猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，为已知最小的动物病毒之一，圆环病毒分为感染鸟类和感染哺乳动物类2种，感染哺乳动物类的即为猪圆环病毒。猪圆环病毒的基因组为单股负链的闭合环状结构，大小为1.7～2.0 kb[1-2]。基因组为双义链，正义链和反义链均可以编码蛋白 [3]。PCV分为2个血清型：Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)，其中，PCV1无致病性，而PCV2则是多种猪病的病原体 [4]。目前，已知和PCV2相关的猪病有：猪断奶后衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性产颤抖、肠炎等 [5]。PCV2病毒因有存活能力强、传播范围广、易诱发其他疾病共感染的特点而给全球的养猪业造成了严重的危害。

已有报道，PCV2可通过MyD88-NF-κB途径调节IL-4和IL-12的分泌，研究发现，PCV2可通过激活MyD88启动NF-κB信号途径，通过IκBα的磷酸化降解激活NF-κB，促使其入核与DNA结合，调控相关细胞因子的转录和表达 [6-7]。PCV2感染肺巨噬细胞后，TNF-α、IL-8分泌量会下降 [8]，且巨噬细胞趋化因子Ⅱ(Macrophage-derived chemotactic factor-Ⅱ，AMCF-Ⅱ)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、单核细胞趋化因子(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的mRNA表达量均会一定程度下调 [9]。Darwich等 [10]研究表明，PCV2的核酸以及基因组的特殊结构(ODN)可抑制PBMCs中IFN-α、IL-12p40、IL-10和IL-6的表达。综上可知，PCV2对宿主的先天性免疫存在潜在的调控作用，但PCV2对作为介导天然免疫反应重要防线的β干扰素是否也具有调控作用，目前未见报道。

病毒感染细胞后，释放核酸，被胞浆中特异的模式识别受体识别，经过相应配体的结合和下游信号转导，启动干扰素和其他细胞因子基因的转录 [11-12]。TLR9是发现较早的病毒DNA模式识别受体，AIM2、IFI16、DDX41、cGAS是后来逐渐发现的其他胞质DNA感受器 [13-16]。通过模式识别受体对病毒DNA的识别引发级联反应，最终同IFN-β上游的-100～-50 bp处启动子区有顺式作用元件(Positive regulatory domain，PRD)相应的ISRE、NF-κB、AP-1启动子区结合，启动IFN-β [17]。

本研究利用 IFN-β启动子报告基因检测、相对荧光定量等试验方法，探究PCV2调控Ⅰ干扰素通路的作用机制，为该病的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所有PCV2毒株为天津大学生命科学学院实验室在PK-15细胞上增殖后收集保存，所用PK-15细胞为本实验室冻存。真核细胞表达载体pcDNA3.1、RIG-I-FLAG、IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、ISRE-Luc质粒、TBK1表达质粒、IRF3-5D-Flag、仙台病毒(Sendai virus，SEV)由本实验室保存。

1.2 主要试剂

TRIzol LS reagent、DEPC购自Invitrogen公司；TranScript First-Strand cDNA Synthessis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；分子克隆相关试剂：E.coli DH5α感受态、Fast pfu DNA聚合酶购自全式金公司；限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ、T4DNA连接酶均为New England Biolabs公司产品；无内毒素质粒大提试剂盒购自Promega公司；细胞培养相关试剂：FBS、PBS、青-链霉素、0.25%胰酶、DMEM 培养基购于Gibco公司；转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent购自ThermoFisher 公司。荧光素酶报告检测试剂：D-Luciferase粉末购自Sigma公司；Glycylglycine购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗HA标签单抗、鼠抗β-actin 单抗、兔鼠抗-V5 标签单抗、辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体购自全式金公司。

1.3 试验方法

图4a显示大陆高压正在入海,苏南和长江口有温度锋区;图4b合成场显示,江苏沿海等高线与等温线稀疏,处于槽后脊前的稳定状态,有弱锋区在长江口及长江南侧。与副热带系统相比较,西风带系统势力仍较强,这与Ⅰ型海风锋环流背景中副高强盛显著不同。另一方面西风带系统移动较快,因此Ⅱ型海风锋是处于短时稳定形势下,这也与Ⅰ型海风锋不同。进一步地,斜压锋区的存在,营造了局地对流系统的活动空间,为海风锋相遇强对流系统,并发生相互作用,激发强对流天气过程提供了机遇。

[10] Darwich L， Balasch M， Plana-Duran J， et al. Cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in response to mitogen， superantigen or recall viral antigens[J]. J Gen Virol， 2003， 84(12)：3453-3457.

