四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱性抗生素，以十二氢化并四苯基结构为基本母核，包括四环素（tetracycline，TC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）及半合成衍生物多西环素（doxycycline，DC）等，结构式如图1所示。四环素类抗生素对大多数革兰氏阳性和阴性菌均表现出抑制活性，如葡萄球菌、芽孢杆菌、肺炎杆菌、溶血性链球菌、立克次氏体及沙眼病毒等。有关研究表明，四环素类抗生素在低剂量添加时有促进动物生长和提高饲料利用率的作用，高剂量使用时可用来治疗疾病。此外，为了产品的保鲜，在肉制品加工过程中也会添加一定的抗生素类药物来抑制细菌的滋生。据不完全统计，欧盟国家每年消耗的抗生素总量约5 000 t，其中四环素类抗生素就高达2 300 t［1］；在美国，四环素类抗生素约占整个抗生素市场份额的15.8%［2］；我国是四环素类抗生素生产、销售和使用大国，2014年仅四环素衍生物及其盐出口量就高达1.55×107 kg。

四环素类抗生素的大量使用，使其广泛残留在动物源性食品、环境水样以及土壤中。在一些常见的动物性食品，如鸡肉［3］、猪肉［4］、牛奶［5］和蜂蜜［6］等中都检测出有不同程度的四环素类药物残留。在美国爱荷华州［2］、韩国的汉江［7］以及中国的黄浦江［8］等均检测出四环素类抗生素，含量高达0.2 g／L。环境中的抗生素残留除了造成化学污染外，还可能会诱导抗性基因和抗性微生物的产生。这些抗性微生物可以通过直接或间接接触的方式进入人体，使人体的耐药性增强，从而给人类公共健康带来重大威胁。欧盟制定了四环素类抗生素最大残留限量标准（maximum residue limit，MRL），其中CTC和4－差向金霉素、DC、OTC、TC在奶和肌肉中为100μg／kg，肝脏中为300μg／kg，肾脏中为600μg／kg；我国动物性食品中兽药最高残留限量（农业部235号公告）规定CTC、DC、OTC和TC在肌肉、肝脏以及肾脏中的残留限量分别为100、300、600μg／kg，DC、OTC和 TC在奶中的残留限量为100μg／L。

鉴于四环素类抗生素在水体、土壤、动物性食品中的广泛残留，会对人体和环境造成巨大的危害，发展简便、快速、灵敏的检测方法显得尤为必要。四环素类抗生素的检测方法主要有微生物法［9－11］、ELISA方法［8，12－14］、HPLC［15－17］以及 LCMS［18－20］方法。微生物法能够同时筛查大量样本，但是灵敏度低、耗时长；HPLC／LC－MS具有灵敏度高、准确性好等优点，但是有需要昂贵的设备和专业操作人员、前处理过程复杂等不足，限制了其在快速检测领域的应用。以抗原抗体特异性结合为基础的ELISA方法在快速检测领域中占据主导地位。近年来，在传统的ELISA方法基础上，发展出了多种快速分析方法。比如，用适配体取代抗体，建立了酶联核酸适配体分析（enzyme linked aptamer assay，ELAA），引入了荧光、纳米颗粒等信号报告分子，传感器方法提高了检测的灵敏度，缩短了检测时间。本文主要综述了四环素类抗生素特异性识别元件以及各种快速分析方法在四环素类抗生素检测中的应用，旨在对该领域的发展趋势和方向提供参考。

1 特异性生物识别元件

自20世纪50年代抗体应用于快速检测领域以来，因其特异性、灵敏度以及亲和力等优势，被广泛应用于医学、农业、食品安全以及环境污染物等的快速检测中。然而，抗体制备过程周期较长（3～6个月），需要大量的试验动物，并且针对小分子物质的抗体制备较为困难。随着分子生物学技术以及材料科学的发展，一些与抗体具有类似功能的新型识别元件，比如重组抗体、核酸适配体、分子印迹聚合物等，被表达或合成出来，并广泛应用到快速检测领域中。

1.1 抗体

以抗原与抗体特异性结合特性为基础的免疫分析方法，在快速检测领域中占据着核心地位。抗体自身的特性直接影响检测方法的特异性、灵敏度、准确性和精密度。四环素类抗生素属于半抗原（分子量小于1 000），不具有免疫原性，须与大分子物质（蛋白质、多聚物等）偶联后才能刺激机体产生抗体。半抗原和大分子蛋白偶联方法的设计是抗体制备过程中的关键步骤，直接决定了所得抗体的特异性。四环素类抗生素以十二氢化并四苯基结构为母核，侧链取代基各有不同（图1）。在偶联时尽可能暴露母核结构，获得的抗体能够识别一类具有共同结构的化合物，即广谱性抗体；在蛋白质表面暴露靶物质的独特结构，获得的抗体对一种物质有较强的识别能力，即特异性抗体。由于欧盟和我国的残留限量均规定了CTC、DC、OTC、TC的MRL，在针对四环素类抗生素的检测中，单一物质以及多残留分析都是分析学家的热门研究方向。

 

虽然抗原－抗体结合的特异性强、灵敏度高，但是也存在着一些缺点：需要大量的试验动物、免疫周期长和不易获得较理想的抗体等。与抗体相比，核酸适配体不仅选择性专一而且具有体外合成周期短、性质稳定、易于修饰和保存、靶标分子种类多、无免疫原性和毒性等优势，并且可以对适配体的3′和 5′端进行修饰，而不影响目标物的结合位点［29－31］，比如生物素［32］、巯基［33］和一些标记分子［34］。目前，基于核酸适配体的生物传感器分析方法已被广泛应用到检测各种蛋白质、小分子化学物质、代谢物和环境污染物中［35－41］。

