小麦是我国重要的粮食作物。干旱是影响小麦生长和限制产量的非生物因素之一，在小麦的生长发育期内，经常会遇到干旱胁迫。干旱对小麦产生的影响以及小麦对干旱胁迫的响应方面，前人已经进行了大量的研究[1-4]。干旱胁迫不仅影响小麦幼苗、根系等组织器官的生长，还影响其非结构碳水化合物的代谢以及小麦分蘖、小穗数和穗粒数等农艺性状，进而影响小麦产量。此外，从个体、细胞等不同层面上也研究了小麦干旱胁迫下的生理生态变化及其响应干旱胁迫的分子机制 [5-7]。干旱胁迫下，通过诱导干旱响应基因差异表达，可以使小麦对干旱胁迫做出响应。

植物对干旱胁迫的响应非常复杂，不仅包括生理生化水平的调节，还包括分子水平的调控。前人虽然已经做了大量研究，但小麦干旱响应的机制仍尚未完全解析。

河南农业大学水肥资源高效利用课题组前期利用iTRAQ技术鉴定到一个干旱响应蛋白TaEF-1α (Elongation factor 1 alpha ，EF-1α)。有研究表明，EF-1α有 3 个结构域，结构域Ⅰ与 GTP 结合，结构域Ⅱ和Ⅲ与tRNA结合，主要参与蛋白的翻译过程[8]。EF-1α还可能具有其他重要的功能。研究表明，EF-1α具有类似分子伴侣的活性，能够和未正确折叠的蛋白相互作用并加速这些蛋白的降解[8]。此外，EF-1α还参与了信号传导、翻译控制、凋亡、细胞骨架组成、病毒复制及癌基因转化等许多重要的细胞过程[9-14]。但目前关于该基因参与植物抗旱性方面的研究尚未见报道。本研究利用VIGS技术将该基因进行沉默，对其功能进行了研究，以期为改良小麦抗旱性提供理论依据和基因资源。

质谱条件：ESI源为负离子模式；扫描范围：m/z 50～1 000；端板补偿电压：500 V；毛细管电压：3 500 V；干燥气体温度：200 ℃；干燥气体流速：8.0 L/min；雾化器压强：0.7 bar；离子能量：2.0 eV; 碰撞能量：8.0 eV.

1 材料和方法

1.1 材料与培养方法

本试验所用材料为郑麦9023。选取大小均匀的小麦种子用1%H2O2消毒10 min，然后用蒸馏水冲洗3～4次。消毒后，在培养皿中浸泡24 h后，将种子摆放于营养土中，用盆栽方式进行种植。将盆栽置于光照培养箱中进行培养。温度为(20±2)℃，光周期为16/8 h(光照/黑暗)，光照强度为200 lux。在二-三叶期进行VIGS侵染接种[15]。设置正常灌水和干旱2个处理(干旱处理接种后不再灌水)，即：NS(未进行干旱处理植株)、DS(干旱处理植株)、BSMV0( VIGS侵染阴性对照)；TaEF-1α基因侵染的不同植株(BSMVTaEF-1α-1、BSMVTaEF-1α-2、BSMVTaEF-1α-3和BSMVTaEF-1α-4)。接种后培养20 d后取样，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 RNA提取

利用TRIzol试剂提取叶片总RNA。用两步反转录试剂盒(Perfect Real Time；TaKaRa)进行反转录，反转录试验按照试剂盒说明书进行。反转录混合物配好后按如下程序进行反转录：42 ℃，2 min；37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反转录完成后-20 ℃冰箱保存备用。

4.提供富含维生素B1的全价饲料，添加优质青草、发芽谷物、麸皮、米糠或饲用酵母等。幼龄动物给予足量的全奶或酸奶，或根据动物的生理需要及时在日粮中添加或补充硫胺素，剂量按每千克饲料添加5～10 mg计算。（由于维生素B1缺乏会引起极度厌食，有时试图通过在饲料中添加进行治疗效果不佳）。