 

表1 PCV2基因扩增引物Tab.1 Amplification primers of different PCV2 protein genes

  

扩增基因AmplificationgeneGenBankNo．引物Primers产物长度/bpProductlength退火温度/℃AnnealingtemperaturePCV2ORF1DQ910866．1F：GCTCTAGAACCTCAGCAGCAAC94556．1R：CGGGATCCGTAATTTATTTCATATGGAAATTCPCV2ORF2DQ235696．1F：CACTGGACTAGTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC70257．5R：ACCGAGCTCGGAGGATCCAGGTTTAAGTGGGGGGTCTPCV2ORF3EF514716．2F：CACTGGACTAGTGGATCCATGATGAGATTTAATATTGACGAC34552．8R：ACCGAGCTCGGAGGATCCGCCAAAGCTGATTCCTTTT

注：灰色部分为酶切位点。

Note：Enzyme cutting site was showed in gray.

1.3.3 荧光素酶报告检测 将IFN-β启动子荧光素酶的报告质粒 IFN-β-Luc和荧光素酶内参质粒 Laz-luc共转染PK-15细胞，设置不接种(Mock)和接种PCV2(0.5 moi)组，并将PK-15细胞接种SeV作为阳性对照，24 h后检测 IFN-β启动子荧光素酶活性。为了进一步研究PCV2感染是否能抑制Poly(dA∶dT)诱导的IFN-β转录，将 IFN-β启动子荧光素酶的报告质粒IFN-β-Luc和荧光素酶内参质粒Laz-luc共转染PK-15细胞，随后分别设0.00(Mock)，1.00，0.10，0.01 moi剂量的PCV2接种组，接种设置为24 h后用Poly(dA：dT)刺激，24 h后检测 IFN-β启动子荧光素酶活性。

为了进一步研究PCV2编码的3个主要蛋白ORF1/ORF2/ORF3哪个对干扰素具有调控作用，使用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1-ORF1、pcDNA3.1-ORF2、pcDNA3.1-ORF3各0.5 μg同0.5 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、AP-1-Luc及0.5 μg 内参Laz-luc质粒共同转染24孔板中的HEK293T细胞，转染24 h后，加入SEV(20 HA/mL)刺激18 h后收集细胞，进行荧光素酶报告检测。确定了PCV2编码蛋白对干扰素具有调控作用后，进一步将0.5 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、AP-1-Luc与0.5 μg 内参Laz-luc质粒同不同剂量的pcDNA3.1-ORFs(0.05，0.10，0.20，0.40 μg)转染细胞，用Poly(dA∶dT)或cGAS质粒作为诱导剂激活干扰素信号通路。

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2 结果与分析

2.1 pcDNA3.1-ORF1/ORF2/ORF3真核表达的构建

基因扩增产物与目的大小相符，阳性克隆测序正确，表明已成功构建了ORF1/ORF2/ORF3的pcDNA3.1真核表达载体。重组质粒转染细胞裂解产物的相对分子量大小正确，能特异性表达相应大小的ORF1/ORF2/ORF3蛋白(图1)。

  

A.ORF1-3基因片段分别为945，702，345 bp；B.ORF1-3表达蛋白分子量分别为37.8，27.5，13.5 ku。A.ORF1-3 PCR products，945，702，345 bp respectively；B.The expression products of PCV2 ORF1-3，37.8，27.5，13.5 ku，respectively.

