羊泰勒虫病(Ovine and Caprine Theileriosis)是由泰勒科泰勒属原虫引起的重要的蜱传性血液原虫病之一。泰勒虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，能引起山羊和绵羊发热、贫血和黄疸等临床症状，使患羊发育迟缓，产肉量和产毛量显著下降，严重者可引起羊大量死亡而阻碍养羊业的发展[1-2]。国内外已报道寄生于羊的泰勒虫有6种，分别为致病力较强的莱氏泰勒虫(Theileria lestoquardi)、吕氏泰勒虫(T.luwenshuin)和尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)，以及对羊致病力很弱或无致病性的绵羊泰勒虫(T.ovis)、分离泰勒虫(T.separata)和隐藏泰勒虫(T.recondita)[3-7]。目前，泰勒虫病的诊断主要包括显微镜检查、血清学检测等方法，但均存在不同程度漏检或假阳性率高等缺点[8-9]。随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应(PCR)以其所具有的敏感性高、特异性强等特点，已成为能够快速准确检测病原并得到广泛应用的分子生物学诊断工具之一。本研究以羊吕氏泰勒虫的18S rRNA基因为靶序列，设计特异性引物，建立了诊断羊吕氏泰勒虫病的PCR检测技术，可为羊吕氏泰勒虫病的快速诊断及流行病学调查提供更准确、更可靠、更敏感的技术方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒购于上海莱枫生物科技有限公司；DNA Marker DL2000、LA Taq DNA聚合酶、基因工程菌大肠杆菌DH5α、pMDTM18-T Vector Cloning Kit购自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit 、Genonmic DNA Purification Kit购于Promega公司。9700型PCR扩增仪购于Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统购于Syngene公司。

1.2 样品来源

从河南省宜阳县赵堡乡某绵羊养殖户，随机逐只颈静脉无菌采集2 mL血液样品，分别置于抗凝管内，编号、登记后置4 ℃冰箱保存待查。共采集76份绵羊血液样品。其中，2014年7月39份、2015年4月16份、2015年10月11份、2016年11月10份。部分羊表现消瘦、贫血、可视黏膜黄染等症状。羊吕氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫基因组阳性样品，均由河南农业大学寄生虫学教研室保存；绵羊泰勒虫由塔里木大学馈赠，尤氏泰勒虫由中国农业科学院兰州兽医研究所馈赠。

1.3 DNA的提取

所有样品基因组DNA按照哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)的说明书步骤提取DNA。

BMD提供了支持定理1中对函数进行A变换的算术运算[12]，如A(xi∧xj)通过算术与实现，A(xi⊕xj)通过算术异或实现，并且可以实现定义6中的“在A变换过程中利用幂等律抑制随机变量的指数成分”.对函数f的逻辑表达式实施相应的算术运算即可得到A(f)对应的BMD，将随机变量Xi的值代入，进行BMD求值[12]即可得到f的信号概率.BMD可以较高效率地表示和操纵类似于概率表达式的代数表达式，并且BMD求值的复杂度为线性复杂度[12]，因此本文在底层使用BMD表示概率表达式.

1.4 引物设计与合成

利用Clustal X 2.1序列分析软件，将GenBank中的羊吕氏泰勒虫18S rRNA序列(登录号：KC735166.1)与其他物种同源序列进行比对，用Primer Premier 5.0软件设计1对种特异性引物T.lu7F/T.lu7R，目的条带在羊吕氏泰勒虫18S rRNA序列(登录号：KC735166.1)的618～1 579 bp位置，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物见表1。

