β-羟基-β-甲基丁酸（简称 HMB）是亮氨酸在体内通过其代谢产物α-酮异己酸产生的一种衍生物，主要用于饲料[1-2]和食品[3]等行业。HMB影响动物蛋白质周转代谢，提供动物生产性能和动物疾病防御能力[4]。Nissen等[5]在一些有传染病的鸡进行试验，在其日粮中提供一定量的HMB可以降低鸡的死亡率。HMB-Ca作为新型饲料的添加剂，是较理想的畜禽肌肉强劲剂。HMB-Ca在动物生产中的应用受到越来越多研究者的关注。目前市场上β-羟基-β-甲基丁酸钙产品质量良莠不齐，部分饲料厂家检测设备不全，加之没有相对应的国家标准，使得β-羟基-β-甲基丁酸钙产品掺假现象比较普遍。

因此，本文建立了一种定性定量测定β-羟基-β-甲基丁酸钙的方法，该检测方法简单快速，准确可靠，实用性强。

1 实验

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（含紫外检测器，柱恒温系统），日本岛津公司；BS 110S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计，上海雷磁仪器公司；KQ218型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭电子仪器厂；WQF-410型傅立叶变换红外光谱仪，北京第二光学仪器厂；Z-5000型原子吸收分光光度计，日立公司。

全县油菜生产实现了恢复性增长，到2008年，全县种植油菜2.3万亩，实现总产值1850万元。2009-2013年实施油菜高产创建项目，易门县农业局抓住机遇，大胆创新，很抓各项科技措施的落实，通过良种、良法、农机、农艺等措施的组装配套、综合应用，良种、机耕、农药化肥补助等政策推动，5年实现创建区与非创建区比增收油菜籽1100万千克，新增产值605万元。详细见表1。

1.2 试剂与材料

β-羟基-β-甲基丁酸钙水合物对照品，含量97.0%，百灵威科技有限公司；乙腈，色谱纯，SIGMA；磷酸，分析纯，天津市福晨化学试剂厂；磷酸二氢钾，分析纯，天津市化学试剂厂；超纯水（Millipore，电阻率为18.2 MΩ·cm）；钙离子标准溶液，1 000 mg/L，国家标准物质中心；盐酸，分析纯，广州化学试剂厂；硫酸，分析纯，广州化学试剂厂；氢氟酸，分析纯，广州化学试剂厂。

从供应来看，原材料价格持续高位，磷矿石供应偏紧，磷酸二铵现货供应持续紧张。从需求来看，东北、西北地区冬储刚需较旺，同时出口询单积极性仍较高。在原料和市场需求支撑下，预计短期内二铵价格高位维稳，后期仍存小幅上涨，重点关注原料价格和冬储进展情况。

1.3 原子吸收光谱法溶液制备

1.3.1 对照品溶液制备

按照上述“1.3.2.1～1.3.2.3”项下的规定重复测定6次，HMB-Ca中Ca百分含量，分别为13.15%、13.26%、13.49%、13.32%、13.29%、13.21%，平均值为13.29%，结果RSD为0.87%。

1.3.2 供试品溶液制备

称取0.1 g β-羟基-β-甲基丁酸钙工业品于聚四氟乙烯坩埚中，以少许水润湿试样，加硫酸（1＋1）2 mL，氢氟酸10 mL，至低温电炉上分解30分钟，然后增温至冒尽白烟，取下冷却，加盐酸（1＋1）4 mL，加沸水20 mL，温热使溶液清澈透明。取下放冷，移入100 mL容量瓶中。

1.4 高效液相色谱法溶液制备

1.4.1 对照品溶液制备

称取一定量的β-羟基-β-甲基丁酸钙水合物对照品，用磷酸盐缓冲溶液溶解并逐步稀释，配制成五个不同浓度的对照品溶液，其浓度分别为0.098、0.295、0.491、0.687、0.981 mg/mL，备用。