 

图1 PCR扩增PCV2 ORF1、ORF2、ORF3基因的产物(A)及其pcDNA3.1-ORF1/ORF2/ORF3转染HEK293T细胞的表达蛋白(B)

 

Fig. 1 The PCR amplification products of PCV2 ORF1，ORF2 and ORF3 genes (A)and its expression protein in transinfected HEK293T cells (B)

2.2 PCV2体外感染对天然免疫反应的抑制效应

2.2.1 PCV2感染对白细胞介素mRNA的影响 如图2所示，整体上看，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的转录在病毒感染初期会有一个上升过程，但在感染后期均会受到不同程度的抑制。IL-1β和IL-8是天然免疫应答过程中最重要的调节因子，其参与炎症反应、增强免疫介导的组织损伤；IL-8是一种重要的趋化性细胞因子，趋化和激活中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及T细胞进入感染部位。PCV2感染后IL-8在12 h的升高说明病毒成功感染细胞，后期可能与细胞浸润和肉芽肿形成相关；IL-10是一种介导免疫抑制的细胞因子，可以抑制Th1细胞应答、抑制巨噬细胞的抗原提呈功能及其细胞因子的合成，PCV2感染导致IL-10转录的上调和感染猪胸腺的衰竭有关。

  

图2 PCV2感染PK-15细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10转录时相Fig.2 The transcriptional profiles of cytokines IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10 in PCV2 inoculated PK-15 cells

2.2.2 PCV2感染对抗原提呈分子mRNA的影响 如图3所示，PCV2感染后MHCⅠ、MHCⅡ类分子在感染早期的转录水平较高，其中，MHCⅠ的峰值出现在感染后12 h，MHCⅡ则能持续较高水平地表达，在感染24 h后开始下降。抗原提呈细胞后期受到抑制可能和IL-10的高水平表达有关，IL-10的上调会降低MHC类分子的表达，损害抗原提呈细胞的抗原提呈能力。

某些抗原在不同种族中频率差异较大，例如一般认为K抗原是欧洲人特有的[2]，几乎所有抗-Jsb都发现于黑人。Fya在中国人群中超过90%[3]，但在白人中仅占66%，黑人人群常见Fy（a-b-）。In（b-）在印度和阿拉伯人群中频率相对较高，在国内尚未发现，Ok（a-）目前仅发现于8个日本家系和1名高加索人[4]，Jr（a-）在日本人中相对常见，目前发现的抗-ABTI均来自以色列阿拉伯。

  

图3 PCV2感染PK-15细胞MHCⅠ，MHC Ⅱ的转录表达Fig.3 The transcriptional changes of MHCⅠand MHCⅡ in PCV2 infected cells

2.2.3 PCV2感染对模式识别受体TLRs、cGAS的影响 TLR样受体是一种广泛存在的模式识别受体，其中，TLR3、TLR7、TLR9主要负责识别病毒的核酸，我们已经证实，PCV2感染会引起先天性免疫细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等的变化，这种变化是否和TLR受体相关？PAM细胞感染PCV2后0，6，12，24，48 h各时间点收集细胞，提取总RNA，利用相对荧光定量的方法检测TLR3、TLR7、TLR9的mRNA水平，结果如图4所示。在PCV2感染12 h以内TLRs的转录水平不会有显著的变化，但在感染12 h以后便开始显著升高，其中，TLR7随感染时间变化不明显，TLR9有先上升后下降的趋势，在24 h时达到最大值，随后开始下降(图4)。

由上式得，选取的sigma点数量为(n+2)个，而且W0=0时，则相当于忽略了χ(0)点，仅取了 (n+1)个点。其中，为n维向量，其具体表达式如下：

  

图4 PCV2感染对TLR3/7/9、cGAS转录的影响Fig.4 The transcription levels of TLR3/7/9 and cGAS in PCV2 inoculated cells

2.2.4 PCV2体外感染对Ⅰ型干扰素及转录因子的影响 Ⅰ型干扰素是机体天然免疫重要的抗病毒蛋白。对PCV2感染后细胞Ⅰ型干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ的转录水平进行动态分析发现，PCV2感染对IFN-α的影响不明显，但可以下调IFN-β、IFN-γ的mRNA，转录因子NF-κB上调，而IRF3的转录水平被下调(图5)。

