桉树枝枯病又名桉树梢枯病，是近年来危害桉树的主要病害之一，在桉树栽培地区不同程度地发生，发病严重的林地梢枯病可达100%，严重影响了桉树的生长和木材蓄积。研究发现广西桉树枝枯病的病原主要有3种，其中可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是主要病原之一[1]。为了找到有效的方法对该病害进行防治，本课题组在室内条件下，筛选了多种有效化学药剂[2-3]。化学药剂虽然见效快，但因污染环境等缺点被限量使用，因此，有必要寻找出对该病害高效及环境友好的生物防治手段。利用白僵菌（Beauveria spp.）防治病害就属于生物防治的范畴，国内外已有的研究表明，白僵菌对多种植物病原菌具有较好防治效果，具有很好的开发利用价值。球孢白僵菌对小麦全蚀病菌（Gae-mannomyces graminis）[4]、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的菌丝生长具有抑制作用[5]，对灰霉病（Botrytis cinerea）的分生孢子萌发具有抑制作用和延缓作用[4-6]。球孢白僵菌对油菜菌核病病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、棉花枯萎病病菌 （Fusarium oxysporium）、小麦赤霉病菌（Fusahum graminearum）具有抑制作用[7-8]。关于白僵菌发酵液发酵条件对病原菌抑菌作用的影响，国内有研究表明，白僵菌对氮营养要求更高[9]，白僵菌发酵液具有一定的热稳定性和光稳定性，强酸或者强碱条件发酵液抑菌率受到抑制[10]，而碱性条件比酸性条件更稳定[11]。本课题组前期的研究也表明，一株分离自松毛虫的白僵菌菌株S1-7，其发酵液对桉树枝枯病菌可可毛色二孢的抑菌率达到了80%以上，该菌株已于2015年11月10日保存于中国微生物菌种保存中心，保存号为CGMCC No.11644。为了更好的利用这个菌株对桉树枝枯病进行防治，本文在室内条件下研究了不同发酵条件的白僵菌菌株S1-7发酵液对桉树枝枯病菌可可毛色二孢抑制作用的影响，旨在筛选到最佳发酵条件，为开发利用该菌株防治桉树枝枯病提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　供试材料

供试菌株：白僵菌菌株S1-7、桉树枝枯病菌可可毛色二孢由本实验室分离获得。

针对一级水系无法采集到水系沉积物，向上游朔源在沟两侧寻找覆盖较薄且用采样锹很容易采集到样品的地方，剔除风成物、钙积层等干扰物采集岩屑，野外采样粒级仍然沿用水系沉积物的截取粒级，采用放射的树枝状网络结构进行采样(图2)。

供试培养基：SDY培养基、PDA培养基。

1.2　方法

1.2.1　发酵液的制备

白僵菌菌株S1-7在PDA培养基上培养10 d后，用无菌打孔器（d=6 mm）打取一定数量的菌丝块，放置于40 mL的SDY培养液中，置于恒温培养箱中静置培养一段时间后，用无菌纱布过滤除去菌丝，发酵液经孔径为0.22 μm细菌过滤膜过滤收集发酵液，放置于4℃的冰箱中保存备用。

1.2.2　抑菌率的测定

柴婷，女，满族，1987年12月，河南省洛阳市，山东理工大学工商管理专业研究生，现任职于山东现代学院。

以SDY培养基为基础培养基，葡萄糖、蛋白胨及酵母粉按以下比例配制：①20、5、5 g/L；②8 0、20、20 g/L；③40、20、20g/L；④80、10、10 g/L；⑤20、10、10 g/L；⑥40、10、20 g/L； ⑦40、20、10 g/L；⑧80、10、20 g/L；⑨80、20、10 g/L。其他条件不变，培养2 d后计算抑菌率。

采用菌丝生长速率法。将5 mL的发酵液与溶化后冷却至40～50℃的50 mL的PDA培养基混匀，制成平板，用内径6 mm的打孔器取培养好的可可毛色二孢菌丝块放于平板中央，置于（25±1）℃培养箱培养，对照用相同剂量的无菌水的PDA培养基培养，每处理重复3次，培养2 d后采用十字交叉法用游标卡尺测定菌落直径，并计算抑菌率。

1.2.3　不同培养天数对抑菌率的影响

时至今日，适逢改革开放四十年，又迎来了西部大开发的新时代，甘肃老中青三代雕塑家集体亮相，接受省、市各级政府及广大人民群众的检阅，是全省雕塑家们多年来的心愿，也是甘肃雕塑艺术家献给新时期文化大发展的一份厚礼。

