葡萄生单轴霉［Plasmopara viticola（Berk et Curtis）Bert.et Toni］引起的葡萄霜霉病（Grape Downy Mildew）是普遍发生且危害严重的葡萄病害，几乎发生于全世界的葡萄栽培区，已成为葡萄生产上的重大病害［1］。该病在我国广泛分布，严重流行时可造成叶片干枯、易早期脱落，枝梢扭曲，严重影响果品［2］。一直以来在生产上使用农药防治该病，但农药的持续大量施用，致使病原菌产生抗药性，防治效果下降，并对人畜健康和生态环境造成危害。因此寻找一种对人畜安全、对环境友好的有效防治途径十分重要，生物防治恰恰符合这一需求。

放线菌作为生防因子广泛应用于植物病害防治中，其分泌的如抗生素、酶等其它代谢产物为放线菌开发和利用的方向之一。植病生防菌能在生产上得以应用，要经历诸多因素的考验，在菌株发酵之后，抑菌物质的有效提取、纯化精制以及剂型加工等过程中要受到外部环境如酸碱度、温度、光照、贮藏等条件的影响。本试验以筛选出的生防放线菌QH94为研究对象，确定其抑菌物质的产生位置（胞内或胞外），研究发酵滤液的酸碱稳定性、热稳定性、光稳定性、以及耐储藏性，并以葡萄霜霉病菌为靶标，测定抑菌粗提物的活性，以期为菌株QH94田间防效试验和抑菌活性成分的分离鉴定提供基础依据。

这十年的时间里，王宝生因为长期居住在这种潮湿环境当中，他患上了风湿关节炎和腰间盘突出，但他并没有因此放弃也没有因此偷懒，清理防火线的杂草和落叶也是王宝生的一项重要工作，几乎每隔几天他就会拿起扫把沿着近两公里的防火线进行清扫。在中军帐景区内有七棵古树是“文物级”的宝贝，一旦下雪，王宝生也会下山及时清理松枝上的积雪。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

放线菌QH94：2014年5月分离自辽宁省农业科学院葡萄园土壤中。

葡萄霜霉病菌（P．viticola）：葡萄叶片上保存。

1.1.2 供试培养液

新时代党和国家监督体系中的审计监督内在地要求创新审计监督体制，提升审计监督的权威性、独立性和法治性。其行动路向是进一步加强党对审计监督工作的全面领导，坚持依法独立审计。同时，切实强化审计信息公开，维护公众的信息知情权。此外，要扩大公众参与，拓宽民主参与渠道，增强审计监督合力。最后，还要进一步加大审计监督与问责力度，提升审计监督工作的公信力。

大豆粉培养液：大豆粉5 g；酵母膏5 g；蛋白胨 5 g；牛肉膏5 g；NaCl 5 g；葡萄糖5 g；可溶性淀粉5 g；甘油 5 g，蒸馏水 1 000 ml；pH 7.2～7.4。

发酵培养液：葡萄糖5 g；牛肉膏7.5 g；KNO3 2.5 g；NaCl 2.5 g；蒸馏水 1 000 ml；pH 7.0。

1.1.3 供试试剂

由图6可知，菌株QH94发酵滤液在4℃条件下可以稳定保存60 d，与未处理相比抑菌率几乎不变，贮存90 d时抑菌率约86%，下降了4%，但抑菌活性依然较高。室温条件下发酵滤液保存7 d后，抑菌率仍与对照几乎一致，由此可知其抑菌物质7 d内可保持相对稳定的状态。15 d后，抑制作用逐渐下降，90 d后降低至78%，说明室温条件不利于滤液的保存。

1.2 试验方法

墩台的垂直度是施工的关键，首先要在已完成的承台顶面将墩柱中心点及四角点实施放样，在墩柱边线外侧20cm位置设平行线，墩台垂直度偏差不得超过墩台高度的0.2%，高墩柱垂球受风力影响较大，每滑升1m施工人员采用垂球对模板四面进行一次中心垂直度校正。对滑升中出现的偏斜立即查明原因。纠正偏重可将较低侧千斤顶相对提高3cm后逐步纠正，避免产生明显的扭曲。

1.2.1.1 QH94发酵液的制备

河道中底质主要是淤泥，是污染物比较聚集的地方，常规情况下淤泥自身也具有净化水体的功能，但如果污染物沉积过多，会导致淤泥成为富污染物场所，对水体造成严重的污染。河流底质改善技术可以对淤泥的这种污染情况加以控制，可应用的技术方法包括2种：（1）河道底质清除技术，此技术的应用是将河道中污染最严重的淤泥清除，以避免其引发二次污染；（2）生态修复技术，河道中的淤泥生态特性对河流生态环境有一定影响作用，因此，可对河流底质泥土的功能进行调整。