自以为瞒天过海，常常暗自庆幸，他哪里想到，他的一切举动尽在妻子掌握之下。那么她拍这些照片要干什么呢？其动机似乎不完全是为了拿到自己背叛的证据。既然有了确凿的证据，为什么迟迟不向自己摊牌呢？仔细回味，妻子似乎没什么反常啊？她怎么会如此镇定？看来他低估了妻子的能力，低估了妻子的心机。

电化学生物传感器是近些年来发展起来的一种新型检测分析方法，其原理是靶物质与电极上的生物识别元件（抗体、核酸适配体、MIP、细胞等）相结合，导致生物识别元件分子变构或活性发生改变，以电流、电势或电容为特征检测信号。电化学生物传感器具有上样体积小、响应快、准确度高、无需标记、可以实现连续在线检测等显著优势，在医学、食品工业和环境污染物检测等领域展示了十分广阔的应用前景。

按术前有无髌股关节退变症状，将患者分为两组，其功能评分结果见表1。末次随访时与术前相比，有膝前疼痛组和无膝前疼痛组的OKS评分均降低、AKSS膝关节评分均升高、AKSS膝关节功能评分均升高、WOMAC评分均降低、髌股关节评分PF总分升高，两组的各项评分术前与末次随访比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。术前和末次随访时，有膝前疼痛组与无膝前疼痛组之间在OKS评分、AKS膝关节评分、AKS膝关节功能评分、WOMAC评分和髌股关节评分PF总分的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 核酸适配体

1.1.1 特异性抗体 为了获得特异性抗体，乐涛以2号碳原子上的—CONH2和7号、9号碳原子位点上的—OH作为特征性基团，采用对氨基苯甲酸（4－aminobenzoic acid，PABA）为间隔臂，合成免疫原DC－PABA－BSA，获得抗DC多克隆抗体，对DC的半数抑制浓度（50%concentration of inhibition，IC50）为10.65 ng／mL，与 TC、CTC、OTC的交叉反应率分别为2.34%、2.46%、5.07%［21］。同时，Le等还利用杂交瘤技术筛选出1株能够特异性识别DC的单克隆抗体2.3／3A6，IC50达到2.36 ng／mL，与4－epi－DC的交叉反应率为 58.4%，与其他四环素类抗生素及其差向异构体无交叉反应［22］。李嘉嘉选用碳二亚胺法合成了OTC人工抗原并免疫动物，制备抗OTC单克隆抗体，对 OTC的 IC50为 0.217 mg／mL，对 TC和CTC的交叉反应率分别为 13.35%、11.84%［23］。Adrian等利用甲烯土霉素9号碳原子上的烯烃与3－巯基丙酸相连，合成免疫原TC1并成功地制得了能够特异性识别多西环素的多克隆抗体，IC50为 1.26 ng／mL［24］。李靓以金霉素 2号碳原子上的—CONH2为活性基团，采用EDC法合成免疫原，通过杂交瘤技术成功筛选到3株高效价、高特异性识别盐酸金霉素细胞株，其中6H5－H4的亲和常数 K a为4.05×1010 L／mol，对金霉素的IC50为29.86 ng／mL，与同系物四环素交叉反应率为 1.48%［25］。

Niazi等采用SELEX技术，筛选到7个能够特异性识别四环素骨架结构的 DNA适配体（T7、T15、T19、T20、T22、T23、T24），其解离常数K d在63～483 nmol／L之间。这7种适配体均能同时识别TC、OTC和DC，除T20对TC的亲和力最高外，其他6种适配体对OTC的亲和力最高［42］。Kim等利用OTC－BSA混合物通过SELEX技术，筛选得到识别OTC的适体（aptamer）4株，分别为 OTC3、OTC6、OTC9和 OTC16。其中OTC3对OTC显示出最强的结合能力，其解离常数 K d为4.7 nmol／L［43］。Chen等通过等温滴定量热技术筛选到特异性识别四环素的适配体，K d为 5.18×10－5 mol／L［44］。

1.3 分子印迹

分子印迹技术是模拟抗原抗体反应，以目标物为模板，通过化学方法合成一种高分子聚合物——分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP），该聚合物能够特异性地与目标物质结合达到检测的目的［45－46］。与传统抗体相比，分子印迹聚合物具有稳定性好、易制备、周期短、价格低廉、易于保存且能在复杂的环境中得以应用等优点［47］。

Li等以 OTC为模板，邻苯二胺（o－phenylenediamine，OPD）为功能单体，合成MIP，对四环素类化合物的识别能力为OTC＞TC＞CTC［48］。杨春艳等以TC为模板，甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）为功能单体，合成 MIP，以 50 mg MIP制备的固相萃取柱对 CTC的动态吸附量为 2.6×10－4 g／g［49］。Lian等以 CTC为模板，壳聚糖衍生物（chitosan derivative，CSDT）为单体，合成MIP，对 CTC有较好的识别能力，对四环素类其他化合物识别能力较弱，具有较好的特异性［50］。Chen等以 OTC为模板，MAA为功能单体，并结合Fe3 O4合成了具有磁性的四环素分子印迹聚合物。经鉴定，这种磁性MIPs能够选择性地识别四环素类化合物，其平均解离常数 K d为 724μmol／L［51］。

