花粉管通道法主要是利用有花植物授粉后形成的花粉管外通道，将外源DNA直接导入胚囊，对还处于融合期没有形成细胞壁的受精卵细胞或者是早期的胚胎细胞进行转化。20世纪70年代，花粉管通道法的创建者——我国著名育种专家周光宇先生在对当时多起远缘杂交成功经验进行总结后，提出了DNA片段杂交假说［1］。该假说认为，当外源DNA通过花粉管进入受体植物的胚囊后会被分解成片段。由于授粉后的胚囊内DNA活动活跃，所以残留的外源DNA片段可能会被当作冈崎片段，从而整合到受体植物的DNA中。

由于花粉管通道法巧妙利用了有花植物的授粉过程，所以其操作简单、技术成本低廉，在分子育种中具有较多优势。主要优点有：（1）利用受体植物的生殖细胞进行外源DNA转化，可以直接获得转化成功的植株，同时也可以直接获得下一代含有外源DNA的种子，免去了进行细胞和原生质体的组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。如果在导入的外源DNA上加入特殊的分子标记，还可以直接对下一代进行多态性检测。（2）可以利用该技术对所有开花植物进行各种外源DNA的转化。由于不须要诱导再生植株，所以特别适用于某些难以诱导再生植株的作物，如小麦、豆类等。（3）受体植株中的生殖细胞在授粉期处于脱分化状态，其细胞核变大、胞质变浓，分裂较为活跃，具备相当的转化感受态和再生感受态，同时细胞壁还未形成，有利于各种形式的外源DNA进入；同时外源DNA的大小也不受限制，甚至可以将某些生物的总DNA全部导入。（4）全部操作比较简单，不需要精密仪器设备，便于在野外或大棚中进行。（5）转化效率高，一般可达1%左右。（6）由于利用了受体植物的生殖细胞，便于目标性状得到稳定的遗传，同时育种时间大大缩短，一般3～4代即可筛选出具有目的性状并可稳定遗传的品系［2－4］。

兰考906是由河南省兰考县品种展示中心选育而成的优秀小麦品种［5］，属半冬性中晚熟品种。本研究以兰考906为基础研究材料，尝试通过远缘杂交育种将辣椒的总DNA导入其中，从而提高小麦的维生素C和蛋白质含量，力求获得产量高、品质佳的小麦新品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

洛椒9号、受体小麦T0代（兰考906）由洛阳市农业科学研究所提供。本研究于2015年4月在洛阳市农业科学研究所试验田对T0代小麦（兰考906）进行辣椒总DNA导入，收获种子播种后获得变异体小麦T1代。

建国以来，中国农药工业经过艰苦拼搏，开拓进取，从无到有，从小到大，历经了初创、调整、发展三个阶段，走过了波澜壮阔的风雨历程，取得了辉煌成就。特别是改革开放以来，改制、改革，不断创新，经济实力增长迅速，行业内不断涌现出新经验、新成果。尤其是近二十年，中国农药工业突飞猛进，取得持续长足的进步，已形成包括原药生产、制剂加工、科研创新开发和原料中间体配套的较为完整的农用化学品工业体系，为保证我国农业可持续发展、粮食安全和国家稳定作出了巨大的贡献。

1.2 辣椒总DNA提取

将T0代的种子与未经处理的小麦（兰考906，共125粒作为对照组）进行播种，T0代共播种14行，兰考906共播种5行，每行播种25粒，行间距约30 cm。当T1代出芽时，对其出芽率进行统计；当T1代材料受粉5 d左右时，观察其表型性状的变异情况，并记录和统计主要变异类型。

在房建工程施工过程中，钻孔灌注桩技术具备一定的复杂性与隐蔽性，施工人员只有具备良好的专业技术水平才可以正确使用钻孔灌注桩技术，若技术人员的专业水平较差则无法发挥灌注桩技术的效果，甚至还会影响房建工程的正常完工。同时，通过应用钻孔灌注桩技术也可以提高房建工程整体结构的稳定性，在有效控制施工成本的同时提高企业的经济效益水平。对此，施工企业应正确认识钻孔灌注桩技术与房建工程的结构功能，充分了解钻孔灌注桩技术在房建工程中发挥的作用。除此之外，房建施工期间难免会产生一定噪音，但钻孔灌注桩技术施工振动较弱，且噪音较低，不会产生噪音污染，在建筑行业中得到了广泛应用。

1.3 辣椒总DNA质量检测

假设厂商生产一单位出口产品需要一单位劳动和一单位的中间品，每单位中间产品中需要λ单位国外中间品(1-λ)和单位的国内中间品。当λ=0时企业只使用国内中间品，当λ=1时企业只使用进口的国外中间品，当0<λ<1时企业既进口国外中间品又使用本国中间品。企业生产成本函数为如下形式：

1.4 花粉管通道法导入辣椒总DNA

本研究提取的辣椒DNA样品，经过0.8%琼脂糖凝胶电泳，呈现1条大小相同的DNA带，没有RNA污染。其D260 nm／D280 nm为1.71，说明得到的DNA质量较高、纯度好，可以作为遗传转化的材料（图1）。

1.5 T1代种植与观察

当辣椒幼苗生长到3～4张真叶时，将其放在光线较暗处培养2 d左右，目的是减少叶片中的淀粉含量，将暗培养后的植株随机采取足够量的嫩叶，用CTAB法提取总DNA［6］。

据工信部安排，目前已有多家化肥生产企业参与产品追溯体系建设试点。2018年4月19日，全国化肥电子防伪追溯体系服务平台正式上线，已具备企业接入条件。试点的顺利推进及全行业的推广亟需《化肥追溯体系规范》标准作为准则和指导。