1.4.2 供试品溶液制备

2.2.2 样品的测定

建立居家养老巡视探访服务制度：2019年，开展居家养老巡视探访服务工作试点。2020年末，基本建立居家养老巡视探访服务制度，实现重点巡访对象全覆盖。

1.5 实验方法

1.5.1 红外吸收光谱法

用溴化钾压片法对 β-羟基-β-甲基丁酸钙进行前处理，然后用红外吸收光谱测定样品在 4000 cm-1和400 cm-1范围处的吸收。

1996年，比尔·盖茨在意大利的佛罗伦萨大学演讲时，发现有一个男学生，高举着一块写着自己名字的白色硬纸板。

主要为情绪障碍、行为障碍和认知障碍，情绪障碍表现为缺乏义务感、责任感，易感情用事，缺乏理智等；行为障碍表现为自控能力差以及一些不正常的坏习惯，如贪图享受、好逸恶劳、放荡不羁、狂妄自大等；认知障碍表现为不能全面观察和分析问题，不能透过事物现象抓住本质，易陷入个人狭隘的知识经验圈，思维缺乏灵活性、逻辑性等；大学生道德（思想）亚健康不仅不利于自身人格的建设，也会对身边其他人的生活、工作产生不利影响，长久以往，很容易被他人孤立，从而进入恶性循环。

1.5.2 原子吸收光谱法

色谱条件：钙空心阴极灯，灯电流6 mA，波长422.7 nm，乙炔2.8 L/min，压缩空气15.0 L/min。

1.5.3 高效液相色谱法

2.3.4 标准曲线

色谱条件：色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（95∶5）（用磷酸溶液调节 pH值为 3.0）为流动相，样品进样量 20 μL，检测波长为 210 nm，柱温为 35℃，流速为1.0 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 红外吸收光谱定性鉴定HMB-Ca

图1为HMB-Ca的标准红外光谱图。由图1可见，β-羟基-β-甲基丁酸钙的红外特征吸收在波数2969 cm-1、1551 cm-1、1405 cm-1、1254 cm-1和1195 cm-1。2969 cm-1为饱和的C-H伸缩振动，1551 cm-1为C=O的伸缩振动，1405 cm-1为OH的变形振动，1254 cm-1和1195 cm-1为C-O的伸缩振动。由以上红外特征吸收峰可以初步判断样品中是否含有HMB-Ca。

  

图1 HMB-Ca的红外光谱图

  

图2 钙离子的标准曲线

2.2 原子吸收光谱测定HMB-Ca的Ca含量

2.2.1 标准曲线与精密度

以吸光度y对钙质量浓度x绘制标准曲线，如图2所示，标准曲线方程为y＝0.039 6 x＋0.006 5，相关系数R2＝0.999 7。用原子吸收光谱对钙离子标准溶液（浓度为4.0 mg/L）平行测定6次，其RSD为1.52%。按S/N＝3，钙离子的检出限为0.1 mg/L。

月亮湾地区用地性质主要以商务办公为主，辅以酒店式住宅、餐饮和休闲娱乐，沿湖部分以广场用地为主，很好地利用了湖景资源，整体用地综合性虽然很强，但由于空间内部联系不强和建设不完全等原因导致整个区域现状利用率不高，有大量闲置待租空间，因此，对周边区域的吸引力不足。

称取一定量的β-羟基-β-甲基丁酸钙工业品，置50 mL烧杯中，加入10 mL磷酸盐缓冲液，置超声仪上，超声10 min，加入5 mL乙腈振摇，然后过滤，将滤液转移至25 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度。

用钙离子标准溶液配制质量浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L的钙离子标准系列，备用。

采用右胸导联R波振幅比率的心电图算法，发现V3R、V4R、V5R导联的R波振幅比率两组之间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。经ROC曲线分析发现，V3R导联R波振幅比率的曲线下面积(AUC)为0.849，大于V4R导联R波振幅比率的AUC(0.781)及V5R导联R波振幅比率的AUC(0.697)。V3R导联R波振幅比率以0.41为界值,鉴别流出道室早左右室起源的敏感性及特异性分别为81.4%和83.3%。见图1。V3R导联R波振幅比率≥0.41为LVOT起源，反之则为RVOT起源。

