剑麻(Agave sisaiana Perrine)，又名菠萝麻、西纱尔麻、剑麻麻，是剑麻科剑麻属植物，亚热带多年生草本硬质纤维作物，原产于墨西哥的龙加丹半岛。在我国广东、广西、福建、海南有大面积种植，主要用于生产剑麻纤维。剑麻叶片抽取纤维后的液汁中含有甾体骨架成分剑麻皂苷(Tigogenin)，甾体皂苷是天然产物中一类重要的化学成分，有降血糖、祛痰、止咳、抗炎、抗癌等多种生物活性，是半合成四大甾体激素药物的主要原料之一[1-2]。因此，从植物中提取天然甾体皂苷具有广阔的前景。目前，剑麻皂苷的提取多采用发酵方法，破除坚厚的植物细胞壁，让依附在纤维素中的剑麻皂苷释放出来，该方法原料、试剂消耗较多，且产生大量的酸碱废水。近年来，超声辅助提取剑麻总皂苷的工艺和超临界CO2萃取剑麻中总皂苷的工艺也有报道[4-7]。采用纤维素酶解法-乙醇浸提法[8]，即用纤维素酶分解剑麻植物的坚硬细胞壁，用乙醇提取剑麻总皂苷，探讨最佳提取工艺，为纤维素酶解法提取剑麻的皂苷类化学成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 ZN-04A小型粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司)；TP-214电子天平(丹佛仪器(北京)有限公司)；RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；i5紫外可见分光光度计(济南海能仪器股份有限公司)；SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；HH-1数显恒温水浴箱(金坛市金南仪器制造有限公司)；数显酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.2 材料与试剂 剑麻采摘于海南师范大学桂林洋校区。洗净、阴干后放在干燥箱内37 ℃干燥后粉碎。

纤维素酶[安倍医疗器械贸易(上海)有限公司(MP Biomedicals)]；熊果酸[阿拉丁试剂(上海)有限公司]；乙醇、甲醇、冰乙酸、香草醛、高氯酸等均为国产分析纯；蒸馏水(实验室自制)。

1.3 方法

总而言之，教育方式及学生自身等因素导致医学生科研能力培养现状不容乐观，具体表现在以下几方面：（1）科研意识缺乏；（2）科研精神不足；（3）信息获取及利用能力匮乏；（4）科研选题能力差；（5）科研方法掌握不够；（6）论文撰写能力薄弱[2]。

四川省家庭服务行业协会还在筹备中，至今没有颁布行业规范和统一的服务质量标准，也没有制定统一的、符合家政服务特点的劳务派遣合同。

房产行业是当今社会的热门行业，随着房价的持续走高，人们对房子的质量及建设标准的要求越来越高。而在房产企业的运营中，房产测绘工作有十分重要的现实意义。测绘人员在进行房产测绘工作的过程中，通常会使用一些测绘工具或高科技仪器，从而保证测绘工作的顺利进行以及测绘成果的质量。房产测绘工作完成后，技术人员通过对所得数据信息的处理及分析，明确该处房产的管理权限，税收标准及产权拥有等情况[2]。另外，房产测绘工作还能为当地政府部门进行土地规划提供有效的数据参考。

1.3.2 纤维素酶解法提取单因素试验。影响纤维素酶解反应的主要因素包括酶质量浓度、酶解温度、pH、酶解时间及固液比等因素，针对其中一个因素，在保持其他因素相同的条件下进行单因素试验，考察单因素对剑麻总皂苷提取率的影响。

1.3.3 纤维素酶解法提取正交试验。选取单因素试验中对总皂苷提取率影响较大的因素进行正交试验，按照因素水平表设计，考察各因素对剑麻总皂苷的影响程度，优选最佳工艺条件。

1)通过顶煤结构钻孔探测、覆岩导水裂隙带观测、工作面地表钻孔深基点岩移及综放支架工作阻力实测，得到酸刺沟煤矿6上105-2工作面顶板结构特点及运动规律，冒采比0.87，直接顶悬顶距为11～13 m，顶煤超前冒落是矿压显现强烈、压架事故频发的主要地质原因。