2 分析方法

随着生物检测技术的发展，放射性同位素、酶、量子点、荧光素等报告分子被引入到分析方法中，使得快速分析方法的性能得到了极大的改善。但是报告分子与抗体的偶联过程，可能会导致抗体活性下降或干扰抗原与抗体结合，因此近年来越来越多的学者试图探索出更具性价比的无标记的检测方法，其中以传感器技术应用最为广泛。

2.1 ELISA／ELAA方法

ELISA方法是最常见的快速检测方法，许多研究者都建立了 ELISA方法用于 TC、DC、OTC以及 CTC的检测［21，24，26－27，52］，检测限最低可达 0.19μg／L［53］，均可满足欧盟残留限量的检测标准。而Jeon等在ELISA方法中引入了生物素－亲和素系统，用于检测牛奶中的四环素残留，其方法的LOD为1.0×10－10 mol／L，线性范围在 3.16×10－10～3.16×10－7 mol／L［54］。

除ELISA法外，以适配体为识别分子代替抗体建立的ELAA在四环素快速检测中也有报道。Wang等建立了基于适配体的间接竞争ELISA方法特异性检测蜂蜜中的四环素含量，该方法的最低检测限为9.6×10－3 ng／mL，线性范围为0.01～100.00 ng／mL［55］。王赛等随后又建立了基于适配体的直接竞争ELISA方法，在蜂蜜中四环素的最低检测限为0.097 8 ng／mL，线性范围可 达 0.1～1 000.0 ng／mL［56］。Jeong等应用特异性识别四环素的ssDNA和RNA适配体建立了竞争酶联免疫适配体方法检测牛奶中的四环素残留，其LOD为 2.10×10－8 mol／L［57］。张璇等通过 Mannich法偶联HRP和四环素分子制备酶标记物，建立了四环素酶连适配体检测方法，该法的 IC50为 0.705 g／mL，LOD为 2.5 ng／mL［58］。

2.3.4 其他传感器 还有一些传感器，虽然没有应用抗体、适配体和MIP作为生物识别元件，而是利用其他生物活性物质，但建立的方法检测限低、灵敏度高、特异性强，用来检测目标物非常简单、方便。Ghodsi等利用OTC结构中的苯酚基团在H2 O2存在的条件下能够被HRP氧化的特性，并结合多壁碳纳米管（MWCNTs）独特的催化特性，建立了一种简单、灵敏的电化学传感器方法检测OTC，优化条件后，该方法的检测限达 35 nmol／L，线性范围在 15.0μmol／L～1.5 mmol／L［69］。

2.2 荧光分析方法

相对于ELISA法，荧光分析法具有更高的灵敏度，对某些物质的微量分析能够达到10－10 g数量级。近年来随着材料科学的发展，量子点（quantum dots，QDs）在分析化学等领域已成为重要的生物荧光探针。与传统荧光染料相比，QDs具有自身特有的光学稳定性、良好的生物相容性和长荧光寿命特性等特点，基于其开发的量子点荧光分析法也成为快速检测技术之一。García－Fernandez等用 CdSe／ZnS标记OTC－BSA，建立了直接筛选牛肉中4种四环素的免疫分析方法，检测限为 0.12μg／L，线性范围为 0.26～3.53μg／L［59］。王云云采用EDC／NHS为活化剂，偶联量子点和TC抗体，构建直接竞争荧光免疫分析方法，在酶标板上通过阵列分析实现对牛奶中四环素的残留检测，检测限达到0.005 ng／mL，线性范围为 0.01～10.00 ng／mL［60］。Hou等利用简单的微波辅助方法在碳量子点表面合成了能够和四环素分子特异性结合的分子印迹聚合物，建立了基于CDs＠MIPs的荧光检测牛奶中四环素残留的新方法，检测限为 5.48 nmol／L［61］。

2.3.3 以MIP为识别元件的电化学生物传感器 Li等采用OTC和HRP－OTC竞争性与MIP结合的策略，建立了基于分子印迹的电化学传感器用于OTC的检测，最低检测限为6.49×10－10 mol／L，线性范围为 0～1×10－7 mol／L［48］。Lian等在金电极上依次组装β环糊精－多壁碳纳米管复合物、纳米金－聚酰胺胺树状分子复合物以及MIP，构建电化学分子印迹传感器用于检测牛奶和蜂蜜中的OTC，其最低检测限为4.958×10－8 mol／L，线 性 范 围 为 9 ×10－8 ～5 ×10－5 mol／L［50］。廉文静利用最优化层数的壳聚糖－多壁碳纳米管复合物多层膜和金纳米粒子构建1种灵敏测定土霉素的分子印迹电化学传感器方法。该方法最低检测限为2.7×10－8 mol／L，线性范围为 3.0×10－8～8.0×10－5 mol／L［68］。

2.3 电化学生物传感器

1.1.2 广谱性抗体 Zhang等分别采用 Tolidine法、ABA法以及CDI法合成3种完全抗原免疫动物，所获得的血清均能与3种不同的免疫原相互识别，采用同源性ELISA时TC的抑制效果较差，而异源性方法则有明显的抑制效果，其中以TC－CDI－cBSA为免疫原的兔血清与TC－ABA－cOVA包被原配对时可以获得较好的抑制效果［26］。Pastornavarro等采用2种策略合成半抗原：在CTC／TC／OTC结构上衍生出羧基基团，采用EDC法与载体蛋白偶联；通过Mannich反应直接连接CTC／TC／OTC与蛋白。不同的抗原与抗体配对发现，以KLH－OTC－3－Ⅲ作免疫原，OVA－TC－1为包被抗原，建立的ELISA方法灵敏度最高。并且该抗体能够识别四环素类药物，对RTC、OTC、MC、CTC的交叉反应率分别为91%、30%、14%、10%［27］。高峰合成了 2类完全抗原：DC／CTC上引入对氨基苯乙酸后通过混合酸酐法与蛋白偶联以及DC直接与载体蛋白偶联，采用2种免疫原免疫小鼠，最终获得2株DC广谱单克隆抗体R3M1（免疫原为DC－BSA）和R8M4（免疫原为DC－C－BSA）［28］。以CTC－C－OA为包被原，R8M4可以识别 7种四环素类药物，对 DC、TC、OTC、CTC、MNC、MTC以及 DMC的交叉反应率分别为100%、68%、93%、65%、47%、102%、49%，IC50在 1.5～6.9 ng／mL之间［28］。