将QH94在高氏Ⅰ号培养基上活化，27℃下培养4 d。用接菌环挑取活化后菌株接入大豆粉培养液中，27℃下150 r／min振荡培养3 d，制成种子液。将5.5 ml种子液接入装液量110 ml的250 ml三角瓶中，27℃下150 r／min振荡培养6 d，备用。

1.2.1.2 QH94胞内物质制备

1.2.2.5 QH94发酵滤液贮藏的稳定性

将QH94的发酵液于10 000 r／min，4℃下离心30 min，保存上清液，收集沉淀（即 QH94菌体）。用3倍菌体体积的乙醇重悬浮，超声波破碎25 min，该过程应在冰浴中进行。再10 000 r／min离心 30 min，收集上清液，将其浓缩后溶于无菌水，备用。

1.2.1 抑菌物质存在位置确定

取11份QH94发酵滤液（发酵结束时pH值为5.0），各30 ml，分别用1 mol／L HCl和 1 mol／L NaOH调 pH至 2.0、3.0、4.0、6.0.7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，于4℃静置2 h后，调回至原始pH值为5.0，通过离体叶片防效试验测定QH94发酵滤液对不同pH值的稳定性，方法同1.2.1.4，以大豆粉培养液作空白，计算抑菌率。

用细菌滤器（Φ＝0.45μm）将上述保存的发酵上清液过滤，即为无菌滤液，备用。

(2) 连拱段中隔墙上方岩体所受压应力最大，考虑到现场爆破开挖对该部分岩体的多次扰动，可以确定中隔墙上方岩体为整个连拱隧道的薄弱部位，所以中导洞开挖时应重视超前小导管施作的及时性，以加固中隔墙上方岩体。

1.2.1.4 QH94胞内物质、发酵滤液对霜霉病菌的抑菌活性检测

叶龄及叶片大小一致的健康叶片为试验材料，无菌水洗净后晾干，叶背向上置于放有湿润滤纸的培养皿中，叶柄用湿润脱脂棉包被。将配制好的孢子囊悬浮液（105个／ml）喷布于叶背，24 h后每片叶喷施菌株QH94胞内代谢产物水溶液1 ml，培养皿密封，置于22℃下，12 h光暗交替培养7 d。以无菌水作对照，每个处理10片叶，3次重复，计算抑菌率。同上方法将菌株QH94无菌发酵滤液喷于处理好的叶背，以大豆粉培养液作对照检测发酵滤液的抑菌活性。

◆参加学术会议，先看地点是否有吸引力；无论会期长短，经常要在一天内解决问题，其他时间则用于“考察”、“参观”.上网浏览一下，某些会议的征稿通知已经明码标价给出了“主席台就座”、“大会发言15分钟”各需资助多少钱.

 

1.2.2 QH94发酵滤液稳定性的测定

1.2.2.1 QH94发酵滤液对酸、碱的稳定性

“互联网＋”概念是由2012年易观国际提出，其核心理念是将互联网技术与工业及服务业相融合，其关键是创新[13]。“互联网＋”通过发挥在生产要素配置中的优化和集成作用，提升实体经济的创新生产力[14]。2015年3月，李克强总理在政府工作报告中首次提出“互联网＋”行动计划，要求利用互联网技术带动传统产业升级创造新业态。目前“互联网＋”作为一种创新的信息技术手段，已经渗透到各领域产业，与其他产业的融合不仅是现代产业体系的结构特征，也是现代产业升级发展的趋势。

1.2.1.3 QH94发酵滤液的制备

1.2.2.2 QH94发酵滤液对温度的稳定性

取7份QH94发酵滤液，各30 ml，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下恒温处理60 min，冷却至室温后，测定其对不同温度的稳定性，方法同上。

