苜蓿（Medicago sativa L.）作为牧草之王，不仅饲用价值高，在畜牧业生产中应用广泛，而且还可以加工成高蛋白人类营养保健食品，此外苜蓿富含各种维生素、矿物质及类胡萝卜素、类黄酮素和酚型酸，具有良好的药用价值，全草入药，有助于人体健康的恢复；苜蓿还是防风固沙和绿化荒山的优良作物，具有很高的环保价值。苜蓿在地球上分布广泛，除野生种外，世界各国都有栽培，目前对苜蓿的遗传改良也成为一大研究热点。

DNA甲基化（DNA methylation）是目前表观遗传学研究的热点之一，DNA甲基化是基因组遗传信息的重要组成，在维持基因组稳定性、调节基因活性以及生长发育中基因的表达调控方面起重要作用［1－2］，甲基化水平过低或过高，都会影响植物生长发育和分化，导致发育和形态异常［3］。

他漫无目的独自行走在大街上，茶楼、饭馆，就连洗手间到处都张贴有“禁止吸烟”的字样，行人举止文明，精神饱满，洋溢着自信、幸福的笑容。他从口袋内掏出香烟，烟盒上面标有“吸烟有害健康，戒烟可减少对健康的危害”。他想起老婆的反对，儿媳的忠告，特别是自己的身体危害，毅然决然把烟和打火机丢进了垃圾桶，用手在脸上猛抽了几下，“不许再抽了，是要戒烟了，抽下去要死的！”

本研究在培养基中添加甲基化抑制剂，观察其在生长发育和再生过程中的效应，以期为苜蓿遗传改良和表观遗传研究积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

1.1.1植物材料 中苜1号种子购自中国农业科学院，选取其无菌苗的下胚轴和子叶。

愈伤诱导培养基：MS＋UM有机 ＋2 mg／L 2，4－D＋0.25 mg／L 6－BA＋30 g／L蔗糖 ＋8 g／L琼脂粉 ＋2 g／L水解酪蛋白（UM有机包含10 mg／L盐酸硫胺素、10 mg／L盐酸吡哆醇、5 mg／L烟酸、2 mg／L甘氨酸、100 mg／L肌醇），分别添加不同浓度的甘露醇、5－azaC、姜黄素。

方法 采用定量问卷调查与定性深入访谈相结合的方式。调查问卷由本研究团队自行设计，内容包括基本人口学信息、“校园行”活动基本情况、高校防艾活动情况、艾滋病相关知识知晓情况(采用国家明确规定8条大众应掌握的艾滋病基本知识，正确回答6个及以上视为知晓，否则为不知晓。以下简称“国八条”)等。利用班会时间集中调查，现场发放问卷，学生自填，当场回收。定性调查由研究团队自行设计访谈提纲，内容主要为对“校园行”活动的评价及建议。一对一面对面访谈。

种子培养基：MS固体培养基（含30 g／L蔗糖和8 g／L琼脂），分别添加不同浓度的甘露醇、5－azaC、姜黄素。

1.1.2 试剂和培养基 MS培养基所用试剂、甘露醇、乙醇、氯化汞等均为国产分析纯试剂；植物生长调节剂、5－氮杂胞苷（5－azacytidine，5－azaC）、姜黄素均为生工生物工程（上海）股份有限公司进口分装试剂，植物生长调节剂配成1 000×贮液－20℃保存；5－azaC和姜黄素配成10 mmol／L溶液－20℃保存。

经消毒的苜蓿种子接种于添加有不同浓度甘露醇、姜黄素和5－azaC的MS培养基上，4～5 d即可发芽（图1），分别统计8 d时每浓度梯度各3瓶的发芽种子数和未发芽种子数，计算得到发芽率，以及每一处理组的平均发芽率（表1），利用方差分析和多重比较方法对数据进行统计学分析。结果发现，除姜黄素10μmol／L处理组苜蓿种子发芽率极显著高于其他姜黄素浓度组和对照组外（P＜0.01），其他甲基化抑制剂及其他各浓度处理，并未引起苜蓿种子发芽率的显著变化（P＞0.05），只是随各种试剂浓度增加表现出发芽率降低的趋势，但差异没有统计学意义。

1935年6月至1936年8月，红一、四方面军近9万人次，先后三次途经黑水。在此期间 ，红军在黑水芦花地区大力开展了筹粮熬盐工作，为过草地准备了必需的粮食、盐巴和其他生活御寒物资。毛泽东同志和朱德同志等都亲自下地同红军战士和藏胞一起割麦子，周恩来在工作百忙中也抢时间搓麦，邓小平以及贾拓夫、成仿吾等也都深入高山村寨开展群众工作，筹集粮食。