1.3.1 细胞与病毒增殖 细胞培养于含有10% FBS 和1%青-链霉素的H-DMEM 完全培养基中，置于37 ℃，5% CO2孵箱中培养。PCV2毒株按MOI为0.5感染PK-15细胞及PAM细胞，感染后2，6，12，24，36，48 h分别收集细胞，提取总RNA，相对荧光定量PCR检测PCV2感染不同时间先天性免疫分子的变化。相对荧光定量PCR体系为：总RNA(50 ng)8 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，Oligo(dT) 18 (50 pmol/L) 1 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 8.2 μL，反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃ 30 s，共进行40个循环。95 ℃持续15 s，60 ℃ 15 s，升温至95 ℃持续20 min，采集扩增产物的解链曲线。相对荧光定量PCR中的Ct值代表模板中目标基因的含量，通过与β-actin进行比较，细胞因子mRNA相对定量PCR结果采用2-ΔΔCt法进行分析。利用Duncan法进行统计学分析(P<0.05时表示差异显著)。

  

图 5 PCV2感染PK-15细胞后Ⅰ型干扰素及转录因子NF-κB、IRF3转录的变化Fig.5 The transcription levels changes of type Ⅰ interferon and transcription factor NF-κB and IRF3 in PCV2 inoculated cells

2.2.5 PCV2体外感染PK-15对IFN-β及其启动子的抑制 IFN-β是先天性免疫的第一道防线，采用荧光素酶报告检测系统检测PCV2感染PK-15细胞后IFN-β的表达情况及其启动子的激活情况，分别用DNA模式识别受体相关的配体去激活IFN-β信号通路，然后检测PCV2感染后对IFN-β的影响(图6)，结果显示PCV2感染不能激活IFN-β的转录，并且能够抑制Poly(dA∶dT)、cGAS诱导的IFN-β转录，且呈现接种剂量依赖性。

  

A.与Sev相比；B.PCV2剂量效应；C.不同激活配体处理；*.P<0.05，**.P<0.01。图7-9同。A.Sev stimulated cells；B.Dose-dependent effect of PCV2 treated cells；C.PCV2 blocked Ploy(dA∶dT)，cGAS induced activity of IFN-β.*.P<0.05,**.P<0.01.The same as Fig.7-9.

 

图6 PCV2感染对IFN-β-Luc通路及IFN-β转录的影响Fig.6 Effect of PCV2 infection on the IFN-β-Luc pathway and the IFN-β transcription level

2.3 PCV2 ORF1、ORF2对IFN-β的调控作用

为了确定PCV2 ORF1、ORF2、ORF3这3个主要蛋白的调控作用，将PCV2表达质粒ORF1、ORF2、ORF3分别同IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、IRF3-Luc、AP-1-Luc质粒共转染细胞，24 h后加入Sev作为诱导剂激活IFN-β通路。如图7所示，PCV2感染抑制Poly(dA∶dT)和cGAS诱导的IRF3、NF-κB的活化，但不影响AP-1的活化。ORF1可以通过NF-κB启动子激活IFN-β的表达，ORF2可通过NF-κB和IRF3启动子抑制IFN-β的表达，ORF3则没有明显的作用。

  

图7 不同PCV2 ORF表达蛋白对干扰素诱导启动子活化的影响Fig.7 The regulation roles of different PCV2 ORF expression protein in inducing IFN activation

2.4 ORF1 和ORF2通过NF-κB、IRF3对IFN-β的作用

PCV2感染可以抑制Ploy(dA∶dT)、cGAS诱导的IFN-β产生，且呈剂量依赖关系。以cGAS为诱导剂检测过表达ORF1、ORF2时，对IFN-β及其启动子的活性调控的结果如图8所示，ORF1可以通过NF-κB启动子激活IFN-β的表达，并且呈剂量依赖效应；ORF2可以通过NF-κB和IRF3启动子抑制IFN-β的表达，并且呈剂量依赖效应。