1.2.4　不同培养温度对抑菌率的影响

仔猪因肠道内尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响。哺乳仔猪以传染性腹泻较为常见，而保育仔猪以日粮抗原过敏、断奶、饲料突然更换、寒冷、环境应激等非传染性因素引起的腹泻为主。这两类因素间的关系十分密切，既相互影响，又互为因果。因此，在生产实践中，仔猪腹泻往往是多种因素相互作用的结果，常呈多重感染或交叉混合感染。

1.2.5　培养基不同pH值对抑菌率的影响

将SDY培养基的pH值用1 mol/L NaOH或者1 mol/L HCL 分别设置为 3、4、5、6、7、8、9、10、11，其他条件不变，培养2 d后计算抑菌率。

1.2.6　不同培养基配比对抑菌率的影响

抑菌率（%）=（对照菌株的菌落直径-处理菌株的菌落直径）/（对照菌落直径-6）×100

在恒温箱的培养天数分别为5、10、15、20、25、30、35 d时，测定抑菌率。

1.2.7　高温处理对抑菌率的影响

将收集的培养发酵液在40、60、80、100℃处理4 h，以及在121℃条件下处理20 min，其他条件不变，培养2 d后计算抑菌率。

将收集的培养发酵液取5 mL放入直径9 cm的培养皿盛放，经距离约30 cm，8 W紫外灯分别照射0、0.5、1、2、6、12 h，其他条件不变，培养2 d后计算抑菌率。

1.2.8　紫外线照射不同时间对抑菌率的影响

《导基》的智慧课堂教学根据全国导游资格考试大纲与题型，对课程内容进行合理的智慧构建，采用课件讲解、图片、视频、问题、讨论、头脑风暴、投屏演示、现场练习等多种手段强化教学内容，加深学生们对知识点的归纳、辨析与理解，强化对知识点的记忆与灵活运用，减少测评时出错，提高考证通过率。

1.2.9　数据处理

采用DPS软件计算差异显著性及标准误。

2　结果与分析

2.1　不同培养时间对抑菌率的影响

白僵菌菌株S1-7在SDY培养液中培养5 d后其发酵液对可可毛色抑菌率达到67.94%，随着培养时间的增加，抑菌率也不断的增加，到20 d时抑菌率达到最高值（92.82%），其后缓慢下降。但20 d时的抑菌率与15、35 d的差异不显著，与培养30、10、5 d抑菌率差异显著（表1）。

本文针对低信噪比环境下，基于多载波系统对通信信道进行了测量，并获得了相应的信道冲激响应、时延功率谱和多普勒谱，提取出了通信信道的基本参数。可以看出，利用多载波系统，能够获得较大增益，在低信噪比下能够较为准确地进行信道测量。

将恒温培养箱的温度分别设置为15、20、25、28、30、35、40℃，其他条件不变，培养2 d后计算抑菌率。

 

表1　不同培养时间菌株S1-7发酵液对可可毛色二孢的抑制作用Tab.1Inhibitory effects ofBeauveria bassianastrain S1-7 onLasiodiplodia theobromaein different culture time

  

发酵液不同培养天数/d 20 15 35 25 30 10 5抑菌率（%）92.82±0.19 90.60±2.11 90.58±0.56 87.80±1.97 85.20±0.98 84.50±0.92 67.94±0.98 5%显著水平a ab ab bc c c d 1%极显著差异水平A AB AB ABC BC C D

2.2　不同培养温度对抑菌率的影响

温度为28℃时，抑菌率最高（92.55%）；其次是培养温度为25℃时的抑菌率（88.59%）；温度为20、25、28℃的抑菌率差异不显著，与其他培养温度抑菌率达到显著差异水平（表2）。由此可见，温度过高或者过低均会导致抑菌率下降，特别是温度越高，抑菌率下降越明显，当温度为40℃时，抑菌率仅为9.26%。

 

表2　不同培养温度菌株S1-7发酵液对可可毛色二孢的抑制作用Tab.2Inhibitory effects ofBeauveria bassianastrain S1-7 onLasiodiplodia theobromaein different culture temperatures

  

1%极显著差异水平5%显著水平不同培养温度/℃28 25 20 15 30 35 40抑菌率（%）92.55±0.73 88.59±0.86 87.65±1.55 79.47±0.34 77.96±3.49 42.84±0.78 09.26±0.53 a a a b b c d A A A B B C D

2.3　培养基不同pH值对抑菌率的影响

pH值为7.0、8.0时，抑菌率分别为87.89%、88.67%；pH值为10.0时，抑菌率为86.02%，抑菌率差异不显著。pH值过高或者过低均会影响抑菌率，其中pH值偏酸对抑菌率的影响最大，当pH值为3时，抑菌率仅为55.76%（表3）。

 

表3　不同pH值菌株S1-7发酵液对可可毛色二孢的抑制作用Tab.3Inhibitory effects ofBeauveria bassianastrain S1-7 onLasiodiplodia theobromaein different pH values