1.2 方法

3种甲基化抑制剂处理得到的无菌苗单株平均干质量与对应试剂各处理组鲜质量有相似的变化趋势，但均未达到显著差异水平（P＞0.05）。

同法在无添加甲基化抑制剂的MS培养基中，接种苜蓿种子培养，观察无菌苗的长势，待子叶展开即可剪取子叶和下胚轴进行组织培养和愈伤诱导。

选择长势良好的5～6 d无菌苗的子叶（从基部切下）、下胚轴切段（3～5 mm）为外植体，分别接种到添加不同浓度梯度甲基化抑制剂的愈伤诱导培养基中，每一种甲基化抑制剂每一浓度梯度接种子叶外植体和下胚轴外植体各10瓶，每瓶5～8块。培养瓶置于（24±1）℃、光照度25μmol／（m2·s）、光暗周期比为16 h∶8 h的恒温培养室中培养，定时观察，及时清理污染的培养基，观察并记录下胚轴和子叶开始出现第1块愈伤组织的时间，并于20 d后统计下胚轴和子叶的愈伤诱导情况，计算愈伤诱导率。

对统计数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，SNK法对差异达显著水平的数据进行多重比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 甲基化抑制剂对苜蓿种子萌发的影响

其中，甘露醇在灭菌前直接加入培养基中，使终浓度分别为 0、50、100、150、200 mmol／L，灭菌后使用；5－azaC和姜黄素经抽滤灭菌后，分别在培养基灭菌后降温至60℃以下时加入，使终浓度依次为 0、10、25、50、100μmol／L，摇匀后分装。3种甲基化抑制剂按浓度从低到高依次标记为CK（0添加）、B1、B2、B3、B4。

 

2.2 甲基化抑制剂对苜蓿无菌苗生长的影响

接种后8 d，可发芽的种子都已发芽成苗，部分已经长出真叶，须根极少或没有，取出无菌苗，测量每一株的根长度，每一瓶无菌苗的数量、鲜质量和干质量（80℃烘干至恒质量），计算每一培养瓶中无菌苗的平均根长度、单株平均鲜质量和单株平均干质量，以及每一处理浓度组的平均值，结果见表1。

对各组根长数据进行方差分析，结果表明，甘露醇和5－azaC各处理组与对照组彼此差异均不显著（P＞0.05），且苜蓿无菌苗根长未表现出随浓度变化的规律性变化，姜黄素处理组苜蓿苗根长均极显著小于对照组（P＜0.01），10μmol／L处理组苜蓿苗根长显著大于100μmol／L处理组（P＜0.05）。

智能变电站装配式建筑造价影响因子识别是从装配式建筑建造技术的基本内容出发，采用Pareto分析法对宁夏电网2015—2018年竣工结算的智能变电站装配式建筑在招投标阶段、结算阶段的工程量、价差异分析，识别出造价占比累计达到80%的造价影响因子主要集中在以下4个指标中：钢柱、楼板屋面板、外墙、屋面保温。则将智能变电站装配式建筑造价影响因子集合表示为：

挑选饱满无损伤的种子，流水下冲洗30 min，在70%的乙醇中振荡1 min，换入0.1%的氯化汞中振荡消毒8 min，再用无菌水冲洗5～7次，无菌滤纸吸干表面水分后，接种于添加有不同浓度甘露醇、姜黄素和5－azaC的MS培养基上，每一种甲基化抑制剂每浓度梯度重复4瓶（其中1瓶作为备用样品，另作标记，只有当某一供试样品污染或发生异常时用备用样品代替），每瓶30粒左右；置于（24±1）℃、光照度25μmol／（m2·s）、光暗周期比为16 h∶8 h的恒温培养室中培养，每天定时观察种子萌发情况和无菌苗的长势，分别统计8 d时的发芽率、无菌苗根长度、整株鲜质量和干质量。

各组的单株干鲜质量数据方差分析结果表明，5－azaC各处理组单株鲜质量均低于对照组，且随处理浓度变化，单株鲜质量呈现钟形曲线变化，但差异均无统计学意义（P＞005）；添加甘露醇有使无菌苗鲜质量降低的趋势，且与对照组相比达到极显著差异水平（P＜0.01），而各处理浓度组之间苜蓿无菌苗单株鲜质量无显著差异（P＞0.05）；姜黄素的添加使苜蓿单株鲜质量极显著降低（P＜0.01），且低浓度组（10μmol／L）单株鲜质量显著大于高浓度组（50、100μmol／L）（P＜0.05），而中高浓度处理组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 甲基化抑制剂对愈伤组织诱导的影响

