油茶（Camellia oleifera）是山茶科（Theacese）山茶属植物中油脂含量较高且具有重要经济价值和良好开发前景的优质食用油料树种。油茶籽油富含生育酚、角鲨烯等天然抗氧化剂成分[2]。近年来，随着人们身体保健意识的提高，油茶籽油已作为国际粮农组织重点推广的高级健康食用植物油。油茶主要分布在我国南方17个省（区），湖南、江西、广西、浙江和广东等为中心产区，其中，湖南省栽培面积最大，约占全国油茶栽培面积的40%[3]。我国油茶种质资源极为丰富，但植株的形态特征受环境条件等因素的影响较大，导致油茶品种混杂，分类混乱，造成油茶育种工作进展缓慢。因此，迫切需要从分子水平上对油茶种质资源进行鉴别，筛选核心种质，明确优良种质资源的遗传背景，为高产优质新品种的选育和早期鉴定提供一种高效、可靠的方法。

本文样本区间2012年1月至2017年12月，采用沪深市场的数据，数据来源于东方财富网和锐思金融数据库。

近年来，随着分子标记技术的快速发展，研究者采用多种分子标记对油茶种质资源的遗传多样性进行了广泛的研究，包括RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP标记[4-10]。而这些分子标记均是基于电泳分析技术反映DNA序列的变异，标记数量少且在基因组中分布不均匀，同时电泳分析存在分辨能力低、受条件影响电泳条带不稳定、操作费时费力等缺陷。SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）是一套简化基因组测序技术，通过利用生物信息学方法，设计标记开发方案，用特定的限制酶对基因组进行酶切，再对特定长度的酶切片段进行高通量测序，在短时间内获取全基因组范围内的变异图像（SNPs、InDels），让研究者可以高效地开发大量的多态性标记，以实现对重要农艺性状调控基因的精确定位，该技术具有通量高、有效reads长、准确度高、可重复性好、成本低等特点[1]。SLAF-seq主要应用在全基因组关联分析（GWAS）、遗传图谱构建和QTL定位、遗传进化分析等领域。本研究将采用SLAF-seq技术对油茶进行简化基因组测序，获取大量多态性SLAF标签，进而开发一批特异性强、稳定性高的SNP位点，为油茶种质资源鉴定与评价、高密度遗传连锁图谱的构建和重要农艺性状的关联分析奠定基础。

选取2015年1月—2017年12月年我院收治的60例病情好转的2型糖尿病患者作为研究对象。将其随机分成观察组和对照组。观察组30例进行延续性护理，对照组30例进行常规护理，两组患者均进行为期3个月的相应护理。观察组中，男性患者12例，女性患者18例，平均年龄为（59.8±3.9）岁。本组患者的病程在1～16年，平均病程为（4.7±0.8）年。对照组中，男性患者17例，女性患者13例，平均年龄为（60.5±4.3）岁。本组患者的病程在1～17年，平均病程为（4.9±0.6）年。两组患者病情等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1　材料与方法

1.1　材料

5个“岑软系列”优良无性系亲本包括岑软2号 （CR-2）、岑软 11号 （CR-11）、岑软 22号（CR-22）、岑软 23号 （CR-23）、岑软 24号（CR-24）及其子代（岑软ZJ11、岑软ZJ14、岑软ZJ24、优31）4个高产优良单株，其中，岑软ZJ11是岑软2号为母本、岑软11号为父本的人工定向杂交子代；岑软ZJ14是岑软11号为母本、岑软22号为父本的人工定向杂交子代；岑软ZJ24是岑软11号为母本、岑软24号为父本的人工定向杂交子代；优31是岑软11号为母本、岑软23号为父本的人工定向杂交子代；但这4个子代是否是真正的杂交子代未知（表1）。以上材料均种植于广西林业科学研究院油桐山试验地。采集新鲜嫩叶，放在有变色硅胶的密封袋中干燥后，于-20℃保存备用。

1.2　方法

 

表1　供试材料种质名称Tab.1　Name of the tested materials

  

父本（♂）岑软11号（CR-11）岑软22号（CR-22）岑软24号（CR-24）岑软23号（CR-23）母本（♀）岑软2号（CR-2）岑软11号（CR-11）岑软11号（CR-11）岑软11号（CR-11）杂交后代岑软ZJ11岑软ZJ14岑软ZJ24优31

1.2.1　基因组DNA的提取及质量检测

利用SLAF-predict软件，通过对猕猴桃基因组(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)进行电子酶切预测，预测确定的酶切方案信息（表2），最终选择HaeⅢ进行酶切，酶切片段长度在414～464 bp的序列定义为SLAF标签，预测可得到130 019个SLAF标签。为进一步评估酶切方案的有效性与酶切效率，本研究以水稻作为对照，测序结果与已公布的水稻基因组（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）进行比对（表3），本次实验水稻双端比对效率在93.67%，酶切效率为95.13%，表明SLAF建库正常。