1.3 Real-time PCR

用Primer 5.0软件设计用于定量PCR的TaEF-1α基因特异引物以及TaActin和TaGAPDH 2个内参基因的引物。TaEF-1α特异性引物为：TaEF-1α-F：5′-CACACCTCGCACATTG-3′；TaEF-1α-R：5′-ATGCCAGCATCACCATTCT-3′。内参基因TaGAPDH特异性引物：TaGAPDH-F：5′-TGTCTGTGGTGTCAATGA

GAAGGA-3′；TaGAPDH-R：5′-GCAAGAGGAGCAAGG

CAGTTAGT-3′。内参基因 TaActin特异性引物：TaActin-F：5′-ACCTTCAGTTGCCCAGCAAT-3′；TaActin-R：5′-CAGAGTCGAGCACAATACCAGTTG-3′。

使用Bio-Rad IQ5实时PCR检测系统进行qRT-PCR。每个反应包括25 μL 反转录反应的产物，0.4 μL引物(正向和反向)，12.5 μL SYBR Premix Ex Taq (2×)，100 ng cDNA模板并添加无核酸酶的水，共25 μL反应体系。将反应物在95 ℃进行模板变性30 s；然后进行95 ℃，5 s和60 ℃，30 s，40个循环。每个样品4次重复。

[3] Fotovat R, Alikhani M, Valizadeh M, et al. A proteomics approach to discover drought tolerance proteins in wheat pollen grain at meiosis stage[J]. Protein and Pedtide Letters, 2017, 24(1): 26-36.

1.4 VIGS载体构建

1.6.1 叶片相对含水量的测定 叶片相对含水量(RWC)采用Flexas的方法[17]。取新鲜小麦叶片称取质量(FW)，然后在蒸馏水中浸泡6 h。取出叶片用吸水纸吸干叶片表面的水分，然后称取质量，随后再将叶片放入蒸馏水浸泡6 h，取出擦干叶片表面水分，称取质量，反复数次，直至叶片的质量不再增加为止。此时称取的质量即为叶片吸水饱和时的质量(TW)，然后将叶片样品置于烘箱烘干，并称取叶片的质量(DW)。叶片相对含水量RWC (%) = ((FW -DW) /(TW -DW)) × 100。

1.5 VIGS侵染过程

体外转录产物α、β、γ(或重组的γ)等体积混合，用DEPC处理水稀释，加入FES缓冲液[16]。在二-三叶期接种[15]，接种后第10天，在第3片叶片上出现斑点条纹的感染表型。感染后的干旱处理不再灌水。接种后第20天，收集第3和第4叶，-80 ℃保存。一部分用于测量生理指标，另一部分用于提取总RNA，进行qRT-PCR验证。试验同时设正常灌水未接种的空白对照(NS)、干旱胁迫未接种的空白对照(DS)、干旱处理接种γ空载体的阴性对照(BSMV0)、干旱处理接种γ-PDS-as载体的阳性对照(BSMVPDS)和干旱处理接种重组后γ载体(BSMVTaEF-1α)的试验组。接种γ-PDS-as载体的阳性对照侵染成功后会出现叶片漂白失绿现象。

驱动形式 ..................................................................后置后驱

1.6 VIGS相关生理指标的测定

VIGS试验中涉及的载体有α、β、γ和γ-PDS-as共4种，载体由河南农业大学陈锋教授课题组提供。克隆TaEF-1α的基因特异序列，用T4 DNA连接酶与γ载体片段连接，连接产物转化大肠杆菌，经菌落PCR筛选和双酶切验证确定阳性克隆，将正确的质粒载体命名为BSMVTaEF-1α。对载体进行线性化，用RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7(Promega，Madison)把线性化质粒进行体外转录。取0.5 μL体外转录产物用DEPC处理水稀释10倍，电泳检测。-80 ℃保存备用。