2.3.1 以抗体为识别元件的电化学生物传感器 Conzuelo等将抗TC抗体组装在修饰有蛋白G的磁珠上，HRP标记的TC和溶解在PBS里的TC标准品或样品竞争性地与TC抗体结合［62］。通过磁性装置分离并洗涤后，磁珠被移到丝网印刷碳电极上检测电信号。以此建立1种可弃式的传感器，用于牛奶中四环素类残留检测，对TC、CTC、OTC以及DC的检测限分别为 8.9、66.8、1.2、0.7 ng／mL［62］。

当混凝土路面局部出现断板、角隅断裂、轻微错台等病害，整体路基完好，根据旧路检测评价路基满足利用要求是，为避免不均匀沉降，可采用挖除旧路混凝土面层结构直接加铺路面结构方案处理，可以将混凝土面板打碎后碾压，将旧路整体作为路床使用。

2.3.2 以适配体为识别元件的电化学生物传感器 Kim等将巯基修饰的OTC适配体固化在金叉指阵列电极芯片上，利用循环伏安法和方波伏安法监测电信号，构建1种特异性识别OTC的生物传感器，线性范围在1～100 nmol／L之间［63］。Zhou等在玻碳电极表面组装了1层多壁碳纳米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs），通过多壁碳纳米管上的羧基与TC适配体偶联，构建1种新型的电化学传感器，采用循环伏安法检测电信号，实现对TC的快速检测。优化条件后，对TC的检测限为 5×10－9 mol／L，线性范围在 1×10－8～5×10－5 mol／L之间［64］。吴艳等将 TC核酸适配体共价固定于玻碳电极表面构建出可快速现场检测牛奶中四环素的新型生物传感器，检测限为1μg／L，线性检测范围为1～100μg／L［65］。Hou等将适配体组装在悬臂上，建立悬臂梁阵列传感器方法，快速、特异性检测OTC残留，该方法的最低检测限可达 0.2 nmol／L［66］。Liu等在玻璃电极表面组装了石墨相氮化碳（g－C3 N4）和CdS量子点复合物，并结合TC适配体，构建了能够特异性识别四环素的光电化学传感器，该传感器成功地结合了g－C3 N4和CdS量子点的特性于一体，其检测范围在 10～250 nmol／L，检测限为 5.3 nmol／L［67］。

他们给予我的温情、鼓励和方向，使得我在病痛当中拥有了治疗的勇气和好好活下去的力量。是的，疾病对人精神的摧毁，是无与伦比的。它蚕食和绞杀人的肉身，进而上升为对精神的折磨。也许，世上万物，都是残缺的，不完美的，在残缺和不完美中，万事万物才会更加坚韧，也才有追求完美的心愿和理想。

进气管漏气其实就是有一部分没有被空气流量计检测到的空气进入了进气道，实际上发动机喷油量不足，燃油修正值为正，通常在+20%以上(修正值会随漏气量的变化而变动)，而且通常会导致发动机抖动。此时，如果将发动机转速提高并保持在2 000r/min以上，长短期燃油修正值将趋于正常(+15%以下)。因为发动机转速提高后，节气门开度变大，进气管真空变小，未被检测的空气与流量计可检测到的空气的比例明显缩小，对发动机状态的影响明显减小。因此，进气管漏气只会引起怠速不稳，而不会影响汽车的加速性能。

5.4 血清微小RNA 研究[60]显示，IPA和肺癌患者血清中miR-21均高表达，但miR-21血清水平为0.198～0.723时才对鉴别诊断IPA有较好的价值；miR-21联合G试验和GM试验诊断IPA的价值优于各单项或双项联合。因此，可以认为miR-21是潜在的IPA诊断血清标志物。

2.4 基于金颗粒的检测方法

纳米金颗粒标记抗体结合硝酸纤维素膜建立的测流层析试纸条，具有检测快速、灵敏、操作简便等优点，是快速检测领域，尤其是现场检测的重要组成部分。刘丽等用实验室自制的金标记抗四环素单抗，建立了金标记快速检测试纸条检测食品中四环素的残留方法，灵敏度可达50 ng／mL［70］。武玉香利用固相抗原与游离CTC竞争性结合胶体金标记CTC抗体的原理，Luo等建立了胶体金免疫层析条法以及斑点金免疫渗滤方法，实现了对食品中CTC的快速检测。2种方法的检测限分别为 0.7、0.4μg／mL［71］。檀尊社等建立了胶体金免疫层析法用于快速检测水产品中四环素类药物残留，该方法检测水产品样品时，对 TC、CTC、OTC、DC的检测限分别为100、200、400、100 ng／mL，检测过程仅需 5～10 min［72］。