其次，要清塘消毒创优养殖环境。一般老鱼塘致病因子较多，应注重清塘杀菌防病，这是保证来年养鱼少生病的关键。应选择晴好天气进行清塘消毒工作。一种方法是干法清塘，即按每亩鱼塘用生石灰75～100kg或漂白粉3～4kg加水溶解，在全池均匀泼洒，泼洒后应让池塘曝晒几日，并用耙子全池耙动，以达到充分消毒防病的作用，还可以中和淤泥中的有机酸、硫化氢等，改变酸性环境，使淤泥呈弱碱性，有利于鱼类的生长繁殖；另一种方法是带水清塘，按每米水深每亩用生石灰130～150kg或漂白粉10～12kg溶化后全池泼洒。泼洒时要到边到位，尤其池塘四周容易忽视。

 

表1 吕氏泰勒虫 18S rRNA基因PCR扩增引物序列Table 1 Pairs of primers used for amplification of the 18S r RNA gene of T.luwenshuni

  

病原Pathogen引物Primers核苷酸序列Nucleotidesequences目的片段/bpTargetfragment吕氏泰勒虫T．luwenshuniT．lu7FT．lu7R5′⁃TGCTGCATTGCATCTTCT⁃3′5′⁃AGGGACGTAATCTGCACAAG⁃3′962

1.5 PCR反应体系及反应条件

[3] 李有全.我国羊泰勒虫的生物学特性研究[D].北京：中国农业科学院,2007.

1.6 最适退火温度的筛选

对羊吕氏泰勒虫阳性DNA进行温度梯度PCR扩增，温度梯度为51～61 ℃。根据不同退火温度下目的条带的亮度及有无非特异性条带及交叉二聚体进行综合分析，确定该反应体系的最适退火温度。

1.7 产物的回收、克隆及测序

用DNA凝胶回收试剂盒将PCR产物回收，将回收产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌DH50α感受态细胞中，经蓝白斑筛选得到阳性菌斑扩大培养，阳性菌液送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。应用DNAStar 8.0软件和BLAST工具将测得的核苷酸序列与GenBank中的相关序列进行同源性比较。

1.8 特异性试验

分别提取吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫的基因组DNA作为特异性试验的模板，按最佳反应体系及条件进行PCR扩增以检验所建立PCR方法的特异性。

1.9 敏感性试验

将测定的羊吕氏泰勒虫质粒作为标准模板DNA质量浓度(291.3 ng·μL-1)按1∶ 10比例连续稀释，按最佳反应体系及条件进行PCR扩增，检测最低DNA检测量。

有什么理？！谁不知道你是个无理也要搅三分的人。你说一条小沟从你田里过一下，你就漫天要价。对，我忘了问你，你想要多少？

1.10 重复性试验

应用建立的PCR方法对河南省宜阳县某养殖户散养的76份羊血样进行检测，并与YIN等[10]建立的常规PCR方法进行比较。检测结果通过测序排除假阳性。

1.11 临床样本检测

以羊吕氏泰勒虫阳性样品为模板，用优化好的PCR反应体系及条件进行不同批内、批间的重复试验，检验所建立方法的稳定性。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

羊全血基因组DNA经引物T.lu7F/T.lu7R扩增得到1条约962 bp的特异性条带(图1)，与预期目的片段大小一致。

  

M.DNA标准 DL 2000； 1～3.样品；4.阴性对照。 M.DNA Maker DL2000；1 to 3.Samples；4.Negative control.

 

图1 PCR扩增结果Fig.1 The results of PCR

2.2 最适退火温度的筛选

退火温度在51～61 ℃时均扩增出特异性目的条带，当退火温度在55 ℃时条带最亮。因此，以55 ℃作为PCR的最适退火温度(图2)。

 

M.DNA标准DL2000; 1. 51 ℃;2. 52 ℃;3. 53 ℃;4. 54 ℃;5. 55 ℃;6. 56 ℃;7. 57 ℃;8. 58 ℃;9. 59 ℃;10. 60 ℃;11. 61 ℃；12. 阴性对照。

M. DNA Maker DL2000; 1. 51 ℃; 2. 52 ℃;3. 53 ℃;4. 54 ℃;5. 55 ℃;6. 56 ℃;7. 57 ℃; 8. 58 ℃;9. 59 ℃;10. 60 ℃;11. 61 ℃；12. Negative control.