1.6.2 叶片相对电导率的测定 叶片相对电导率的测定参照Yan等[18]的方法。新鲜的叶片被切成10 cm的片段用去离子水洗涤3次。放在含有10 mL去离子水的旋盖离心管中在室温下放置24 h。24 h后，用电导仪记录电导率(C1)。然后，将离心管置于100 ℃沸水浴20 min。溶液冷却至室温，再次记录电导率(C2)。以去离子水为对照，计算公式：相对电导率=(C1/C2)×100%。

1.1 一般资料 选取2017年9月至2018年4月在西南医科大学附属医院就诊的各类癌症患者269例，其中男150例，女119例，年龄44～77岁；其中乳腺癌53例，肝癌 86例，肺癌87 例(小细胞肺癌41例，鳞癌17例，腺癌29例)，白血病43例，均经病理诊断及其他手段确诊且未经放化疗。选取肺部良性疾病患者57 例，年龄48～73岁，其中支气管炎患者22例，慢性阻塞性肺疾病17例，肺炎18例，并排除其他严重系统疾病及恶性肿瘤。另以同期30例健康体检人员作为健康对照组，年龄22～28岁，经证实均无心脏、肝、肾等其他系统疾病。

如果你在室内利用人工光源进行拍摄，G9的自动白平衡系统能够有效校正光源带来的偏色，更好地还原物体本来色彩。而E-M1 II自动白平衡更喜欢保留光线的氛围， 在白炽灯照明条件下，E-M1 II拍出的照片保留了浓郁的黄色调，更接近直接目视效果。我们认为这一项的差距源自两厂商对于相机使用场景的主观认识，这是一个见仁见智的问题，无法明晰孰高孰低。

式中V为提取液体积(5 mL)，W为样品鲜质量(0.5 g)。

1.7 数据分析

[10] Gross S R，Kinzy T G. Translation elongation factor 1A is essential for regulation of the actin cytoskeleton and cell morphology[J]. Nature Structural & Molecular Biology，2005，12(9)：772-778.

2 结果与分析

2.1 TaEF-1α基因在转录水平上的表达量

前期研究表明，干旱胁迫下，TaEF-1α在蛋白水平上的表达量上调了52.8%。本研究中又对其在转录水平上表达量进行了检测。结果表明，与正常灌水相比，干旱胁迫下，以TaGAPDH作为内参基因时，基因TaEF-1α的表达量升高了67.2%(图1-Ⅰ)；以TaActin作为内参基因时，基因TaEF-1α的表达量升高了47.3%(图1-Ⅱ)。说明干旱胁迫后，该基因转录水平上的表达量变化与蛋白水平上的变化趋势一致，均表现为受干旱诱导上调表达(图1)。

 

Ⅰ.内参基因(TaGAPDH)；Ⅱ.内参基因(TaActin)；CK.正常水分处理；Dr.干旱处理。生理指标，每个值表示为3次独立试验的平均值±SE；RNA表达量，每个数值表示4次技术重复的平均值±SE。 根据Duncan的多重范围测试，不同的大写字母表示在P<0.01时显著不同。图2, 4-6同。

Ⅰ.Reference gene(TaGAPDH);Ⅱ.Reference gene(TaActin);CK.No water stress;Dr.Drought stress.Physiological indicators, each value is expressed as mean±SE of three independent experiments；RNA expression amounts, and each value represents mean±SE of four technical replicates. Means followed by different big letters are significantly different at P< 0.01 according to Duncan′s multiple range test. The same as Fig.2,4-6.