水泡性口炎在许多细胞上都有它的受体，因此可以感染多种细胞系，并且已知它是一种对Ⅰ型干扰素敏感的病毒。笔者用表达绿色荧光蛋白标记的水泡性口炎病毒(GFP-VSV)间接判断ORF1、ORF2表达蛋白对细胞干扰素产生的影响，生长状态良好的PK-15细胞，分别转染ORF1、ORF2的表达质粒，转染24 h后，按moi 0.01的浓度接种GFP-VSV。接种后18 h收获细胞，用4%的多聚甲醛固定细胞后，用DAPI染细胞核，荧光倒置显微镜观察视野中GFP-VSV的细胞数量并做统计学分析，结果如图9所示，ORF1转染细胞VSV-GFP病毒增殖明显受到抑制，ORF2转染细胞后VSV-GFP病毒的增殖却显著增强。

综上所述，可以认定裂缝产生的主要原因之一应为行车荷载，包括超限重载车、车流量过大、荷载的持续时间过长等。

  

图8 PCV2 ORF1和ORF2影响的干扰素活化途径分析Fig.8 Effects of over expression of PCV2 ORF1/ORF2 on cGAS-triggered IFN-β promoter activation

  

A、B.ORF1 转染组；C、D.ORF2 转染组。A，B.ORF1-treated cells；C，D.ORF2-treated cells.

 

图9 不同PCV2 ORF表达蛋白对GFP-VSV增殖的影响Fig.9 The effects of different PCV2 ORF expression protein on GFP-VSV multiplication

3 讨论

PCV2感染PK-15细胞检测其对细胞先天性免疫因子的影响，结果发现，NF-кB、IL-6、IL-8细胞因子在病毒感染后其转录水平均较高，而IFN-β、IL-1β、TNF-α、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ细胞因子后期受到抑制[18]，说明PCV2造成感染细胞的免疫抑制，这也解释了感染PCV2的仔猪通常会伴随着猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪肺炎支原体、细菌性败血症和肺炎等其他疾病，PCV2感染造成机体免疫抑制使得仔猪继发性易感性增加。病毒感染使TLRs转录水平试验中TLR3的转录水平随PCV2感染会升高，可能的原因为细胞的RNA聚合酶Ⅲ以PCV2基因组为模板合成5′-三磷酸双链RNA，它可被TLR3识别，进而通过TRIF途径发挥抗病毒效应，但对TLR7的转录水平没有影响。TLR9识别病毒非甲基化的CpG DNA，通过对PCV2的序列分析发现，PCV2基因中富含若干CpG DNA基序可以激活TLR9，PCV2感染后24，36 h TLR9 mRNA表达量升高，可能与PCV2基因组中CpG的释放内陷进入细胞内有关。

病毒感染机体后，机体的细胞内模式识别受体会识别和提呈病毒的病原相关分子，启动天然免疫，经一系列的信号转导，最终诱导Ⅰ型干扰素等细胞因子的表达，这是很多病毒用来逃逸先天性免疫的主要手段之一[19]。研究发现，仙台病毒(Simaian virus)的V蛋白、埃博拉病毒(Ebola virus)的VP35可以通过抑制IRF3的功能从而抑制干扰素的转录，到达逃逸先天性免疫的目的。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)NS3/4A既可以抑制IRF3的功能，也可以通过降解MAVS蛋白来抑制先天性免疫；流感病毒的非结构蛋白NS1可以通过和RIG结合而抑制IRF3的功能，从而成功地进行免疫逃逸。HCV的NS5A蛋白通过抑制MyD88、痘病毒(Vaccinia virus)的A52R通过与IRAK2的相互作用抑制TLR介导的Ⅰ型干扰素转录[19-22]。研究发现，PCV2通过IRF3、NF-κB启动子抑制干扰素的产生，但PCV2 ORF1和ORF2在对干扰素的调控方面表现出相反的特性，ORF1通过NF-κB激活干扰素的产生，Meng[23]研究发现，PCV2 复制时激活 NF-κB，细胞用NF-κB抑制剂处理可以减少病毒的复制，说明NF-κB 的活化在协同多种控制免疫反应的细胞基因表达上发挥重要的作用，从而促进病毒的复制。现在还不清楚其具体分子机制。另有研究表明，PCV2基因序列中含有的干扰素刺激应答元件(ISRE)使得PCV2感染早期能够利用干扰素进行病毒复制[24]。这可能为ORF1激活IFN-β提供了一种解释。