除测流层析试纸条外，一些新型的分析方法是基于纳米金颗粒的理化性质建立的。Luo等将特异性识别TC的适配体包被在纳米金颗粒表面，制得具有催化能力的纳米颗粒（aptamer coated nanogold，ACNG），ACNG能够催化 Fehling反应，在60℃时产生 Cu2 O晶体［73］。当没有 TC时，稳定的ACNG能够催化产生较多的Cu2 O晶体，具有较高的共振散色值（resonance scattering，RS）；当有 TC存在时，TC与特异性适配体结合，使纳米金颗粒暴露并沉聚，不能催化产生Cu2 O晶体，RS值降低。基于上述原理，Luo等建立了一种检测牛奶中四环素含量的共振散射光谱法，该方法的检测限为11.6 nmol／L，样本添加回收率为105%～109%［73］。Luo等建立了一种四环素比色分析方法，用于牛奶中四环素残留的检测［74］。当没有TC时，纳米金颗粒与适配体因静电引力而沉聚；当有TC存在时，TC特异性地与其适配体结合，诱导适配体构象变化，使得纳米金颗粒释放出来，引发吸光度的改变。该方法的最低检测限为 0.039μg／mL，线性范围为 0.2～2.0μg／mL［74］。

2.5 其他

除了以上所列出的比较具有代表性的快速分析方法外，还有一些其他的分析方法，虽然应用不广，但对分析方法的改进和发展来说仍然具有重要意义。Weber等成功地建立了一种基于原核细胞和哺乳动物细胞的生物传感器的体外检测方法，该方法引用了ELISA模式，检测四环素类抗体的最低检测限能够达到ng／mL级别［75］。杨春艳等利用CTC在酸性介质中能极大地增敏Ce（Ⅳ）和Rh6G的化学发光特性，建立了分子印迹固相萃取－化学发光测定盐酸金霉素的方法，线性范围为2×10－8～1×10－6 g／mL，检测限为 4×10－9 g／mL［49］。

我们以为，对英勇历史的崇敬和对美好生活的享受，应成为每一个城市文化底蕴的基调，对此，我们还有许多值得努力之处啊！

3 结语

由于四环素类抗生素的广泛使用，在水体、土壤、动物性食品中都会有抗生素残留。虽然食品和环境中的抗生素残留并不表现出急性毒性作用，但长期摄入和接触可能会产生各种慢性和蓄积性毒性［76］，还可能引起耐药菌株的增加，进而通过环境和食物链间接危害到人类的身体健康和安全。因此，各国也加大了对抗生素非法使用和滥用情况的监管力度。

表1中汇总了现有的四环素快速分析方法，发现其具有以下特点：（1）尽管特异性抗体仍然是重要的生物识别元件，但是新兴的识别分子，如核酸适配体、MIP等，已经成功地应用于快速分析方法的建立；（2）电化学传感器方法因其灵敏度高、快速等优势在四环素快速分析中得到长足发展，并且与新型的纳米材料相结合，提高了检测方法的性能；（3）充分利用核酸的理化性质，结合适当的纳米材料（纳米金等），建立一系列新型的分析方法，可以实现定量／半定量的检测。在未来的检测领域中，结合抗体、适配体、MIP等识别元件的特性，联合各种新材料（碳纳米管、金属纳米颗粒等）或新技术（传感器技术），开发出新颖的检测方法，依然是四环素类抗生素快速分析的发展方向。

参考文献：

［1］Hirsch R，Ternes T，Haberer K，et al.Occurrence of antibiotics in the aquatic environment［J］.Science of the Total Environment，1995，225（1／2）：109－118.

［2］Sarmaha A K，Meyer M T，Boxall B A.A global perspective on the use，exposure pathways，occurrence，fate and effects of veterinary antibiotics（Vas）in the environment［J］.Chemosphere，2006，65（5）：725－759.

［3］郭培源，赵俊华，刘 硕，等.鸡肉中四环素残留量检测及健康风险评估［J］.食品安全质量检测学报，2015，6（9）：3614－3620.

［4］曹艺耀.动物性食品中兽药残留检测方法研究及济南市售动物性食品中兽药残留市场调查［D］.济南：山东大学，2013.

［5］Tan H L，Ma C J，Song Y H，et al.Determination of tetracycline in milk by using nucleotide／lanthanide coordination polymer－based ternary complex［J］.Biosensors＆ Bioelectronics，2013，50（4）：447－452.

［6］Tarapoulouzi M，Papachrysostomou C，Constantinou S，et al.Determinative and confirmatorymethod for residues of tetracyclines in honey by LC－MS／MS［J］.Food Additives＆Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure＆Risk Assessment，2013，30（10）：1728－1732.

［7］Choi K J，Kim CW，Kim SH.Determination of antibiotic compounds in water by on－line SPE－LC／MSD［J］.Chemosphere，2007，66（6）：977－984.

［8］韩敏奇，蒋增辉，陆志惠，等.酶联免疫法测定上海原水中四环素浓度［J］.供水技术，2015，9（3）：57－59.

［9］Virolainen N E，Pikkemaat M G，Elferink JW A，et al.Rapid detection of tetracyclines and their4－epimer derivatives from poultry meat with bioluminescent biosensor bacteria［J］. Journal of Agricultural＆Food Chemistry，2008，56（23）：11065.

［10］刘兴泉，冯 震，姚 蕾，等.采用高通量微生物法检测四种抗生素在鸡蛋中的残留［J］.现代食品科学，2011，27（4）：465－467.