图1 正常灌水处理和干旱处理小麦叶片TaEF-1α基因的相对表达量Fig.1 Relative expression of TaEF-1α gene in normal irrigated and drought-treated wheat leaves

2.2 VIGS侵染植株干旱胁迫下基因TaEF-1α的mRNA表达量

对VIGS侵染后的植株及各处理对照植株中TaEF-1α基因的表达量进行了检测。结果显示，相比于正常灌水(NS)，干旱处理(DS)的mRNA的表达水平和BSMV0植株的mRNA的表达水平都极显著升高。但与干旱处理(DS)相比，侵染BSMVTaEF-1α载体的植株中，不同株系mRNA的表达水平均极显著下调。说明干旱胁迫能诱导该基因上调表达，而VIGS技术沉默该基因后，又降低了其表达量，在干旱胁迫下仍然处于较低的表达水平(图2)。

2.3 VIGS侵染TaEF-1α基因后的表型

VIGS接种后，开始进行干旱处理(干旱处理不再灌水)。接种后第10天，侵染γ-PDS-as载体成功的阳性对照植株开始出现花斑条纹(接种第10天表型)(图3-A、B)，继续培养，直到接种后第20天，干旱条件下，接种BSMVTaEF-1α载体的植株开始出现叶片下垂的表型 (图3-C)，而侵染空载体的阴性对照植株未出现此叶片失水表型 (图3-D)。

 

NS.未进行干旱处理植株；DS.干旱处理植株；BSMV0. VIGS侵染阴性对照；BSMVTaEF-α-1、BSMVTaEF-α-2、BSMVTaEF-α-3和BSMVTaEF-α-4. VIGS侵染的不同植株。图3-6同。

NS. Non stressed plants；DS.Drought-stressed plants；BSMV0.Negative control of VIGS system；BSMVTaEF-1α.TaEF-1α knock-down-plants. The same as Fig.3-6.

图2 不同处理TaEF-1α基因mRNA的相对表达量Fig.2 The relative expression level of TaEF-1α gene in differently treated wheat plants

  

图3 VIGS侵染后的表型和干旱处理接种20 d的抗旱性表型鉴定Fig.3 The phenotype of the virus-infected wheat plants and the identification of drought tolerance

2.4 VIGS干旱胁迫下小麦叶片生理指标的变化

相对于正常灌水下的植株(NS)，干旱处理下植株(DS)的叶片相对含水量只下降了10.0%，侵染的阴性对照植株(BSMV0)叶片的相对含水量下降了10.1%，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的植株的叶片含水量下降了65.8%；相比于干旱处理未侵染植株(DS)的叶片相对含水量，侵染阴性对照植株(BSMV0)叶片的相对含水量没有显著变化，而侵染BSMVTaEF-1α基因的植株的叶片相对含水量下降了60.0%(图4)。

[17] Flexas J，Ribas-Carbó M，Bota J，et al. Decreased rubisco activity during water stress is not induced by decreased relative water content but related to conditions of low stomatal conductance and chloroplast CO2 concentration[J]. New Phytologist，2006，172(1)：73-82.

4.培训需求预测分析的方法具有多样性。企业培训必须采用多种方法进行综合分析，才能获得准确的培训需求，进而保证培训具有合理性、针对性和有效性。

干旱胁迫下，相比于正常灌水未侵染的小麦(NS)叶片的丙二醛含量，未侵染的小麦(DS)的叶片丙二醛含量升高了59.4%，侵染的阴性对照小麦(BSMV0)叶片的丙二醛含量升高了64.7%，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的叶片丙二醛含量升高了339.4%；相比于未侵染的植株(DS)叶片的丙二醛含量，侵染的阴性对照植株(BSMV0)叶片的丙二醛含量只升高了3.3%，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的叶片的丙二醛含量升高了175.6% (图6)。

治疗后对照组平均 FPG 为（8.45±1.42）mmol/L；治疗后试验组（6.21±0.89）mmol/L，差异有统计学意义（P<0.05）。试验组平均 2 hPG 为（7.43±1.69）mmol/L，对照组平均2 hPG（10.21±1.72）mmol/L，差异有统计学意义（P<0.05）。

  

图4 不同处理下小麦叶片相对含水量Fig. 4 The relative water content of wheat leaves in different treatments

  