1.3.4 工作曲线的绘制。准确称取熊果酸对照品0.010 0 g于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度(200 μg/mL)，摇匀。精确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL溶液分别置于7支磨口的具塞试管中，水浴挥干无水乙醇后加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，塞紧试管磨口塞，混匀。在70 ℃水浴中加热15 min使显色反应完全，冰水冷却10 min。加冰乙酸4 mL摇匀，随行试剂作空白。在545 nm测定吸光度[8]。熊果酸对照品加入量为x坐标，吸光度为y坐标，线性回归，得线性回归方程y=0.002 19x+0.000 91，R=0.998 16，线性范围0～240 μg。

提取率×100%

1.3.5 剑麻总皂苷含量的测定。准确吸取提取物的样品溶液0.2 mL于具塞磨口试管中，按“1.3.4”中显色方法操作，在545 nm测样品吸光度，计算提取率。

式中，C为样品溶液中总皂苷浓度(mg/mL)，V为样品溶液的总体积(mL)；W为剑麻粉末的质量(mg)。

2 结果与分析

推进辽东湾新区的县域经济发展，进一步支持乡村振兴战略；支持产业升级，积极争取各项优惠政策；通过专项补助资金及产业扶持资金等方式大力扶持企业发展，大力培植和壮大税源。统筹整合财政专项资金，积极争取国家项目资金支持；探索不同方式的融资模式，吸引更多金融资本，引领和带动更多的社会资本投向辽东湾新区建设。

2.1.1 酶的质量浓度对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻叶粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比为1∶20，pH 5.0，水浴酶解温度为50 ℃，酶解时间为100 min，纤维素酶质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，酶的质量浓度对剑麻总皂苷提取率的影响见图1。

图1 酶的质量浓度对提取率的影响 Fig.1 Effects of concentration of cellulase on extraction rate

当纤维素酶质量浓度在0.15～0.20 mg/mL，总皂苷的提取率达到最大值，酶浓度超过0.20 mg/mL剑麻总皂苷的提取率反而呈现下降趋势，原因可能是体系中过量的酶没有机会与底物反应，反而影响总皂苷提取。

2.1.2 酶解温度对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比为1∶20，pH 5.0，酶质量浓度为0.15 mg/mL，酶解时间为100 min，分别在40、45、50、55、60 ℃恒温水浴酶解，酶解温度对剑麻总皂苷提取率的影响见图2。

图2 酶解温度对提取率的影响 Fig.2 Effects of temperature of enzymatic hydrolysis on extraction rate

随酶解温度的提高，剑麻皂苷提取率增加，50 ℃时达到最高，继续提高酶解温度，提取率下降。其原因是温度超过50 ℃纤维素酶活性下降，细胞壁没有被完全分解，影响剑麻皂苷的浸出。最适宜的酶解温度是50 ℃。

2015年东京警视厅的数据显示，一年中有1.3998万人借钱，借出去的金额为688.7346万日元（约40万元人民币），归还率是78.6%，这一数据比2009年的64.3%有了很大进步。但是，也可以看出，超过20%的人，还是借钱没还。

2.1.3 溶液pH对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻叶粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比1∶20，水浴酶解温度为50 ℃，纤维素酶质量浓度为0.15 mg/mL，水浴酶解时间为100 min，调节溶液pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶解pH对剑麻总皂苷提取率的影响见图3。

图3 提取液pH对提取率的影响 Fig.3 Effects of pH on extraction rate

试验结果显示，溶液的pH对总皂苷提取率影响很大。当溶液pH在4.0～5.0时，总皂苷的提取率随着pH的升高而增加，在溶液pH为5.0时，总皂苷的提取率达到最大值。继续增加溶液的pH，总皂苷的提取率开始下降。可见最佳溶液pH为5.0。

2.1.4 酶解时间对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比为1∶20，pH 5.0，纤维素酶质量浓度为0.15 mg/mL，50 ℃恒温水浴酶解，酶解时间分别为30、60、90、120、150 min，纤维素酶酶解反应时间对剑麻总皂苷提取率的影响见图4。