1.2.2.3 QH94发酵滤液对紫外光的稳定性

取7份QH94发酵滤液，各30 ml，距30 W紫外灯15 cm，分别照射2、4、6、8、10和12 h，测定其对紫外光的稳定性，方法同上。

1.2.2.4 QH94发酵滤液对日光的稳定性

取6份QH94发酵滤液，各30 ml，阳光下分别照射 6、12、24、48、72、96和 120 h，测定其对日光的稳定性，方法同上。

临安区地处浙江省西北部，位于东经118°51′—119°52′、北纬29°56′—30°23′，区域面积3 124 km2，辖26个乡(镇)街道。气候属亚热带湿润季风区，温暖湿润，光照充足，雨量充沛，四季分明。年均降水量1 613.9 mm，全年无霜期237 d。境内以丘陵山地为主，地势自西向东南倾斜，立体气候明显，从海拔不足50 m的锦城至1 500 m的天目山顶，年平均气温由16 ℃降至9 ℃，年温差7 ℃，相当于横跨亚热带和温带2个气候带[5]。

取12份QH94发酵滤液，各30 ml，分成两组，分别在4℃和室温（25℃）条件下储藏1、7、15、30、60和90 d，测定其耐贮藏性（4℃处理需恢复至25℃后再测定），方法同上。

上述各稳定性测定时，设未处理的发酵滤液作为对照，3次重复。

1.2.3 QH94抑菌发酵滤液的溶解性

经过紫外光照射不同时间的处理，发酵滤液的抑菌作用产生了变化。抑菌率随着处理时间的延长而下降，处理10 h后开始显著下降，12 h后抑菌率为80%，与未处理（90.37%）相比下降了11.48%（图4）。

以葡萄霜霉病菌为靶标菌，方法同1.2.1.4，分别测定有机相和水相的抑菌活性，设二甲基亚砜和培养液作对照，3次重复。

2 结果与分析

2.1 抑菌物质存在位置的确定

试验结果如图1所示，菌株QH94胞内物质对葡萄霜霉病菌的抑菌率为11.46%，而发酵滤液的抑菌率达90.37%，由此可见，菌株QH94的抑菌物质主要存在于胞外，属于次级代谢产物。此外，试验中菌株QH94的菌体本身对葡萄霜霉病菌也具有一定的抑菌活性，可能是因为菌体中还有少量的次生代谢产物，或是由于菌体自身及某种成分对葡萄霜霉病菌起到微弱的抑制作用。

APDL是ANSYS Parametric Design Language的缩写，即ANSYS参数化设计语言。它是类似FORTRAN的一种解释性语言，只能在ANSYS环境中运行，主要包括参数、矩阵操作、数组、流程控制、重复功能和缩写功能、宏文件以及用户子程序等程序设计语言以及1 000多条ANSYS命令。利用APDL语言编写了关于薄壁空心高墩从建模到网格划分，从热分析到结构分析的程序命令流，主要包括：

  

图1 QH94抑菌物质的存在位置Figure 1 The location of antifungal substances of strain QH94

2.2 QH94发酵滤液对酸、碱的稳定性

由图2可知，菌株QH94发酵滤液对酸的稳定性较好，与原始发酵滤液（即pH值为5.0）相比，对霜霉病菌的抑菌作用几乎不变。pH值为2.0～5.0时，抑菌率均在90%以上。发酵滤液经碱处理后，抑菌活性呈现出降低趋势，pH值为12.0时，抑菌率为66.67%，所以发酵滤液碱稳定性相对较差。

在继电保护技术应用在智能电网的建设当中时，必须要对多个问题来进行考虑，从根本上实现继电保护技术在智能电网建设中的应用。

2.3 QH94发酵滤液对温度的稳定性

如图3，QH94发酵滤液热稳定性很强。与对照（室温25℃）相比，处理温度在20～100℃之间，发酵滤液的抑菌活性变化不明显，均达86%以上。但试验发现，10℃低温处理后其抑菌率明显下降，说明低温（低于10℃）不利于抑菌物质作用的发挥。

2.4 QH94发酵滤液对紫外光的稳定性

按照极性由小到大的顺序，分别选取石油醚、四氯化碳、二氯甲院、乙酸乙酯、丙酮、甲醇作为溶剂，将菌株QH94发酵滤液与各有机溶剂等体积混合装入三角瓶中，用摇床振荡12 h，再移入分液漏斗中静置过夜，分别取有机相和水相。发酵滤液加入丙酮后产生沉淀，需加入一定量的无菌水稀释后作为水相进行测定。由于甲醇与发酵滤液互溶不分层，将二者混合水相与其余有机相分别用旋转蒸发仪在60℃，30 r／min下，蒸发浓缩除去溶剂，再用5%二甲基亚砜溶解，加入一定量的无菌水，-20℃保存。