［11］刘兴泉，冯 震，姚 蕾，等.采用高通量微生物法和HPLC法检测猪肉中四环素和磺胺类抗生素残留［J］.食品与发酵工业，2011，37（4）：194－197.

［12］国占宝，武玉香，田文礼，等.食品中四环素类残留的酶联免疫检测试剂盒的研制［J］.食品科学，2011，32（2）：333－337.

 

表1 四环素快速分析方法

  

注：－a表示文献中未报道；－b表示无识别元件。

 

线性范围 信号分子 参考文献ELISA DC 抗体 0.100μg／L 0.250～6.700μg／L HRP ［24］分析方法 目标物 识别元件 LOD TC 抗体 10.000μg／L 100.000～1.000×105μg／L HRP ［26］TC 抗体 0.400μg／L 1.150～38.900μg／L HRP ［27］TC 抗体 －a 3.900～2.000×103μg／L HRP ［52］TC 抗体 0.190μg／L 1.520～152.000μg／L HPR ［53］TC 抗体 0.048μg／L 0.316～316.000 nmol／L HRP ［54］ELAA TC 适配体 9.600 ng／L 0.010～100.000μg／L HRP ［55］TC 适配体 0.098μg／L 0.100～1.000×103μg／L HRP ［56］TC 适配体 32.700 nmol／L 199.000～1.000×105 nmol／L HRP ［57］适配体 21.000 nmol／L 31.600～3.160×105 nmol／L TC 适配体 2.500μg／L －a HRP ［58］荧光分析方法 TCs 抗体 0.120μg／L 0.260～3.530μg／L QDs ［59］TC 抗体 0.005μg／L －a QDs ［60］TC MIP 5.480 nmol／L 20.000～1.200×104 nmol／L QDs ［61］电化学生物传感器 TCs 抗体 3.900μg／L 12.500～676.200μg／L SPCEs ［62］OTC 适配体 －a 1.000～100.000 nmol／L 电信号 ［63］TC 适配体 5.000 nmol／L 10.000～5.000×104 nmol／L 电信号 ［64］TC 适配体 1.000μg／L 1.000～100.000μg／L 电信号 ［65］OTC 适配体 0.200 nmol／L 1.000～100.000 nmol／L 电信号 ［66］TC 适配体 5.300 nmol／L 10.000～250.000 nmol／L 光电信号 ［67］OTC MIP 0.649 nmol／L －a 电信号 ［48］CTC MIP 49.580 nmol／L 9.000～5.000×104 nmol／L 电信号 ［50］OTC MIP 27.000 nmol／L 30.000～8.000×104 nmol／L 电信号 ［68］CTC 49.580 nmol／L 9.000～5.000×104 nmol／L TC 36.500 nmol／L 50.000～1.000×105 nmol／L OTC －b 35.000 nmol／L 1.500×104～1.500×106 nmol／L 电信号 ［69］基于金纳米颗粒 TC 抗体 50.000μg／L －a 比色 ［70］CTC 抗体 0.400μg／L 600.000～1.000×103μg／L 比色 ［71］TC 抗体 100.000μg／L －a 比色 ［72］TC 适配体 11.600 nmol／L －a RS ［73］TC 适配体 39.000μg／L 200.000～2.000×103μg／L 比色 ［74］其他 TC 哺乳动物细胞 1.900μg／L －a HRP ［75］CTC 0.400μg／L －a OTC 1.900μg／L －a DC 0.100μg／L －a CTC MIP －a 20.000～1.000×103 nmol／L 化学发光 ［49］

［13］Chen Y N，Kong D Z，Liu LQ，et al.Development of an ELISA and immunochromatographic assay for tetracycline，oxytetracycline，and chlortetracycline residues in milk and honey based on the classspecific monoclonal antibody［J］.Food Analytical Methods，2016，9（4）：1－10.

［14］Gao F，Zhao G X，Zhang H C，et al.Production of monoclonal antibody against doxycycline for immunoassay of seven tetracyclines in bovine muscle and milk［J］.Journal of Environmental Science and Health，Part.B，Pesticides，Food Contaminants，and Agricultral Wastes，2013，48（2）：92－100.

［15］胡冠九，王 冰，孙 成.高效液相色谱法测定环境水样中5种四环素类抗生素残留［J］.环境化学，2007，26（1）：106－107.

［16］Castellari M，Gratacós－CubarsíM，García－Regueiro J A.Detection of tetracycline and oxytetracycline residues in pig and calf hair by ultra－high－performance liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216（46）：8096－8100.

［17］TylováT，Ol sˇovskáJ，Novák P，et al.High－throughput analysis of tetracycline antibiotics and their epimers in liquid hogmanure using Ultra Performance Liquid Chromatography with UV detection［J］.Chemosphere，2009，78（4）：353－359.

［18］高晓丹.分子印迹技术与LC－MS／MS联用在食品中痕量四环素类检测的应用研究［D］.武汉：华中科技大学，2007.

［19］Pamreddy A，Hidalgo M，Havel J，et al.Determination of antibiotics（tetracyclines and sulfonamides）in biosolids by pressurized liquid extraction and liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2013，1298（13）：68－75.

［20］Spisso B F，Monteiro M A，Lima A M B，et al.A liquid chromatography－tandem mass spectrometry confirmatory assay for the simultaneous determination of several tetracyclines in milk considering keto－enol tautomerism and epimerization phenomena［J］.Analytica Chimica Acta，2009，656（1／2）：72－84.

［21］乐 涛.多西环素残留免疫学快速检测技术研究［D］.武汉：华中农业大学，2010.