分别统计下胚轴和子叶作为外植体进行愈伤诱导（图2）的数据，由表1可知，经方差分析和多重比较，结果表明，添加5－azaC后，下胚轴愈伤诱导率呈现随添加浓度升高而降低的趋势，除低浓度（10μmol／L）处理组与对照组差异不显著外（P＞0.05），中高浓度（25～100μmol／L）处理组下胚轴愈伤诱导率极显著低于对照组（P＜0.01），100μmol／L处理组下胚轴愈伤诱导率显著或极显著低于对照组和其他处理浓度组（P＜0.05）；添加甘露醇除高浓度（200 mmol／L）处理组下胚轴愈伤诱导率极显著低于对照组和低浓度（50 mmol／L）处理组外（P＜0.01），其余各处理组及对照组间均无显著差异（P＞0.05）；添加低浓度（10μmol／L）姜黄素可促进下胚轴愈伤组织的形成，愈伤诱导率显著高于对照组（P＜0.05），但随添加浓度的增加，下胚轴愈伤诱导率急剧降低，直至高浓度（100μmol／L）完全抑制愈伤组织的形成，各浓度梯度间呈现出极显著差异（P＜0.01）。

添加5－azaC使子叶愈伤诱导率呈现降低趋势，但除高浓度处理组（100μmol／L）显著低于无添加的对照组外（P＜0.05），其余各处理组间相比均无显著差异（P＞0.05）；添加甘露醇也使子叶愈伤诱导率呈现降低趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；添加姜黄素诱导子叶愈伤组织，也呈现出与下胚轴愈伤诱导相似的倾向，同样在高浓度完全不能诱导产生愈伤组织，对照组、低浓度组（10μmol／L）和中浓度组（25μmol／L）三者之间愈伤诱导率均无显著差异（P＞0.05），三者愈伤诱导率极显著高于高浓度（50～100μmol／L）添加组（P＜0.01）。

 

表1 添加甲基化抑制剂对苜蓿生长及再生的影响

  

注：CK为对照组，对于 5－azaC和姜黄素 B1、B2、B3、B4分别为 10、25、50、100μmol／L，对于甘露醇 B1、B2、B3、B4分别为 50、100、150、200 mmol／L；“”“”分别表示与对照组和其他试验组相比在0.05、0.01水平上差异显著、极显著；“＃”“＃”分别表示与对照组相比在005、0.01水平上差异显著、极显著。

 

处理 种子发芽率（%） 根长（cm） 鲜质量（mg ）3 38.57±9.93 B1 69.83±2.86 75.03±9.09 96.10±3.623.03±0.57 3.12±0.46 2.02±0.15＃＃ 24.69±4.07 25.01±0.64＃＃21.55±1.35＃＃B2 82.01±9.55 74.52±4.28 84.76±5.77 3.03±0.70 2.80±0.41 1.61±0.28＃＃ 31.69±9.55 20.13±2.44＃＃13.62±1.18＃＃B3 80.16±7.65 75.10±18.33 78.89±5.09 3.37±0.26 2.84±0.74 1.36±0.15＃＃ 32.47±4.94 16.18±4.30＃＃10.57±0.91＃＃B4 86.08±4.19 63.04±3.96 76.88±6.60 2.48±0.62 2.90±0.41 0.89±0.10＃＃ 26.33±7.30 19.74±2.92＃＃ 7.48±0.66＃＃处理 干质量（mg） 下胚轴愈伤诱导率（%） 子叶愈伤诱导率（%）氮杂胞苷 甘露醇 姜黄素CK 83.01±2.45 83.01±2.45 83.01±2.45 3.75±0.94 3.75±0.94 3.75±0.94 38.57±9.93 38.57±9.9 5－氮杂胞苷 甘露醇 姜黄素 5－氮杂胞苷 甘露醇 姜黄素 5－氮杂胞苷 甘露醇 姜黄素CK 2.02±0.27 2.02±0.27 2.02±0.27 82.50±11.89 82.50±11.89 82.50±11.89 35.33±14.42 35.33 5－氮杂胞苷 甘露醇 姜黄素 5－氮杂胞苷 甘露醇 姜黄素 5－±14.42 35.33±14.42 B1 2.01±0.17 2.21±0.03 2.06±0.05 73.13±23.75 84.38±18.02 97.50±7.07＃ 25.42±3.65 34.69±12.07 40.83±21.51 B2 2.07±0.12 1.72±0.24 1.32±1.16 53.75±5.18＃＃ 65.63±23.52 56.04±17.8831.25±8.63 23.33±6.94 30.83±13.74 B3 2.09±0.33 1.75±0.19 1.49±0.36 45.00±10.69＃＃ 67.50±11.34 33.13±14.1323.33±7.07 27.19±5.85 13.33±10.04 B4 1.92±0.19 1.46±0.66 0.97±0.74 28.75±6.94 50.00±18.90 0.00±0.00 21.04±3.56＃ 23.39±10.45 0.00±0.00