2.5 QH94发酵滤液对日光的稳定性

图5可以看出，发酵滤液在12 h内，对日光不敏感，对葡萄霜霉病菌的抑制活性几乎未发生变化。日光处理24 h抑菌率下降，但降幅小，直至到36 h；而从48 h开始，抑菌率明显逐步下降，处理120 h后为82.22%。

新预算法的推进和实施，是对我国近来年财务预算管理问题的一次总结和归纳，有针对性的对财务预算管理曾出现的问题做出了解释、回答并给出了真实有效的管理办法和约束性的法规。因此，事业单位需要严格依照新预算法的相关内容，在深入了解和认识自身的预算体系和具体情况后进行改革和完善，强化财务管理力度，提高行政事业单位财务的透明化水平。这样一来，才能对事业单位的资金、人力以及物力进行高效的配置和运用，最大限度发挥政府资源的公共效益，更好的为国家和人民群众服务。

2.6 QH94发酵滤液的耐贮藏性

1 mol／L NaOH溶液，1 mol／L HCl溶液，5%二甲基亚砜。

2.7 QH94发酵滤液抑菌物质的溶解性

经试验测定（表1），与石油醚、四氯化碳、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取后的有机相中均无抑菌活性，水相抑菌率则在89.25%～90.10%之间。丙酮处理产生的沉淀中有少量的抑菌物质存在，其上清液的抑菌率与各上述水相相当。而甲醇处理后的防效为86.61%，与未处理滤液（90.37%）相比活性物质略有损失，可能甲醇对抑菌物质造成了一定的影响。以上结果表明菌株QH94抑菌物质极性较强，可能为亲水类物质。

  

图2 不同pH值对发酵滤液抑菌活性的影响Figure 2 The effect of different pH value onantimicrobial activitity of fermentation filtrate

  

图3 温度对发酵滤液抑菌活性的影响Figure 3 The effect of different temperature onantimicrobial activitity of fermentation filtrate

  

图4 紫外光对发酵滤液抑菌活性的影响Figure 4 The effect of UV light on antimicrobial activitity of fermentation filtrate

  

图5 日光对发酵滤液抑菌活性的影响Figure 5 The effect of sunlight on antimicrobial activitity of fermentation filtrate

  

图6 贮藏时间对发酵滤液抑菌活性的影响Figure 6 The effect of storage time on antimicrobial activitity of fermentation filtrate

 

表1 不同有机溶剂中QH94抑菌物质活性的测定Table 1 The antimicrobial activitity of QH94 in different organic solution

  

Extractant Inhibition rate（%）Organic phase Water phase Extractant Inhibition rate（%）Organic phase Water phase石油醚 0 90.00 乙酸乙酯0 89.25四氯化碳 0 89.64 丙酮85.70 27.02二氯甲烷 0 90.10 甲醇-86.61

3 结论与讨论

利用生防菌防治葡萄霜霉病方面已有报道。甲基营养型芽孢杆菌T3对葡萄霜霉病菌室内离体叶片的抑制率高达100%，其发酵滤液田间防效显著高于烯酰吗啉［3］。芸苔链格孢菌6Y1为杨树内生真菌，其菌丝及发酵液对葡萄霜霉病均有防治作用，且菌丝的防治效果更佳，其浓度与防治效果正相关［4］。暗黑链霉菌PY-1发酵液稀释700倍液的田间末期防效与甲霜锰锌1 000倍液防效相当，其产生的抑菌活性物质PY-7-1经鉴定为5-Acetoxycycloheximide，PY-7-2经鉴定为 Cycloheximide［5］。从一株生防解淀粉芽孢杆菌发酵液中，筛选出与其防治葡萄霜霉病机制相关的2种氨基肽酶家族蛋白和6种参与几丁质代谢的蛋白［6］。枯草芽孢杆菌PT4对葡萄霜霉病菌有拮抗作用，而激光诱变得到的PT46拮抗效果更强［7］。经室内叶盘漂浮法测定，多粘类芽孢杆菌PB-2发酵液及发酵滤液对葡萄霜霉病有防治效果，田间试验证明其可湿性粉剂具有良好的应用前景［8］。放线菌是最早被用于植物病害防治的一类微生物，因其高效、安全、对环境友好、符合绿色农业发展要求而被广泛开发与应用。生防菌的抑菌作用受诸多因素影响，除受环境条件影响外，与其在自然条件下抑菌物质的产生和在植物体内的传导方式等生防机制密切相关［9～10］。在放线菌产生的11 000多种生物活性物质当中［11］，部分在生产应用中性质并不稳定，如大环内酯类抗生素等。