［22］Le T，Zhao W Z，WeiW，et al.Development of a highly sensitive and specific monoclonal antibody－based enzyme－linked immunosorbent assay for determination of doxycycline in chicken muscle，liver and egg［J］.Food Chemistry，2012，134（4）：2442－2446.

［23］李嘉嘉.土霉素单克隆抗体的制备［D］.洛阳：河南科技大学，2012.

［24］Adrian J，Fernández F，Sánchezbaeza F，et al.Preparation of antibodies and development of an enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）for the determination of doxycycline antibiotic in milk samples［J］.Journal of Agricultural＆Food Chemistry，2012，57（60）：3837－3846.

［25］李 靓.盐酸金霉素免疫学快速检测方法研究［D］.洛阳：河南科技大学，2012.

［26］Zhang Y L，Lu SX，Liu W，et al.Preparation of anti－tetracycline antibodies and development of an indirect heterologous competitive enzyme－linked immunosorbent assay to detect residues of tetracycline in milk［J］.Journal of Agricultural＆Food Chemistry，2007，55（2）：211－218.

［27］Pastornavarro N，Morais S，Maquieira A，et al.Synthesis of haptens and development of a sensitive immunoassay for tetracycline residues：application to honey samples.［J］.Analytica Chimica Acta，2007，594（2）：211－218.

［28］高 峰.强力霉素广谱单克隆抗体的制备及应用［D］.保定：河北农业大学，2013.

［29］Huang DW，Niu CG，Qin P Z，et al.Time－resolved fluorescence aptamer－based sandwich assay for thrombin detection［J］.Talanta，2010，83（1）：185－189.

［30］Ferreira C SM，Papamichael K，Guilbault G，et al.DNA aptamers against the MUC1 tumour marker：design of aptamer－antibody sandwich ELISA for the early diagnosis of epithelial tumours［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2008，390（4）：1039－1050.

［31］Pultar J，Sauer U，Domnanich P，et al.Aptamer－antibody on－chip sandwich immunoassay for detection of CRP in spiked serum［J］.Biosensors＆Bioelectronics，2009，24（5）：1456－1461.

［32］Park H，Paeng IR.Development of direct competitive enzymelinked aptamer assay for determination of dopamine in serum［J］.Analytica Chimica Acta，2011，685（1）：65－73.

［33］Wang J，Munir A，Li Z，et al.Aptamer－Au NPs conjugatesenhanced SPR sensing for the ultrasensitive sandwich immunoassay［J］.Biosensors＆Bioelectronics，2009，25（1）：124－129.

［34］Shimada J，Maruyama T，Kitaoka M，et al.DNA－enzyme conjugate with a weak inhibitor that can specifically detect thrombin in a homogeneousmedium［J］.Analytical Biochemistry，2011，414（1）：103－108.

［35］Zheng J，Cheng G F，He P G，et al.An aptamerbased assay for thrombin via structure switch based on gold nanoparticles and magnetic nanoparticles［J］.Talanta，2010，80（5）：1868－1872.

［36］Wu Z S，Lu H，Liu X，et al.Inhibitory effect of target binding on hairpin aptamer sticky－end pairing－induced gold nanoparticle assembly for light－up colorimetric protein assay［J］.Analytical Chemistry，2010，82（9）：3890－3898.

［37］Edwards K A，Wang Y，Baeumner A J.Aptamer sandwich assays：humanα－thrombin detection using liposome enhancement［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，398（6）：2645－2654.

［38］Surugiu－Warnmark I，Warnmark A，Toresson G，et al.Selection of DNA aptamers against rat liver X receptors［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，332（2）：512－517.

［39］Shimada J，Maruyama T，Kitaoka M，et al.DNA－enzyme conjugate with a weak inhibitor that can specifically detect thrombin in a homogeneousmedium［J］.Analytical Biochemistry，2011，414（1）：103－108.

［40］Park H，Paeng I R.Development of direct competitive enzymelinked aptamer assay for determination of dopamine in serum［J］.Analytica Chimica Acta，2011，685（1）：65－73.

［41］Xu H，Mao X，Zeng Q X，et al.Aptamer－functionalized gold nanoparticles as probes in a dry－reagent strip biosensor for protein analysis［J］.Analytical Chemistry，2008，81（2）：669－675.

［42］Niazi J H，Lee S J，Gu M B.Single－stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines［J］.Bioorganic＆ Medicinal Chemistry，2008，16（15）：7245－7253.

［43］Kim C H，Lee L P，Min JR，et al.An indirect competitive assaybased aptasensor for detection of oxytetracycline in milk［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，51（1）：426－430.

［44］Chen D，Yao D S，Xie C F，et al.Development of an aptasensor for electrochemical detection of tetracycline［J］.Food Control，2014，42：109－115.

［45］Alexander C，Andersson H S，Andersson L I，et al.Molecular imprinting science and technology：a survey of the literature for the years up to and including 2003［J］. Journal of Molecular Recognition，2006，19（2）：106－180.

［46］林 影，叶 茂，韩双艳，等.免疫检测技术的研究进展［J］.食品与生物技术学报，2007，26（4）：117－120.

［47］李兴霞，程玉来，王国来，等.免疫检测新技术在食品检测中的应用［J］.食品工业科技，2006，27（3）：170－174.

［48］Li JP，Jiang F Y，Wei X P.Molecularly imprinted sensor based on an enzyme amplifier for ultratrace oxytetracycline determination［J］.Analytical Chemistry，2010，82（14）：6074－6078.

［49］杨春艳，熊 艳，何 超，等.分子印迹固相萃取－化学发光测定盐酸金霉素［J］.应用化学，2007，24（3）：273－277.