图2 温度梯度PCR扩增结果Fig.2 Results of PCR amplification by temperature gradient

2.3 序列测定及同源性分析

用所建立的PCR方法，通过对不同批内、批间的羊血液DNA样品进行检测， 重复性检测结果均一致，表明该方法具有良好的重复性和稳定性(图5)。

2.4 特异性试验结果

以T.lu7F/T.lu7R为引物进行PCR扩增后，羊吕氏泰勒虫基因组DNA出现962 bp左右的目的条带，而绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫均未出现条带(图3)。

我国教育事业发展“十三五”规划[1]提出要培养学生创新创业精神与能力,强化学生实践动手能力。然而,当前我国的高校教育模式仍然主要以老师讲,学生听的“灌输式”授课方式为主。这样的方式不利于大学生学习兴趣、思考能力、实践能力的培养以及创新意识的养成,尤其是对于工程学科。因此,改变传统的教学模式,尝试使用先进的教学手段建立更有效的教学模式具有十分重要的意义。本文在“汽车电子与仿真测试”这门实践性较强的课程教学中,探索采用活动引导式教学方法,引导学生主动参与到学习过程中,提高学习兴趣、认知能力和实践动手能力,促进学生综合素质的提高。

  

M. DNA标准DL2000；1. 吕氏泰勒虫；2. 绵羊泰勒虫；3. 尤氏泰 勒虫；4. 环形泰勒虫；5. 莫氏巴贝斯虫；6. 弓形虫；7. 双蒸水。 M. DNA Maker DL2000; 1.T.luwenshuni;2.T.ovis; 3.T.uilenbergi; 4.T.annulata;5.B.motasi; 6.T.gondii;7.ddH2O.

 

图3 引物特异性试验结果Fig.3 The specificity test results of the primers

2.5 敏感性试验结果

铁：为预防缺铁性贫血，妊娠期每天铁的推荐摄入量为：孕早期20毫克，孕中期24毫克，孕晚期29毫克。保证每天摄入红肉100-150克，每周摄入1-2次动物血和肝脏，每次20-50克。

 

M. DNA标准DL2000;1.291.3 ng·μL-1;2.29.13 ng·μL-1; 3.2.913 ng·μL-1;4.291.3 pg·μL-1; 5.29.13 pg·μL-1;6.2.913 pg·μL-1;7.291.3 fg·μL-1; 8.29.13 fg·μL-1; 9.2.913 fg·μL-1; 10.阴性对照。

M. DNA Marker DL2000;1.291.3 ng·μL-1;2.29.13 ng·μL-1; 3.2.913 ng·μL-1;4.291.3 pg·μL-1; 5.29.13 pg·μL-1;6.2.913 pg·μL-1;7.291.3 fg·μL-1; 8.29.13 fg·μL-1; 9.2.913 fg·μL-1;10.Negative control.

图4 引物敏感性试验结果Fig.4 The sensitivity test results of the primers

2.6 重复性试验结果

选取40份样品的PCR产物进行测序，通过BLAST检索，从GenBank上下载相关参考序列，然后利用Clustal X 2.1将测序所得基因序列与参考序列进行比对拼接；使用DNAStar 8.0软件中的MegAlign将所得序列与国内外参考序列进行同源性分析，同源性为99.4%～99.9%。

  

M. DNA标准DL2000；1-3.样品；4.阴性对照。 M. DNA Maker DL2000:1-3.Samples; 4. Negative control.

 

图5 PCR重复性试验结果Fig.5 The repeatability test results of the PCR

2.7 临床样品的检测

提取76份绵羊血液样品DNA为模板进行所建立的PCR方法和YIN等[10]常规PCR方法扩增，比较检测结果(表2)。本试验建立的PCR方法对羊吕氏泰勒虫的阳性检出率为77.63%(59/76)，高于YIN等建立的常规PCR方法检出率60.53%(46/76)。PCR扩增产物测序结果均为T.luwenshuni。