2 结果与分析

2.1 辣椒总DNA质量检测结果

将所提辣椒总DNA用1×SSC溶液稀释10倍配成导入液，在受体小麦（兰考906）自花授粉一定时间后（约3 h左右），小麦花药伸出，颜色变黄，将颖壳剪去约1／4，使花柱露出，然后开始导入。每株小麦柱头上滴加20μL辣椒总DNA导入液，快速进行套袋保湿。

取5μL辣椒总DNA试样溶液，琼脂糖凝胶电泳后进行结果观测并拍照［7］。取10μL辣椒总 DNA样品稀释到500μL，采用 UV－2000分光光度计（美国尤尼柯）测定D260 nm／D280 nm，将质量符合要求的辣椒 DNA留存准备进行导入。

 

2.2 T0代结实率

本研究对28株小麦（兰考906）的500个小花进行辣椒总DNA导入，收获347粒种子，结实率69.4%。

2.3 T1代出芽率

对经过花粉管通道法转化的T1代小麦形态进行观察，发现经过辣椒总DNA转化的小麦材料与对照组有较为明显的差异。T1代材料的主要形态变化有畸形穗、畸形旗叶、穗无蜡质、茎上绿斑、黄条斑叶、植株变高、分蘖情况等（图2）。

2.4 T1代变异观察

对T1代小麦出芽率进行观察。经过花粉管通道法转化的347粒种子共出芽194株，出芽率为55.9%。对照组小麦（兰考906）共播种125粒，出芽120株，出芽率96%。

由表1可知，对照材料主要表现为畸形穗、畸形旗叶和不分蘖，穗无蜡质出现的概率也较高。同时，在变异材料中出现了较为少见的植株变高的情况，说明导入引起的表型变异类型较为丰富。材料总变异率为21.3%（部分植株畸形穗和畸形旗叶同时出现，部分不分蘖植株也同时出现了畸形穗和畸形旗叶的性状；所以总变异率略低于各种表型变异率之和），对照材料总变异率为4.0%。

3 讨论与结论

小麦分子育种有基因枪法、农杆菌介导法、低能离子束导入法等方法［8］。花粉管通道法导入辣椒总DNA是在植物整体水平进行的目的基因导入，带有目的基因的DNA片段可能被整合进受体细胞基因中，也可能引起受体细胞基因在分子水平上发生其他改变，进而引起其表型性状的变化［9］。

将1.1中1#、2#、3#断面样品按照1.3方法进行高通量测序，并对分析报告中的细菌和真菌群落结构组分（图1、图2）进行分析。断面群落相对丰度情况见表2、表3。

本试验在T1代植株受粉5 d左右后观察其表型性状的变异类型及变异率，发现与对照组有较为明显的差异。首先是出现了一些未在对照组中发现的变异类型，如穗无蜡质、茎上绿斑、黄条斑叶、植株变高、主次分蘖不同步以及育性降低（花药发育异常）等；其次是T1代所有表型性状变异的变异率均高于对照组，较为明显的变异类型为畸形穗（变异率6.1%）、畸形旗叶（变异率7.6%）以及穗无蜡质（变异率4.1%），也有部分植株同时出现了多种变异类型。综合来看，T1代材料总变异率为21.3%，远高于对照组4.0%的变异率，表明利用花粉管通道法可以使受体细胞的基因以较高的概率发生多种分子水平的变异，进而引起较为丰富的表型变异，为筛选带有目的性状的新的小麦种质资源带来很大的便利。后续研究将利用IRAP分子标记技术对T1代的遗传多态性进行评估，对优良品种进行进一步的筛选和研究。

 

 

表1 T1代主要表型变异类型及变异率统计

  

表型变异类型 变异率（%）对照组 T1代畸形穗4.0 21.3 2.4 6.1畸形旗叶 0.8 7.6穗无蜡质 0.0 4.1茎上绿斑 0.0 0.5黄条斑叶 0.0 2.0植株变高 0.0 1.0主次分蘖不同步 0.0 1.0不分蘖 0.8 2.0育性降低（花药发育异常） 0.0 1.0总变异率

参考文献：

［1］周光宇.从生物化学的角度探讨远源杂交的理论［J］.中国农业科学，1978，11（2）：16－20.

［2］于 晶，任朝阳，闵 丽，等.花粉管通道法在单子叶作物遗传转化上的应用［J］.东北农业大学学报，2006，37（1）：130－134.

［3］简纯平，李开绵，欧文军.花分管通道法转基因育种研究进展［J］.热带作物学报，2012，33（5）：956－961.

［4］李 雪，安胜军，邵铁梅，等.芝麻花粉管介导胰岛素基因的遗传转化［J］.江苏农业学报，2016，32（5）：1013－1017.

［5］沈天民，刘文美，王德胜.优质超高产小麦新品系兰考906及其栽培技术要点［J］.河南农业科学，2000，29（8）：38.

［6］俞文政，杨 贵，张映南，等.辣椒基因组DNA提取方法研究［J］.辣椒杂志，2007，5（4）：39－43.

［7］苏 萍，吴 爽，李霞辉，等.电泳技术在鉴定玉米品种及纯度中的应用［J］.黑龙江农业科学，2000（1）：36－37.

［8］李永春，王 潇，陈 雷，等.中国小麦转基因研究的现状及前景［J］.中国农学通报，2008，24（5）：90－94.

［9］张 勇，刘朝辉，刘 成，等.外源种质导入引发小麦表观遗传变异的 MSAP分析［J］.科学通报，2007，52（24）：2857－2865.