图5 不同处理下植株的叶片相对电导率Fig.5 The relative electric conductivity of plant leaves in different treatments

  

图6 不同处理植株的叶片丙二醛含量Fig.6 MDA content of plant leaves in different treatments

3 结论与讨论

干旱能显著影响小麦的生长发育和最终产量的形成，前人对小麦抗旱相关基因及抗旱机制方面做了大量研究，鉴定出许多干旱胁迫响应基因，这些结果对于探究小麦响应的分子机制和遗传改良小麦抗旱性具有重要意义[20-21]，但植物响应干旱胁迫的过程是一个复杂的过程，对其分子机制的解析还远远没有完成。本课题组前期利用iTRAQ技术研究发现了一个小麦干旱胁迫响应蛋白TaEF-1α。在此基础上利用VIGS技术将其进行沉默后，对其功能做了进一步研究。

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VIGS技术是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型确定目标基因的功能。VIGS技术在抗病虫相关基因的研究中应用较多，其中涉及抗白粉病及抗蚜虫等病虫害有关的基因[22-23]。也有研究显示，该技术也可用于抗旱胁迫相关的基因功能研究[24]。本研究利用VIGS技术对干旱响应基因TaEF-1α进行沉默。结果显示，干旱条件下，该基因表达量被敲低后的植株表现出叶片下垂的表型，叶片相对含水量也极显著下降，相对电导率和丙二醛含量等生理指标却呈现不同幅度的升高趋势。

水分亏缺会影响作物生命活动的正常进行，进而影响作物生长，产生作物体内生理生化及外部表型的一系列变化[25]。作物遭受干旱胁迫时，叶片的外部形态会出现叶片下垂的干旱表型，而叶片的相对含水量则能很好地衡量作物的抗旱性。一些抗旱性较强的作物，干旱条件下，叶片下垂程度较轻，叶片能保持比较高的相对含水量[26]。本研究结果显示，干旱条件下，相比于正常灌水未侵染的植株(NS)的叶片相对含水量，未侵染植株(DS)和侵染空载体阴性对照植株(BSMV0)的叶片的相对含水量降低的较少，且这2个处理之间的叶片相对含水量没有明显差异，叶片未出现明显的干旱表型，而沉默掉TaEF-1α基因的植株叶片下垂，相对含水量极显著下降，说明该基因表达量被敲低后，植株抗旱性下降。

相对电导率是反映植物膜系统状况的一个重要的生理生化指标，植物在受到逆境或者其他损伤的情况下细胞膜容易破裂，膜蛋白受伤害因而使胞质的胞液外渗而使相对电导率增大，电导率越大说明膜蛋白受损伤越严重，作物抗逆性越差。本研究中，相比于正常灌水(NS)植株，未侵染植株(DS)的和侵染空载体阴性对照植株(BSMV0)的叶片相对电导率极显著升高，说明受干旱诱导相对电导率增加，这与前人的研究结论一致 [27]。相比于未侵染的植株(DS)和侵染BSMV0的阴性对照植株的叶片相对电导率，侵染BSMVTaEF-1α载体的植株叶片相对电导率极显著升高，这也暗示了沉默该基因后，植株抗旱性显著下降。

丙二醛是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤。因此，作物在逆境胁迫中生成丙二醛的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱[28]。丙二醛含量越高，说明其植物组织的抗氧化能力越弱，反之，则说明其抗氧化能力强。本研究也得到与前人研究一致的结论[29]，相比于正常灌水植株的叶片丙二醛含量，未侵染植株(DS)和侵染空载体阴性对照植株(BSMV0)的叶片的丙二醛含量没有明显变化，叶片未出现明显的叶片下垂的表型，而侵染BSMVTaEF-1α载体的植株叶片下垂，丙二醛含量极显著升高，同样也说明抗旱性显著下降。