 

表2 河南省宜阳县绵羊临床血液样品检测结果比较 Table 2 Comparison of detection results of clinical blood samples in Yiyang county of Henan province

  

检测方法Detectionmethods阳性样本数/个Positivesamplenumbers总样本数/个Totalsamplenumbers阳性率/%PositiveratePCR(本试验)PCR(thestudy)597677．63常规PCR[10]ConventionalPCR[10]467660．53

3 结论与讨论

1)MASON在1914年首次描述了埃及绵羊的泰勒虫病，此后在非洲、欧洲和亚洲多个国家和地区均有该病的报道[11]。中国最早于1957年确诊了绵羊泰勒虫病。目前，四川、陕西、青海、甘肃、宁夏、内蒙古、新疆和河北等地均有羊泰勒虫病的报道[12-13]。该病主要呈地方性流行，发病率高达36%～100%，病死率高达17.8%～75.4%，给流行地区造成严重的经济损失[14-15]。在中国东南和中部地区，引起山羊和绵羊泰勒虫病的主要病原为吕氏泰勒虫，对养羊业造成严重的危害[16-17]。

对于我来说，群居生活是一件多么不适合和不理智的事情，因为我长时间的沉默无语和种种匪夷所思的行为造成了老师和其他同学的困惑和不安。

目前，血液涂片染色镜检法因其简便、快捷，仍然被广泛应用于血液原虫病的临床诊断中。但该方法要求操作人员具有扎实的寄生虫形态学知识和丰富的经验，当染虫率较低或隐性感染时常存在漏检、误检；人为因素如染料浓度、血涂片质量、染色时间等也影响染色效果[18-21]。目前，已有羊泰勒虫的多种血清学诊断方法被建立，但存在抗原来源不足、特异性和敏感性差等问题；当动物体内不存在病原，血清中依旧含有抗体时，易出现假阳性现象，阻碍了血清学检测方法的应用[22-23]。

2)本研究建立的PCR方法扩增得到的目的基因序列与GenBank中相关参考序列进行同源性比较，其同源性高达99.4%～99.9%；以羊吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫DNA基因组作为特异性试验模板进行扩增，仅羊吕氏泰勒虫基因组模板扩增出特异性条带。

用本研究建立的PCR方法和文献[10]报道的PCR方法分别对76份绵羊血液DNA样品进行检测，结果显示，本研究建立的PCR方法检测的阳性率为77.63%(59/76)，高于YIN等[10]PCR方法的检测结果(60.53%，46/76)；对PCR产物进行测序，2种PCR方法的检测结果均无假阳性，且保持一致。本研究建立的PCR检测方法DNA最低检测量为29.13 fg·μL-1，敏感性高于YIN[10]等建立的PCR检测方法(DNA最低检测量为1 pg·μL-1)，引物敏感性的不同可能是这两种PCR方法检测结果存在差异的主要原因。本研究建立了具有特异性强、敏感性高和重复性好等优点的PCR检测方法，对羊吕氏泰勒虫病的临床诊断、流行病学调查具有重要意义。

参考文献：

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对PCR反应体系中的酶、PCR Buffer、dNTP Mixture、引物的最佳量及最佳循环参数进行优化。PCR以T.lu7F/T.lu7R为引物，对羊全血DNA进行PCR扩增，反应体系为10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ plus)2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 4.0 μL，引物T.lu7F/T.lu7R (25 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，LA Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，用双蒸水补至25 μL。上述反应混合物于94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性30 s、55 ℃退火35 s、72 ℃延伸35 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，预扩增产物片段大小为962 bp。

[4] SCHNITTGER L,YIN H,JIANXUN L,et al.Ribosomal small-subunit RNA gene-sequence analysis of Theileria lestoquardi and a Theileria species highly pathogenic for small ruminants in China[J].Parasitology Research,2000,86(5):352-358.