图4 酶解时间对提取率的影响 Fig.4 Effects of time of enzymatic hydrolysis on extraction rate

方差分析表明，酶解液的pH、酶解温度对剑麻总皂苷的提取率影响极显著，酶解时间影响显著，酶质量浓度在选定的水平范围内影响不显著。

由此看来，肥料利用率、有机肥替代、减施增效等政策引导，使高能耗的复合肥产业面临转型，其结果将导致复合肥进入产业调整和行业“洗牌”，使钾肥等上游原料企业经受考验。

关于徐志摩，一般人印象深刻的无非是其才气和风流，其情商少有人提及。据说当年在上海，某次徐志摩到梁实秋家做客，两人下围棋。下至中盘，徐志摩已胜券在握，却借故离席……经此一事，梁实秋对徐志摩的为人敬佩不已。

2.1.5 固液比对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻叶粉末于50 mL圆底烧瓶中，在溶液的pH为5.0，水浴酶解温度为50 ℃，纤维素酶质量浓度为0.15 mg/mL，水浴酶解时间为100 min，固液比分别为1∶18、1∶20、1∶22、1∶24、1∶26，按“1.3.2”项下方法制备样品溶液，固液比对剑麻总皂苷提取率的影响见图5。

1.3.1 剑麻总皂苷的提取。准确称取剑麻的样品粉末0.500 0 g至50 mL的圆底烧瓶中，按一定的固液比加入蒸馏水，调节pH，加入纤维素酶，使酶的质量浓度达到控制值。将圆底烧瓶置于水浴锅中，在一定温度下酶解反应，反应结束后，移入80 ℃的恒温水浴锅中灭活30 min。离心分离酶解液，上层清液留用，下层的沉淀物用15 mL 95%乙醇在70 ℃恒温水浴回流浸提60 min后抽滤，滤液与酶解液合并，减压蒸干。移至100 mL容量瓶用甲醇溶解定容，即为提取物的样品溶液。

图5 固液比对提取率的影响 Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate

固液比在1∶18～1∶26对总皂苷提取率的影响较为平缓，考虑节省试剂及减少后续浓缩的能耗、工作量等因素，选取固液比1∶20。

2.2 正交试验优化提取工艺 为考察各个因素对总皂苷提取率的交互作用，选取单因素试验中对总皂苷提取率影响较大的酶质量浓度、酶解温度、酶解时间、酶解pH 4个因素进行考察，每个因素设3个水平，采用L9(34)正交设计表，正交试验的因素水平见表1，正交试验的结果见表2。

2.1 单因素试验

表1 正交试验因素与水平

Table 1 Factor and level of orthogonal test

水平Level因素FactorA酶质量浓度Enzymeconcentrationmg/mLB酶解温度Enzymolysisreactiontemperature℃C酶解时间EnzymolysisreactiontimeminD酶解pHEnzymolysisreactionpH10.15451004.520.18501105.030.20551205.5

表2 正交试验结果

Table 2 Results of orthogonal test

试验编号TestNO.ABCD提取率Extractionrate∥%1111114.812122210.853133317.094212319.175223110.136231214.087313217.268321315.989332110.04K142.7551.2444.8734.98K243.3836.9640.0642.19K343.2841.2144.4852.24k114.2517.0814.9611.66k214.4612.3213.3514.06k314.4313.7414.8317.41R0.214.761.615.75

正交试验结果显示，在选定的因素水平中，影响程度依次为：D>B>C>A，即酶解液pH>酶解温度 >酶解时间>酶质量浓度，极差分析中最佳提取工艺是A2B1C1D3，即酶质量浓度为0.18 mg/mL，酶解温度为45 ℃，pH 5.5，酶解时间为100 min，料液比1∶20。该条件在正交试验中没有出现，需验证。

随着酶解时间的增加，剑麻总皂苷提取率在增加，超过120 min时，提取率下降，这与黄山等[9]酶解法提取绞股蓝总皂苷的结果吻合。可能是随着酶解时间的增加，酶解液糊化，影响剑麻总皂苷提取。最佳酶解时间为90～120 min。

2.3 最佳工艺条件下验证试验 为确定最佳提取工艺的稳定性，在A2B1C1D3下平行做3次验证试验，提取率分别为19.21%、18.95%和19.45%，平均提取率19.20%。相对标准偏差RSD1.8%。

2.4 加样回收率精密度 为进一步验证方法的精密度，进行加标回收试验。分别吸取10、20、30、40、50 μL已知浓度的样品溶液，再加入0.1 mL熊果酸标准溶液，按标准曲线项下的方法测定其吸光度，并计算总皂苷浓度，以计算其回收率和回收率的相对标准偏差。结果见表3。

提升了教师的科研能力，促进教师课程开发的意识和能力培养.拓展性微课程的开发，使教师在专业发展中更加处于主动地位，进一步激发其研究自身专业的兴趣，研究与开发拓展性课程在学校、教师队伍中营造浓厚的教科研氛围，从而调动教师参与科研的积极性，最终达到提升其教科研水平的目的.课题组成员在研究期间，相关课题获奖1个，结题1个，子课题立项2个，研究成果在核心期刊发表4篇，论文获奖2篇，开设4节县、市级公开课，7次相关讲座.