综上，干旱条件下，小麦干旱相应基因TaEF-1α受干旱诱导极显著上调表达，而利用VIGS技术将该基因进行沉默后，其转录水平的表达量相比于未沉默植株极显著下调，小麦植株也出现叶片下垂的表型，叶片相对含水量极显著降低，相对电导率和丙二醛含量极显著升高。植株抗旱性大幅降低。上述研究结果表明，该基因可能在小麦响应干旱胁迫方面发挥着重要的作用，有望成为未来遗传改良小麦抗旱性和分子育种的重要基因资源，值得进一步深入研究。

1.6.3 丙二醛(MDA)含量的测定 丙二醛含量的测定采用陈建勋等[19]的方法。取0.5 g叶片，液氮速冻，于组织研磨器充分研磨，加入5 mL 0.05 mmol/L预冷的PBS(pH值7.8)摇匀，于4 °C下10 000 r/min离心20 min，上清液(酶液)转入离心管中，置于0～4 °C保存。取0.5 mL酶液(对照用0.5 mL 0.05 mmol/L pH值7.8 PBS代替酶液)(做3个重复)+3mL TBA-振荡-沸水浴上反应30 min-冷却至室温(至少30 min)-比色(OD600、OD532、OD450)。计算MDA含量：MDA浓度(mmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450；MDA含量(μmol/g)=C×V/W。

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两组患者均采用相同的降糖方案，包括饮食干预、禁烟禁酒、运动疗法、药物治疗等。对照组患者采用辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20130068，规格20 mg）治疗，口服20 mg/次，1次/d，疗程8周。观察组患者采用阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408，规格20 mg）治疗，口服20 mg/次，1次/d，疗程8周。

乙肝病毒广泛流行于世界各地，据报道，全世界的乙肝病毒携带者约4亿人，每年约有600万人死于与乙肝相关的疾病。我国是乙肝病毒高流行和高发病区域之一，约有1.2亿HBV携带者，其中约50%来源于母胎垂直传播。据报道，目前我国生育期妇女乙肝病毒感染比率高达8.16%[1]。在我们的研究中，行介入性产前诊断的孕妇中乙肝病毒携带者占8.22%，与人群中携带率基本相符。

[4] 赵燕昊，曹跃芬，孙威怡. 小麦抗旱研究进展[J]. 植物生理学报，2016，52(12)：1795-1803.

公立医院有许多内部职能部门。在具体的预算执行中，有一种情况是预算没有严格按照预算标准执行。财务部门对授权支付金额的控制不足，审批程序轻松实实，这是预算执行的风险点。职能部门没有预算，也没有超出预算的资金。由于预算控制和监督不严格，没有严格的审批程序，即使财务主管或总会计师的信息不准确，预算执行也存在风险。

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以SPSS 20.0统计学软件行数据统计学分析，计数资料以[n（%）]表示、计量资料以（±s）表示，分别行 χ2检验或t检验，结果以P<0.05为差异有统计学意义。

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利用 Excel 2007进行常规数据统计，用SPSS软件进行方差分析和显著性检验。

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有效的在线教育要基于明智的教学策略和有效合理教学设计，而不是基于机械的信息呈现[3]。根据信息加工理论，学习是学习者对信息(经验或对经验的反思)的编码与重组。这意味着教师必须把自己视为学习经验的设计者，而非信息传递专家。此外，在线教育还应注重教学的动机设计。一方面较强的动机水平能促进学习者学习；另一方面重视设计能与学习者产生共鸣的学习经验对于提升教学有重要意义。

干旱胁迫下，相比于正常灌水未侵染的小麦(NS)的叶片相对电导率，未侵染的小麦(DS)和侵染的阴性对照植株(BSMV0)小麦叶片的相对电导率分别升高了319.7%和325.0%，侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的叶片相对电导率升高了686.1%；相比于未侵染的小麦(DS)的叶片相对电导率，侵染的阴性对照植株(BSMV0)叶片的相对电导率没有显著差异，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的叶片相对电导率升高了87.3%(图5)。

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