCR6数量均有明显升高，IL-23通过作用于这些激活状态的Th17细胞从而促使支气管哮喘患者症状加重[15]。已证实，Th17细胞参与介导气道中性粒细胞炎症过程并与哮喘严重程度相关，此外也与哮喘的嗜酸性粒细胞密切相关[16-17]。在气道炎症模型中已得到证实，IL-17皮下注射可使口服致耐受治疗缓解的气道炎症加重[18]。

IL-23是IL-12细胞因子家族的一个新成员，IL-23不参加初始T淋巴细胞的分化，是Th17 细胞增殖和功能稳定的重要因子[19]，IL-23主要通过参与Thl7细胞分泌IL-17A和IL-17F的过程而导致气道炎症加重[20]。IL-23的主要在Th17细胞的稳态及扩增上起作用，同时主要参与到Th17细胞的中性粒细胞性气道的炎症，同时可促进以Th2细胞为主的嗜酸性粒细胞呼吸道炎症[21]。有研究指出，支气管哮喘患者体内的IL-23对Th17细胞的活化以及记忆性Th17细胞的产生起到极其关键作用[22-23]，据此有学者推测在支气管哮喘和重度支气管哮喘(severe bronchial asthma，SBA)中Thl7细胞的活化以及IL-23/Th17轴参与了疾病的发生和发展。

本研究中哮喘小鼠血清中IL-23 、IL-17A浓度均高于哮喘小鼠免疫治疗组，这与国内外研究结果基本相一致。另外有研究发现，哮喘患者血清中IL-23水平升高，故哮喘免疫治疗可能是通过抑制IL-23/Th17 轴及Th17细胞活化而达到控制支气管哮喘。近年来，大量临床资料表明，哮喘特异性免疫治疗的主要机制很有可能是通过有效降低哮喘患者的呼吸道的反应性，从而逐渐减少相关治疗药物的剂量[9]。目前经气道雾化吸入糖皮质激素是支气管哮喘的主要治疗方式，但吸入激素目前不能完全治愈某些重度支气管哮喘，只是部分控制哮喘的症状。目前认为，哮喘的免疫治疗是针对哮喘的病因治疗之一，哮喘免疫治疗模型国内外均有相应报道，我们根据不同的哮喘小鼠的免疫功能状态，本研究以通过大剂量OVA皮下注射建立了哮喘小鼠免疫治疗模型，得出了哮喘小鼠免疫治疗是IL-23/Th17轴和Th17细胞的受到抑制的结果。本研究结果显示：小鼠哮喘免疫治疗组大剂量予皮下注射OVA后，哮喘小鼠的呼吸道的反应性、BALF中的嗜酸性粒细胞计数、IL-23、IL-17水平及血清OVA特异性IgE水平明显低于哮喘对照组，Th2细胞因子IL-5百分比明显低于哮喘组；流式细胞技术检测发现外周血Treg/Th17细胞百分比明显高于哮喘对照组，说明IL-23、Th17、Treg细胞参与SIT免疫机制，通过对肺、脾解剖，发现肺组织及脾组织发现CD4+FOXP3+Treg及Th17细胞有差异，且脾及肺的Th17细胞都与血清IL-23呈正相关，其哮喘免疫治疗作用机制可能是通过抑制IL-23/Th17细胞途径而发挥作用。在本研究中哮喘小鼠的血清中IL-23、IL-17A的浓度均高于免疫治疗组，这与国内外结果研究基本一致。Li等[21]在OVA哮喘免疫治疗中发现，沉默的IL-23基因以降低哮喘患者IL-17A进而减轻呼吸道的炎症。与目前的一些临床研究发现一致，支气管哮喘患者的IL-23血清水平是明显升高的[24-25]。

综上所述，本实验研究显示腹部皮下大剂量OVA注射建立了哮喘小鼠免疫治疗模型，结果发现CD4+FOXP3+Treg及IL-10、IL-23，IL-17A参与哮喘小鼠免疫耐受的形成。但目前对CD4+T细胞亚群与IL-23/Th17轴间的调节机制，Th2细胞与IL-23/Th17轴在由变应原诱导的慢性炎症中起主导作用的是哪一种细胞，Th2 细胞免疫反应由IL-23如何调节、IL-23 能否直接作用于Thl细胞免疫反应从而调控哮喘等[26]，随着哮喘的免疫治疗进一步深入研究，在哮喘的作用机制中，IL-23/Th17轴的研究可能会为研究支气管哮喘的病因及免疫治疗提供新的靶点及方法。

第二层，“会远于候之中，则气为之使；达远于候之外”，“神游气化，而意之所之玄之又玄”。当气息为远所用，自由地流转于琴曲之中，意识在虚空中旋转，流露出了生命的气息。因而，从有限的世界上升到了无限的空间当中。

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