加样回收率×100%

表3 加样回收率精密度

Table 3 Precision of recovery rate

序号Number加样量Additionμg加标量Additionalscalarμg测得值Measuredvalueμg回收率Recoveryrate%RSD%19.0720.0029.36101.0218.1320.0032.7085.8327.2020.0044.9095.3436.2620.0050.0088.9545.5520.0055.2084.5平均Average91.11.52

由表3可见，加标平均回收率为91.1%，相对标准偏差RSD为1.52%，因此可保证用该方法处理样品的误差小，试验可靠性高。

3 讨论

植物中的总皂苷等分布在植物的细胞壁内，细胞壁主要由纤维素构成。利用酶解反应的高效、专一性，选择纤维素酶解反应破坏细胞壁，以便提取皂苷类成分。剑麻总皂苷中含有多种甾体皂苷[10-11]，甾体皂苷极性大，因此，破壁后的酶解物用95%乙醇提取。提取物总皂苷测定时利用甾体皂苷在无水条件下，遇某些酸类可产生与三萜皂苷相类似的颜色反应，故用五环三萜类的熊果酸标准品作标准对照品，选用显色灵敏的香草醛-高氯酸反应，进行显色。因为要求无水条件下，所以选择极性比无水乙醇大的甲醇定容。

选取对酶解反应影响较大的酶解时间、酶解温度、酶的质量浓度、固液比、溶液的pH进行单因素试验，结果显示，除固液比外，其他4个因素对提取率的影响较大，固液比的影响较为平缓，因此，选固液比1∶20。正交试验极差分析及方差分析结果显示，对剑麻总皂苷提取率的影响顺序为酶解液pH>酶解温度 >酶解时间>酶质量浓度，酶解液的pH、酶解温度对剑麻总皂苷的提取率影响极显著，酶解时间影响显著，酶质量浓度在选定的水平范围内影响不显著。这与文献[12]的研究相吻合。

在优选出的最佳提取工艺下A2B1C1D3，即酶质量浓度为0.18 mg/mL，酶解温度为45 ℃，pH 5.5，酶解时间为100 min，料液比1∶20，验证试验剑麻总皂苷的平均提取率为19.20%。加标回收率显示，平均回收率在91.1%，RSD为1.52%，说明该方法比较准确，可用于皂苷类成分提取的检测。

纤维素酶解法提取剑麻总皂苷，绿色环保，可为纤维素酶解法提取剑麻总皂苷的工业化提供参考。

参考文献

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[2] 李作平，卫恒巧.甾体皂甙的生物活性[J].国外医药(植物药分册)，1996，11(2)：51-55.

[3] 韩耀玲.剑麻的综合利用[D].南宁：广西大学，2014：1-3.

[4] 李少亮.天然甾体皂苷的提取分离现状[J].辽宁化工，2010，39(4)：428-430.

[5] 周宁，赵晓璐，谢庆武.超声波辅助提取剑麻总皂苷的工艺研究[J].农产品加工，2016(8)：26-28，30.

[6] 邓楚津，聂芳红.超临界CO2萃取剑麻中总皂苷的工艺研究[J].食品研究与开发，2008，29(2)：41-44.

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[10] 丛浦珠，陈延镛，黄量.龙舌兰属植物中甾族皂甙元的研究——Ⅱ.剑麻中甾族皂甙元的分离和鉴定[J].化学学报，1976，34(3)：179-195.

[11] 赵文浩，黄国峰，王俊.剑麻渣中的皂苷/皂苷元成分研究[J].广西大学学报(自然科学版)，2015，40(3)：532-544.

[12] 杨安平，蔡小连.纤维素酶提取无患子总皂苷的正交设计实验优选[J].中医药导报，2012，18(3)：73-74.