1.2.2　SLAF-seq

由于油茶尚未进行基因组测序，因此，根据油茶基因组大小及GC含量等信息，最终选取猕猴桃（Actinidiachinensis）基因组（http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi）作为参考基因组进行酶切预测。利用酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切方案，对油茶基因组DNA进行酶切。将得到的酶切片段进行3′端加A处理、连接测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段并回收，文库质检合格后用Illumina HiSeq进行高通量测序。选用水稻（Oryza sativa）作为对照进行测序以评估酶切的效率及其准确性。利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的读长（reads），经过滤后，对测序质量和数据量进行评估。

1.2.3　特异性SNP位点的开发

测序质量值（Q）是评估高通量测序单碱基错误率的重要指标，测序质量值越高对应的碱基测序错误率越低，一般将测序质量值（Q）大于等于30（Q30）作为测序结果较为可靠的标准。为保证分析质量，本研究采用读长125 bp×2作为后续的数据评估和分析数据。经过Illumina HiSeq高通量测序平台对9个油茶样品及对照水稻进行测序，共获得49.76 M reads数据，各样品获得的总读长数在296 235～8 870 602个之间，其中，CR-22获得的数据量最大为8 870 602个读长，而对照水稻获得的数据量最小为296 235个读长（图1A）。GC含量在43.17%～46.60%之间，CR-22测序获得的GC含量最低为43.17%，而对照水稻的GC含量最高为46.60%，所有样品的平均GC含量为43.69%（图1B），GC含量普遍不高，说明达到测序要求。不同样品测序的Q30在87.06%～88.75%之间，其中，对照水稻的Q30最低为87.06%，CR-2的Q30最高为88.75%，所有样品的测序平均Q30为87.96%（图1B），测序碱基错误率低，说明测序正常。

2　结果与分析

2.1　建库评估

采用CTAB方法提取油茶叶片DNA，DNA纯度与浓度经1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行检测。

2.2　测序数据统计与评估

 

表2　预测确定的酶切方案信息Tab.2　Information of predicted digestion method

  

酶HaeIII插入片段大小（bp）414～464 SLAF个数130 019

 

表3　水稻测序读长与其基因组比对结果统计Tab.3　The alignment results between the obtained reads ofOryza sativaand its genome sequences

  

样品水稻双端比对93.67单端比对2.16未比对成功4.17正常酶切比例95.13部分酶切的比例4.87

对各样品测序产生的reads进行聚类分析，聚类到一起的reads来源于同一个SLAF片段（SLAF标签）；同一个SLAF标签在不同样品间序列有差异(即有多态性)，即定义为多态性SLAF标签。SNP标记的开发是以每个SLAF标签中深度最高的序列类型作为参考序列，利用BWA[11]将测序reads比对到参考序列上，并使用GATK[12]和samtools[13]两种方法分别开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记。

本研究共开发447 960个SLAF标签，每个样品平均开发153 128个SLAF标签，亲本SLAF标签的平均测序深度为27.70x，子代SLAF标签的平均测序深度为16.45x，最终获得多态性SLAF标签149 469个，采用GATK[12]和samtools[13]两种方法分别开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记，本研究共获得1 644 616个特异性SNP标记（图1C、D）。

2.3　SLAF标签与特异性SNP位点开发

HLSS360超大型水工型搅拌楼主要为大型水利水电工程施工服务，可满足高强度、大容量碾压混凝土的搅拌需求。该设备采用南方路机自主设计的JS7000/6000水工型强制式搅拌机，拥有多项自主创新技术；骨料楼内二次风冷新技术，配备片冰供应系统，保证了混凝土严格的温控要求；搅拌楼特别采用行业领先的微机控制系统，包括双机同步控制、动态仿真模拟、远程控制等新技术，生产过程全面实现自动化控制。该设备具有稳定的工作性能、先进的技术水平，生产效率高，为水电工程项目建设实现大规模机械化、信息化施工提供了必要的保证。

2.4　油茶的亲子关系分析

  

图1　不同样品测序数据比较Fig.1　Comparison of sequencing data in different samples

通过检测样品中出现非亲本类型SNP比例检测亲子关系，即样本中出现两亲本中未出现的碱基类型的SNP的比例，若低于一定水平则认为该子代是该两亲本的子代，否则反之。根据经验，将此阈值设定为2%。基于群体SNP位点，对9个油茶样品的亲子关系进行分析，结果表明，4对亲本组合的异常SNP标记比例均低于原设阈值，可见，岑软ZJ11为CR-2与CR-11的杂交后代，岑软ZJ14为CR-11与CR-22的杂交后代，岑软ZJ24为CR-11与CR-24的杂交后代，优31则是CR-11与CR-23的杂交后代（表4）。