  

pH值08.0 07.0 10.0 11.0 05.0 06.0 09.0 04.0 03.0抑菌率（%）88.67±1.31 87.89±0.74 86.02±1.14C 81.07±2.67 78.59±1.40 78.57±2.05 76.93±1.18 68.78±4.44 55.76±2.01 5%显著水平a a a b bc c c c d e 1%极显著水平A AB ABC ABC BC BC CD D E

2.4　不同培养基配比对抑菌率的影响

从表4可以看出，抑菌率最高的是配方③（葡萄糖、蛋白胨及酵母粉含量分别为40、20、20 g/L），抑菌率达到93.74%；其次是配方⑤（葡萄糖、蛋白胨及酵母粉含量分别为20、10、10 g/L），抑制效果为87.63%；抑制效果最差的是配方①（葡萄糖、蛋白胨及酵母粉含量分别为20、5、5 g/L），抑菌率为74.96%。

 

表4　不同培养基条件菌株S1-7发酵液对可可毛色二孢的抑制作用Tab.4Inhibitory effects ofBeauveria bassianastrain S1-7 onLasiodiplodia theobromaein different culture mediums

  

不同配方5%显著水平1%极显著水平③⑤②⑧⑨⑦⑥④①抑菌率（%）93.74±0.66 87.63±0.64 87.23±1.00 86.36±1.08 85.50±1.85 83.77±0.76 79.45±1.54 75.41±0.78 74.96±0.94 a b b c bc bc c d e e A B B B B B C CD D D

2.5　高温处理对菌株抑菌率的影响

与对照相比，温度越高，抑菌率越低，温度为60℃以下处理4 h，抑菌率下降不明显，与对照抑菌率差异不显著，温度在80℃以上处理4 h，抑菌率下降明显，达到79.79%，与对照差异显著；当温度为121℃处理20 min时，抑菌率为68.47%，达到极显著差异的水平（表5）。

 

表5　高温处理对S1-7发酵液对可可毛色二孢的抑制作用Tab.5Inhibitory effects ofBeauveria bassianastrain S1-7 onLasiodiplodia theobromaeunder different high temperatures

  

处理CK 60℃处理4 h 40℃处理4 h 80℃处理4 h 100℃处理4 h 121℃处理20 min抑菌率88.12±0.28 85.68±0.77 85.01±1.02 79.79±3.39 73.91±0.77 68.47±1.68 5%显著水平a a a b c d 1%极显著水平A AB AB BC CD D

2.6　紫外线照射不同时间对抑菌率的影响

经紫外线照射不同时间后，菌株的抑菌率变化不明显，不经紫外线照射抑菌率为86.42%，随着时间的增加，抑菌率缓慢下降，在时间为1 h时达到最低，随后缓慢上升。紫外线照射0、0.5、1、2、6、12 h对抑菌率的影响差异不显著，与1 h抑菌率达到显著差异的水平，说明紫外线对抑菌率影响不大（表6）。

 

表6　不同紫外线照射时间菌株S1-7发酵液对可可毛色二孢的抑制作用Tab.6Inhibitory effects ofBeauveria bassianastrain S1-7 onLasiodiplodia theobromaeunder different time of ultraviolet irradiation

  

紫外线照射不同时间/h 6 12 5%显著水平1%极显著水平0 2 a a a b 0.5 1抑菌率（%）88.20±0.91 88.19±0.48 86.42±0.32 85.77±0.20 84.28±2.97 83.24±1.63 ab ab b A A A A A A

3　结论与讨论

研究表明，S1-7发酵液对可可毛色二孢抑菌率最高的温度为28℃，温度过高或者过低对抑菌率均有一定程度的影响，高温的影响作用大于低温。在前20 d内，抑菌率随着培养时间增加而增加，在第20天达到最高值，随后抑菌率呈现上下波动的状态，说明培养20 d为抑菌率最稳定的时间。pH值7.0～8.0的抑菌率最高，酸性比碱性条件对抑菌率影响更大，这与夏龙荪研究结果相一致[11]；培养基中葡萄糖∶蛋白胨∶酵母粉=40∶20∶20（g）时抑菌率最高，与基础培养基中葡萄糖∶蛋白胨∶酵母粉=40∶10∶10（g）相比，将蛋白胨及酵母粉的含量分别提高了1倍，说明在培养基中适当提高氮源的含量，有助于提高抑菌率，这与齐永霞的研究结论一致，即球孢白僵菌对氮营养的要求较高[9]。60℃以下高温处理4 h对抑制作用影响不大，温度高于60℃抑菌率显著降低，在发酵液的储存及运输过程中，应当尽量避免超过60℃高温；紫外线照射对发酵液的抑菌率影响不大，说明发酵液在田间应用时受紫外线的影响较小。

参考文献

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