 

3 讨论

DNA甲基化能够导致植物表观形态改变，形成可遗传的表型性状［4］。DNA甲基化水平的升高或降低对植物的一些重要性状会产生极为重要的影响。非生物胁迫能够造成全基因组或特定位点胞嘧啶甲基化水平的升高或降低［3，5］，甚至会影响到植物的免疫抗性［6］。

二十多年来，一杭一直渴望找到父亲，并对他寄予了太多的理想色彩，没想到，他竟然是一个杀人犯，而且差一点要了自己的命，真是讽刺，太讽刺了。他拼命灌自己的酒。“这怎么可能呢？你是想在杀我之前给我开一个玩笑吧？”一杭端起酒杯又灌了一杯。

5－azaC是一种研究和应用较多的DNA甲基化抑制剂，可以降低基因组甲基化水平［7］。5－azaC还可发挥植物生长调节剂效应，诱导植物开花［8－9］。研究表明，5－azaC使紫花苜蓿幼苗高度和干质量、鲜质量降低［10］，虽未发现基因甲基化状态明显改变，但高浓度的5－azaC会抑制愈伤组织的增殖和再分化［11］。本研究结果也表明，添加5－azaC使无菌苗根长和单株平均鲜质量下降，但未达到显著差异水平；而在离体组织培养中，愈伤诱导率随5－azaC添加浓度的增加而逐渐降低，甚至呈现出极显著差异，支持Brown等的结论［11］。

为更加直观地了解算法运行结果，另取标准遗传算法定网格密度，其余参数均取相同。适应度成长曲线对比见图8，算法最终寻优结果对比见图9。

姜黄素（curcumin）对 DNA甲基转移酶 1（DNA methyltransferase，DNMT1）有明显的抑制作用，是最新发现的一类甲基化抑制剂，用于白血病细胞株系基因组DNA的研究，发现浓度为3.0～30.0μmol／L的姜黄素可导致 DNA甲基化水平降低15%～20%［12］，此外姜黄素具有清除自由基、抑菌抗炎、抗增殖、抗肿瘤等广泛的药理作用［13－14］。本研究结果表明，低浓度姜黄素可提高苜蓿种子发芽率，也可提高离体子叶和下胚轴的愈伤诱导率，但随姜黄素添加浓度升高愈伤诱导率急剧下降，至浓度升高到100μmol／L时，完全不形成愈伤；同时添加姜黄素使苜蓿无菌苗根长和鲜质量随其添加浓度增加而迅速下降，甚至达到显著或极显著差异水平。

甘露醇（mannitol）常被用作组织液吸收剂，作为植物组织或细胞培养的水分胁迫因子，是一种植物组织相容性物质。有研究发现，甘露醇处理能明显地提高大麦花粉粒存活率和质量，有利于进一步分裂形成愈伤组织和胚状体；还能明显提高大麦花药培养愈伤组织诱导率、绿苗分化率及绿苗产量［15－18］。植物组织培养中添加一定浓度的甘露醇可以抑制植物的生长，高渗透胁迫能够影响植物DNA甲基化状态［19］，甘露醇处理影响DNA甲基化水平和模式改变，呈现表观遗传变异。有研究表明，甘露醇处理使拟南芥幼苗基因组DNA的甲基化状态发生了不同程度的变化，50～200 mmol／L甘露醇可使拟南芥基因组CCGG位点发生双链半甲基化（mCCGG）以至双链全甲基化（CmCGG），浓度375 mmol／L以上甘露醇处理组幼苗全部死亡［20］。本研究结果也显示，添加甘露醇使苜蓿种子发芽率、无菌苗根长、单株鲜质量和干质量呈下降趋势，但只有单株鲜质量有统计学意义；高浓度的甘露醇还可极显著降低苜蓿下胚轴的愈伤形成，对苜蓿子叶影响较为温和。