［50］Lian W J，Huang JD，Yu JH，etal.Amolecularly imprinted sensor based onβ－cyclodextrin incorporated multiwalled carbon nanotube and gold nanoparticles－polyamide amine dendrimer nanocomposites combining with water－soluble chitosan derivative for the detection of chlortetracycline［J］.Food Control，2012，26（2）：620－627.

［51］Chen L G，Liu J，Zeng Q L，et al.Preparation of magnetic molecularly imprinted polymer for the separation of tetracycline antibiotics from egg and tissue samples［J］. Journal of Chromatography A，2009，1216（18）：3710－3719.

［52］李利东，宓晓黎，袁建兴，等.酶联免疫检测试剂盒应用于牛奶中四环素残留的测定［J］.乳业科学与技术，2004，27（2）：52－54.

［53］Jeon M，Paeng IR.Quantitative detection of tetracycline residues in honey by a simple sensitive immunoassay［J］.Analytica Chimica Acta，2008，626（2）：180－185.

［54］Jeon M，Kim J，Paeng K J，et al.Biotin－avidin mediated competitive enzyme－linked immunosorbent assay to detect residues of tetracyclines in milk［J］.Microchemical Journal，2008，88（1）：26－31.

［55］Wang S，Yong W，Liu J H，et al.Development of an indirect competitive assay－based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，57（21）：192－198.

［56］Wang S，Liu JH，Yong W，et al.A direct competitive assay－based aptasensor for sensitive determination of tetracycline residue in honey［J］.Talanta，2015，131：562－569.

［57］Jeong S，Rhee P I.Sensitivity and selectivity on aptamer－based assay：the determination of tetracycline residue in bovine milk［J］.The Scientific World Journal，2012，2012（4968）：357－369.

［58］张 璇，刘信嘉，雷红涛，等.基于酶联适配体的四环素检测方法研究［J］.现代食品科技，2014，30（7）：263－267.

［59］García－Fernandez J，Trapiella－Alfonso L，Costa－Fernandez JM，et al.A quantum dot－based immunoassay for screening of tetracyclines in bovinemuscle［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（7）：1733－1740.

［60］王云云.多色量子点荧光免疫法同时快速检测牛奶中多抗生素残留的研究［D］.重庆：西南大学，2013.

［61］Hou J，Li H Y，Wang L，et al.Rapid microwave－assisted synthesis of molecularly imprinted polymers on carbon quantum dots for fluorescent sensing of tetracycline in milk［J］.Talanta，2016，146：34－40.

［62］Conzuelo F，Gamella M，Campuzano S，et al. Disposable amperometric magneto－immunosensor for direct detection of tetracyclines antibiotics residues in milk［J］.Analytica Chimica Acta，2012，737（15）：29－36.

［63］Kim Y S，Niazi JH，Gu M B.Specific detection of oxytetracycline using DNA aptamer－immobilized interdigitated array electrode chip［J］.Analytica Chimica Acta，2009，634（2）：250－254.

［64］Zhou L，Li D J，Gai L，et al.Electrochemical aptasensor for the detection of tetracycline with multi－walled carbon nanotubes amplification［J］.Sensors and Actuators B：Chemical，2012，162（1）：201－208.

［65］吴 艳，张娟琨，范 婷，等.核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素［J］.生物加工过程，2010，8（3）：48－52.

［66］Hou H，Bai X J，Xing C Y，et al.Aptamer－based cantilever array sensors for oxytetracycline detection［J］.Analytical Chemistry，2013，85（4）：2010－2014.

［67］Liu Y，Yan K，Zhang JD.Graphitic carbon nitride sensitized with CdS quantum dots for visible－light－driven photoelectrochemical aptasensing of tetracycline［J］.ACSApplied Materials＆Interfaces，2015，8（42）：28255－28264.

［68］廉文静.分子印迹技术结合壳聚糖检测食品中抗生素的电化学传感器研究［D］.济南：济南大学，2013.

［69］Ghodsi J，Rafati A A，Shoja Y.First report on electrocatalytic oxidation of oxytetracycline by horse radish peroxidase：application in developing a biosensor to oxytetracycline determination［J］.Sensors and Actuators B：Chemical，2016，224：692－699.

［70］刘 丽，胡宜亮，王玉金，等.食品中四环素残留快速检测方法的初步建立［J］.河南科学，2012，30（10）：1462－1465.

［71］武玉香.食品中金霉素残留的胶体金免疫检测方法研究［D］.武汉：武汉工业学院，2008.

［72］檀尊社，陆 恒，邵伟胶，等.胶体金免疫层析法快速检测水产品中四环素类药物残留［J］.西北农业学报，2010，19（8）：32－37.

［73］Luo Y F，He L，Zhan S S，et al.Ultrasensitive resonance scattering（RS）spectral detection for trace tetracycline inmilk using aptamercoated nanogold（ACNG）as a catalyst［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（5）：1032－1037.

［74］Luo Y L，Xu JY，Li Y，et al.A novel colorimetric aptasensor using cysteamine－stabilized gold nanoparticles as probe for rapid and specific detection of tetracycline in raw milk［J］.Food Control，2015，54：7－15.

［75］Weber C C，Link N，Fux C，et al.Broadspectrum protein biosensors for class－specific detection of antibiotics［J］.Biotechnology and Bioengineering，2005，89（1）：9－17.

［76］陆 凡.江苏省生物农药生产现状、存在问题及发展建议［J］.江苏农业学报，2016，32（1）：56－66.