2.2.3 加标试验

按试验方法对HMB-Ca进行加标回收试验，测定Ca含量，结果如表1所示。测定Ca加标含量的平均回收率为98.1%，RSD为4.9%，说明Ca含量测定方法的准确度符合要求。

 

表1 加标回收试验结果

  

样号 样品称取量/ g 加入Ca量/ mg 本底值/ mg 实测量/ mg 回收率/ % 平均值/ % RSD 1 0.1008 5 13.4 18.1 94.1 2 0.1049 5 13.9 19.2 105.2 3 0.1061 5 14.1 18.8 94.0 4 0.1033 10 13.7 23.2 94.7 5 0.1071 10 14.2 24.5 102.7 6 0.1055 10 14.0 23.8 97.8 98.1 4.9

2.3 高效液相色谱法测定HMB-Ca的HMB含量

本项目机动车道边缘路缘石高程设计路面20cm，在有下沉式绿化带的路段，站石按15～20m间距开口。当降雨量较小时，雨水可直接排入下沉式绿化带，利于绿化带内植被的生长，当降雨量较大时，雨水可排入雨水管道系统。

由于HMB以钙盐的形式存在，易溶于水，所以选择的色谱柱是反相色谱柱C18。大部分的反相色谱流动相都是水-甲醇或水-乙腈。通过实验发现，水-乙腈的流动相比水-甲醇的流动相对HMB的分离效果更好。为了改善峰形、分离度及其对称性，可选择往流动相中加入合适浓度的缓冲盐，当流动相缓冲盐选择磷酸二氢钾时，主峰峰形好，分离度高，杂质干扰小。

2.3.2 HMB 的标准色谱图

用高效液相色谱仪测定对照品溶液，记录色谱图，如图 3所示。用高效液相色谱仪测定对照品溶液（0.687 mg/mL）连续进样6次，记录色谱图，其结果如表2所示。

 

表2 HMB的测定结果（n＝6）

  

参数 测定值 RSD/ %t / min 7.819 7.818 7.821 7.819 7.816 7.818 0.02峰面积 464.061 467.358 466.425 465.893 465.185 465.708 0.24

  

图3 HMB的高效液相色谱图

  

图4 HMB的标准曲线

2.3.3 检测限与定量限

各组别移植瘤经一系列处理及HE染色后，将病理切片置光学显微镜下作组织病理学观察。图1示，细胞核明显深染的肿瘤细胞，部分细胞胞核多个，可见多核瘤巨细胞，且核质比例失调，畸形核及核分裂像多见。同时，各组切片均可见不同程度的坏死肿瘤细胞。HE染色主要表现为镜下大量无结构深红色颗粒状物质，肿瘤细胞呈碎片状，部分肿瘤坏死中央掺杂出血。其中，重组人血管内皮抑素+DDP(d4～d6)组坏死最明显，可见典型细胞坏死核浓缩、核碎裂、核溶解3个过程。生理盐水组坏死最少，在细胞间质可见散在分布的少量出血。

取HMB-Ca水合物对照品配制成信噪比约为10∶1的溶液，定量限为0.33 μg；配制成信噪比约为3∶1的溶液，检出限为0.09 μg。

新旧动能转换下，校企两方共同修订人才培养方案。根据课程设置和师资要求，共同选拔、培训任课教师，合作开发工作项目，设置工作任务，建立新的课程体系，体现校企合作，工学交替的双育人模式。

2.3.1 实际条件的选择

以五个不同浓度的HMB的峰面积y对质量浓度x绘制标准曲线，如图4所示，HMB的标准曲线方程为y＝695.78x－37.322，相关系数R2＝0.999 1。

2.3.5 样品测定

按照上述“1.3.3.1～1.3.3.3”项下的规定重复测定6次，HMB-Ca中HMB百分含量，分别为80.22%、80.51%、80.64%、80.79%、80.12%、80.45%，平均值为80.46%，结果RSD为0.31%。