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作为城市生态环境系统的有机组成部分，居住小区不仅是一个居住场所，更是一部人和自然和谐共生的感性与理性相融合的景观艺术作品.景观布局的构思与选取是体现居住小区景观布局技术含量和文化内涵的关键环节，直接影响到人们在居住区中的参与性和宜居评价，在住宅区小尺度空间的设计上更要注重景观布局的丰富性、灵活性[20].

[6] SCHNITTGER L,YIN H,GUBBELS M J,et al.Phylogeny of sheep and goat Theileria and Babesia parasites[J].Parasitology Research,2004,91(5):398-406.

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3.2.3 翻班与否 翻班护士的幸福感比不翻班护士要低，这可能是由于翻班护士工作时间相对不稳定，值夜班对护士体能要求相对较高，经常熬夜对人的身体健康影响较大，时常会感到精力不足。而且大部分中夜班护士需要独自当班，工作责任心更重，工作压力相对较大，从而影响了其主观幸福感。

[11] 卫九健.我国部分地区羊球虫种类及梨形虫病分子流行病学调查[D].郑州：河南农业大学,2013.

一类是相关关系，变量之间有一定的关系，但不能完全用函数来表达．例如人的体重y与身高x有关．一般来说，身高越高，体重越重，但不能用一个函数来严格地表示身高与体重之间的关系．

用紫外分光光度计测定提取的羊吕氏泰勒虫质粒标准模板质量浓度为291.3 ng·μL-1，D260/D280=1.89，说明所提取的DNA无蛋白和RNA污染。PCR可检测到羊吕氏泰勒虫DNA的最大稀释倍数为1×10-7，即最低可检测到29.13 fg·μL-1(图4)。

[12] 郭淑珍,马登录,杨树猛,等.中国北方地区羊泰勒虫病流行病学调查[J].中国兽医寄生虫病,2005,13(4): 15-17.

岩鹰飞落在不远处的一块凸石上，它皮肉坚硬，那枚竹叶镖只扎入一半，便卡在了它的胸前。它弯着脖子，不停地向下探着嘴巴，试图将镖啄下来，却如何也够不到。

[13] LI Y,GUAN G,MA M,et al.Theileria ovis discovered in China[J].Experimental Parasitology,2011,127(1):304-307.

[14] 李有全,彭欲率,刘志杰,等.中国部分地区羊泰勒虫病的流行病学调查及分类鉴定[J].中国农业科学,2012,45(16):3422-3429.

1.3 脊柱椎体骨折评价 研究对象行低剂量胸部CT检查，CT侧位定位像的扫描范围为T4椎体上缘至L4椎体下缘。将图像传输到PACS诊断工作站，由2名高年资放射科医师分别进行双盲法阅片；评估意见不一致时，由2名医师共同评估，取得一致性意见。在CT侧位定位像上，采用Genant半定量法[2]对T4～L4椎体进行骨折评价。根据塌陷椎体的压缩程度(与相邻正常椎体的高度相比)，将骨折分为1级(压缩20%～25%)、2级(压缩26%～40%)、3级(压缩大于40%)；正常为0级。

[15] LUO J,YIN H.Theileriosis of sheep and goats in China[J].Tropical Animal Health & Production,1997,29(S4):8-10.

做完这些，高潮感觉心中轻松了不少。他突然想到了“诗的妾”，这个时候，她应该到温州了吧？说不定，她已经从她老公的被窝里提溜出一个光溜溜的小三呢。想到这里，高潮迅速登陆QQ，却发现“诗的妾”的头像是灰色的。

[16] GE Y,PAN W,YIN H.Prevalence of Theileria infections in goats and sheep in southeastern China[J].Veterinary Parasitology,2012,186(3):466-469.

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高安方言中有一个最基本、最常用的程度副词“好(hou42)”，相当于普通话的“很”，既可以后接动词，也可以后接形容词。例如：

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