本研究确定了QH94抑菌物质的存在部位，对葡萄霜霉病菌抑制作用其发酵滤液明显高于菌体，表明活性物质属于胞外次级代谢产物。菌株QH94发酵滤液稳定性研究结果显示，酸碱度、温度、光、贮藏条件及时间对其抑菌活性有不同程度的影响。发酵滤液具有很强的热稳定性、耐酸性，在20～100℃，pH值为2.0～5.0条件下，发酵滤液的抑菌活性变化不明显，均在86%以上，但10℃低温和碱性条件不利于抑菌物质能力的发挥。发酵滤液在处理时间逐渐延长时，对光便更加敏感，表现出抑菌率的下降，但对日光的稳定性相对紫外光较好。与室温条件下保存发酵滤液相比，4℃条件下的耐贮藏性更好，可保存长达60 d。同时，室温条件下发酵滤液可稳定保存7 d的试验结果可推测，日光处理48～120 h后抑菌活性的降低不是放置时间过长造成的，日光的影响才是主效因素。并且室温条件下可稳定保存7 d左右，说明日光处理48～120 h抑菌能力的下降不是日光下放置时间过长造成的。发酵滤液中的抑菌物质的溶解性可为该菌株抑菌物质的分离纯化提供一定的依据。其难溶于石油醚、四氯化碳、二氯甲烷、乙酸乙酯，可存在于丙酮、甲醇中，说明该活性物质为水溶性，无法采用萃取的方法分离菌株QH94的抑菌物质。由于葡萄霜霉病菌为专性寄生菌，本试验采用离体叶片为试验材料，因此对溶解粗提物溶剂的选择有两个附加要求，即不伤害葡萄叶片和不影响葡萄霜霉病菌。5%二甲基亚砜用于葡萄霜霉病菌的活体保存，并可直接喷雾接种于叶片上［12］，所以可采用二甲基亚砜为粗提物溶剂。

参考文献：

针对综合课程设计教学过程中出现的上述问题，笔者认为，综合课程设计教学中应充分体现 “以学生为中心”的教学模式，在具体实施过程中采用任务型教学法和讨论法相结合的教学方法，探索实践环节过程管理与考核结果并重的综合成绩评定方法，充分调动学生的积极性、能动性和团队合作精神，重视学生工程实践能力和团队合作能力的培养。

［1］ 董金皋.农业植物病理学［M］.北京：中国农业出版社，2001.

［2］ 赵奎华，陶承光，刘长远，等.葡萄病虫害原色图鉴［M］.北京：中国农业出版社，2006.

［3］ 康兴娇，申红妙，贾招闪，等.葡萄霜霉病生防菌甲基营养型芽孢杆菌T3的鉴定及其防治效果［J］.中国生物防治学报，2016，32（6）：775～782.

［4］ 李雯.葡萄霜霉病拮抗菌和抗生素筛选及其防治效果的研究［D］.保定：河北农业大学，2015.

［5］ 梁春浩.葡萄霜霉病生防放线菌PY-1鉴定一抑菌活性物质结构解析［D］.沈阳：沈阳农业大学，2016.

［6］ 郭继平，马光，王志杰，等.一株解淀粉芽孢杆菌生防蛋白的鉴定及分析［J］.生物技术通报，2018，34（1）：202～207.

［7］ 付瑞敏，韩鸿鹏，张丽琴，等.葡萄霜霉病和白粉病拮抗菌的分离、鉴定和 He-Ne激光诱变［J］.江苏农业科学，2013（8）：122～125.

［8］ 扈进东，吴远征，李纪顺，等.拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2及其制剂对葡萄霜霉病的防效测定［J］.山东科学，2014，7（3）：30～33.

［9］ Sandy S.Biology and management of diplodia（Stenocarpellamaydis）ear and stalk rot［J］.Journal of Natural Rescources and Life Sciences Education，2003（32）：5～7.

［10］ Whipps JM.Microbial interations and biocontrol in the rhizosphere［J］.Exp Bot，2001（52）：487～511.

术后14 d内进行标本采集，闭合性脓肿用无菌注射器抽吸脓液进行培养，表浅或创面较大的伤口经局部消毒后用肉汤拭子采集脓性分泌物。病原学分析按《全国临床检验操作规程》进行，使用DADE BEHRING专用细菌鉴定药敏复合板。

［11］ Berdy J.Bioactive microbial metabolites，a personal view［J］.The Journal of Antibiotics，2005，58（1）：1～26.

［12］ 杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究［D］.河北农业大学，2008.