研究表明，蓝藻水华事件显著地改变了稀有种亚群落的组成和多样性，但并未显著影响优势种的多样性。稀有种与优势种之间的网络关系是非随机的、具有模块结构，而且网络中模块间的连接点和模块内部的中心节点几乎全部为稀有种，这些重要节点的丧失将会使网络解体，稀有种和优势种之间的协同作用，可能在维持生物群落稳定和恢复生态功能方面发挥重要作用。

 

表4　9个油茶样品的亲子关系分析Tab.4　Paternity analysis of 9Camellia oleiferasamples

  

父本（♂）岑软11号（CR-11）岑软22号（CR-22）岑软24号（CR-24）岑软23号（CR-23）母本（♀）岑软2号（CR-2）岑软11号（CR-11）岑软11号（CR-11）岑软11号（CR-11）杂交后代岑软ZJ11岑软ZJ14岑软ZJ24优31异常标记比例（%）1.35 1.63 0.53 0.88

3　讨论

SLAF-seq技术是一种高通量、高准确率、低成本的测序技术，而且SLAF-seq无需依赖于研究物种的基因组序列信息，对研究物种进行简化基因组测序，在短时间内获得遍布整个基因组的海量信息，这对未知基因组信息的物种显得尤为重要[14-15]。目前，SLAF-seq技术已被广泛应用在多个物种的研究中，并取得了显著的成效。Shen等[16]采用SLAF-seq技术对5种四倍体棉花进行简化基因组测序并与棉花参考基因组进行比较，在四倍体棉花基因组中开发了132 880个SNP和6 296个InDels变异位点。Zeng等[17]采用SLAF-seq技术对鸭茅进行基因组关联分析（GWAS），共获得2 334 889个SLAF标签，开发了2 309 777个SNP位点，通过GWAS分析发现4 604个SNP位点与锈病性状显著相关（P＜0.01），并发现两个候选基因参与鸭茅的抗锈病反应。Luo等[18]采用SLAF-seq技术对芒果173个F1单株及其亲本进行标记开发，获得156 368个多态性SLAF标签，并将6 594个SLAF标签整合到20个连锁群上，构建了芒果首张高密度的连锁图谱。

杂交选育种是种质创新、新品种选育的重要途径。通过杂交，可以将双亲的优良基因重新组合，使杂种子代获得双亲的优良性状或出现新的性状组合[19]。而优良子代的选择是杂交育种的关键环节，需要对杂交后代进行不断的观察、鉴别，并根据育种目标进行选择与淘汰，最终获得优良的品系。油茶属异花授粉植物，自花授粉结实率低，但在人工杂交育种过程中，仍然会受到花粉污染、去雄不彻底、人为操作干扰等因素干扰，加之杂交后代有可能混杂有部分的自交种，因此，对杂交后代的真实性进行鉴定，以筛选真正的杂交子代为后面的优良杂交品种选育显得尤为关键。目前，油茶杂交子代的鉴定多采用形态特征进行鉴定，而形态特征容易受到环境因素的影响，因此，容易造成杂交单株的漏选或者错选，严重影响油茶杂交育种的研究进程。分子标记技术是基于DNA水平的检测技术，克服了组织和器官种类、发育阶段、生境条件等诸多因素的影响，具有明显的优越性和稳定性，是杂交种早期鉴定的有效技术。本研究的9个油茶样品包括5个优良无性系亲本包括岑软2号、岑软11号、岑软22号、岑软23号、岑软24号及其子代4个高产优良单株（岑软ZJ11、岑软ZJ14、岑软ZJ24、优31），但其真实的亲子关系无法确定。本研究采用SLAF-seq技术对这9个油茶样品进行简化基因组测序，共获得49.76Mreads数据，测序平均Q30为87.96%，平均GC含量为43.69%，共开发出447 960个SLAF标签，多态性SLAF标签149 469个，进一步根据多态性SLAF标签开发特异性SNP标记，共得到1 644 616个群体SNP。基于群体SNP的亲子关系分析结果表明，岑软ZJ11为岑软2号与岑软11号的杂交后代，岑软ZJ14为岑软11号与岑软22号的杂交后代，岑软ZJ24为岑软11号与岑软24号的杂交后代，优31则是岑软11号与岑软23号的杂交后代。本文开发的SNP标记可进一步用于油茶种质资源的鉴定、连锁图谱构建以及重要性状的关联分析等研究。

参考文献

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