2.3.6 加标试验

按试验方法对HMB-Ca进行加标回收试验，测定HMB含量，结果如表3所示。测定HMB加标含量的平均回收率为94.7%，RSD为4.3%，说明HMB含量测定方法的准确度符合要求。

以公产使用人对公共用财产的使用为例，是否构成权利，是否构成行政法上的物权的问题[5]，也称为一般使用的权利属性问题[6]。

PS：最近正好看到刘墉老师的一篇文章，写的也是自控力，里面有一段梁实秋先生的旧事蛮有意思，分享给大家：

 

表3 加标回收试验结果

  

样号 样品称取量/ g 加入HMB量/ mg 本底量/ mg 实测量/ mg 回收率/ % 平均值/ % RSD 1 0.1025 400 810 1180 92.5 2 0.1036 400 812 1195 95.8 3 0.1014 400 807 1168 90.3 4 0.1008 800 806 1536 91.3 5 0.1005 800 810 1588 97.2 6 0.1043 800 807 1615 101.1 94.7 4.3

2.4 实际测量

用β-羟基-β-甲基丁酸钙对照品加入淀粉，配制成一个掺假样品1#。用本文建立的方法进行掺假判别。

2.4.1 红外吸收光谱定性鉴定

1.5.2 中医证候分级量化标准 参考《中医病证诊断疗效标准》［6］、2012年版《中医儿科常见病诊疗指南》［7］、《中药新药临床研究指导原则》［8］制定。①主症：排便间隔时间延长、大便干结、排便困难分别赋0、2、4、6分，大便失禁按无、有，分别赋0、4分；②次症：脘腹胀满赋0、1、2、3分，不思乳食、口臭、恶心呕吐、口渴、烦躁、夜眠不安按无、有，分别赋0、1分。舌脉（指纹）不计分。

用红外吸收光谱测量样品1#，其结果如图5所示。样品的红外光谱在波数2972 cm-1、1554 cm-1、1400 cm-1、1251 cm-1和1192 cm-1处都有吸收，初步判断此样品1#含有HMB-Ca。

2.4.2 原子吸收光谱法和高效液相色谱法测定Ca和HMB含量

用原子吸收光谱法和高效液相色谱法分别测定 1#样品中Ca含量和HMB含量，钙含量的结果为10.25%，HMB的结果为68.15%。因为合格产品中HMB-Ca中钙的含量在 12%～16%，HMB的含量在 77%～82%，则可以确定1#样品有掺假情况。

  

图5 1#样品的红外光谱图

3 结论

采用红外光谱法、原子吸收光谱法和高效液相色谱法可以快速定性定量HMB-Ca，为含该成分的饲料标准的制订提供参考，填补国内关于HMB-Ca质量检测的空白。因为 β-羟基-β-甲基丁酸钙对动物营养发生作用的主要成分是β-羟基-β-甲基丁酸，当钙量和β-羟基-β-甲基丁酸不等量时，以β-羟基-β-甲基丁酸计算β-羟基-β-甲基丁酸钙的含量。

参考文献：

[1] Peterson A L, Qureshi M A, Ferket P R. Enhancement of cellular and humoral immunity in young broilers by the dietary supplementation of β-hydroxy-β-methylbutyrate[J]. Immunotoxical, 1999, 21(2): 307-330.

[2]何晓春, 丁广安. 合成HMB工艺条件的探讨[J]. 化学世界, 1999, 40(4): 204-207.

[3]曾志刚, 郝选明, 邱红. 补充β-羟基-β-甲基丁酸盐（HMB）在运动训练中的生理效应[J]. 中国运动医学杂志, 2007, 26(1):120-123.

[4]马友彪, 张海军, 王晶, 等. β-羟基-β-甲基丁酸在畜禽营养中作用的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2016, 43(10):2608-2614.

[5] Nissen S L, Abumrad N N. Nutritional role of the leucine metabolite β-hydroxy-β-methylbutyrate(HMB)[J]. J Nutr Biochem,1997, 8(6): 300-311.