由此可见，3种甲基化抑制剂均可不同程度地对苜蓿种子的萌发、无菌苗的生长以及愈伤组织形成产生抑制效应，其中高浓度姜黄素对苜蓿无菌苗的生长以及外植体愈伤诱导的抑制效应最为突出，然而其低浓度又对苜蓿种子的萌发和外植体愈伤的诱导表现某种程度的促进作用。

轴向输出线极化TE11同轴波导模式相对论磁控管的粒子模拟研究 史迪夫，钱宝良，王弘刚，等020501(6)

参考文献：

［1］Finnegan E J，Kovac K A.Plant DNA methyltransferases［J］.Plant Molecular Biology，2000，43（2／3）：189－201.

［2］Finnegan E J，Peacock W J，Dennis E S.DNA methylation，a key regulator of plant development and other processes［J］.Current Opinion in Genetics＆Development，2000，10（2）：217－223.

［3］Bender J.DNA methylation and epigenetics［J］.Annual Review of Plant Biology，2004，55（1）：41－68.

［4］Chwialkowska K，Nowakowska U，Mroziewicz A，et al.Waterdeficiency conditions differently modulate themethylome of roots and leaves in barley（Hordeum vulgare L.）［J］.Journal of Experimental Botany，2016，67（4）：1109－1121.

［5］Lukens L N，Zhan S H.The plant genomesmethylation status and response to stress：implications for plant improvement［J］.Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：317－322.

［6］Deleris A，Halter T，Navarro L.DNA methylation and demethylation in plant immunity［J］.Annual Review of Phytopathology，2016，54（1）：579－603.

［7］Baubec T，Pecinka A，Rozhon W，et al.Effective，homogeneous and transient interference with cytosinemethylation in plant genomic DNA by zebularine［J］.Plant Journal，2009，57（3）：542－554.

［8］Burn J E，Bagnall D J，Metzger J D，et al.DNA methylation，vernalization，and the initiation of flowering［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1993，90（1）：287－291.

［9］李梅兰，曾广文，朱祝军.5－氮胞苷（5－azac）和赤霉素（GA3）对白菜开花的影响［J］.上海交通大学学报（农业科学版），2002，20（2）：125－128，136.

［10］Al－Lawati A，Al－Bahry S，Victor R，et al.Salt stress alters DNA methylation levels in alfalfa（Medicago spp）［J］.Genetics and Molecular Research，2016，15（1）：15018299.

［11］Brown P T，Yoneyama K，Lorz H.An investigation into the role of 5－azacytidine in tissue culture［J］.Theoretical and Applied Genetics，1989，78（3）：321－328.

［12］Liu Z，Xie Z，Jones W，et al.Curcumin is a potent DNA hypomethylation agent［J］.Bioorganic＆ Medicinal Chemistry Letters，2009，19（3）：706－709.

［13］Menon L G，Kuttan R，Kuttan G.Inhibition of lung metastasis in mice induced by B16F10melanoma cellsby polyphenolic compounds［J］.Cancer Letters，1995，95（1／2）：221－225.

［14］LiW J，Pung D，Su Z Y，et al.Epigenetics reactivation of Nrf2 in prostate TRAMP C1 cells by curcumin analog FN1［J］.Chemical Research in Toxicology，2016，29（4）：694－703.

［15］郭向荣，方红曼，李安生，等.甘露醇预处理方式、方法对大麦花粉植株再生的影响［J］.农业生物技术学报，1999，7（4）：321－324.

［16］李文泽，景健康，姚根怀，等.基因型和甘露醇预处理对大麦花粉植株高频率再生的影响［J］.科学通报，1992，37（10）：935－938.

［17］CistuéL，Ramos A，Castillo A M，et al.Production of large number of doubled haploid plants from barley anthers pretreated with high concentrations ofmannitol［J］.Plant Cell Reports，1994，13（12）：709－712.

［18］刘 辉，卢翠华，邸 宏，等.甘露醇预处理对马铃薯花药愈伤诱导率和褐化率的影响［J］.中国马铃薯，2009，23（1）：19－21.

［19］Tan M P.Analysis of DNA methylation of maize in response to osmotic and salt stress based on methylation－sensitive amplified polymorphism［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（1）：21－26.

［20］杜亚琼，王子成.甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响［J］.植物学报，2011，46（3）：285－292.