IRF-3被上游信号分子激活后磷酸化入核，再与细胞核内的组蛋白乙酰基转移酶结合，改变染色体的构象，然后与干扰素启动子DNA结合，通过这一系列的活化过程来启动干扰素的表达。NF-κB的活化包括IκB降解和P65磷酸化2个过程，IκB降解后释放NF-κB P50/P65异源二聚体，P65磷酸化，最终进入细胞核与细胞核内的组蛋白乙酰基转移酶结合，改变染色体的构象，然后与干扰素启动子DNA结合，启动干扰素的表达[25-26]，因此，欲进一步研究ORF1/ORF2调控干扰素的机制，需要研究ORF1/ORF2对IRF3的磷酸化二聚化入核的影响[27-29]。

研究中利用双报告基因检测技术、相对荧光定量等试验方法，发现PCV2抑制Ⅰ型干扰素通路，但其编码的ORF1蛋白通过NF-κB激活IFN-β的产生，ORF2通过NF-кB、IRF3启动子抑制IFN-β的产生，这为认识PCV2免疫抑制机制提供了新依据。

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阿里依然只是“哦”了一声。他的失望仿佛披裹在全身，整个人连走路都是软软的。罗四强于心不忍，便拿出手机说：“阿里，你是不是要听这个？”

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智能楼宇综合管理系统，即IBMS（Intelligent Building Management System），主要指通过统一的人机交互管理界面对楼宇内部众多的信息化设施进行统一管理，实现所有智能子系统的集中监视和控制以及全局事件的处理，并通过跨系统的联动，实现楼宇信息化设施的自动化运行，提高楼宇运维管理的效率。

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疏解情绪的方法很多，有些人会独自痛哭一场，有些人会找三五个好友诉说一番，还有一些人会逛街、听音乐、散步或逼自己做别的事情，以免老想起不愉快的经历。

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1.3.2 质粒构建、转染及蛋白检测 根据GenBank(DQ910866.1、DQ235696.1、EF514716.2)基因序列设计PCV2 ORF1、ORF2、ORF3基因扩增引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用浓度25 pmol/μL的引物见表1。根据相应基因序列设计引物，将PCV2 ORF1、ORF2、ORF3基因连接到pcDNA3.1真核表达载体上，将一定量的质粒转染HEK293T细胞，转染48 h后收获细胞，加入适量含蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，150 mmol/L NaCl，1%NP-40)冰浴裂解30 min，裂解液于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集上清进行 SDS-PAGE，之后将蛋白转膜至硝酸纤维膜上，经5%牛奶封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗室温孵育1 h后，用化学发光显色底物及Chemi Doc TMXRS系统检测。

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数据平均值和标准误差通过GraphPad Prism 5.01分析处理得到。通过t检验计算P值，P值小于0.05时认为有统计学意义。

全诗中，诗人并未对“乡愁”这一主题进行情感上的描绘，而是对“我”进行了不同时期的状态描述。可以看出，在人生的各个阶段，“我”始终与价值对象处于析取状态，思而不得，四节诗中并未具体描述“乡愁”的心理，却都是在刻画“乡愁”。并且，在“我”所思所欲的价值对象的演变中，由“母亲”到“新娘”，再到坟墓中的“母亲”，最后到“大陆”，“我”所思由生者到死者，由可得到不可得；由“新娘”代表的小家到“大陆”代表的祖国大家，愁绪一层层加深，思念一层层升华。

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因此，学校应完善一卡通的本身价值。如包括在学校食堂、校园超市的消费功能、图书馆书籍的借阅和归还功能、免费校园网络的使用功能、课程的申报功能、宿舍水电卡的使用功能、考试登记功能、学生活动的申请功能以及方便与学生校园活动的功能应进行优化拓展，使学生在校园内拥有高便携性的生活方式。同时，基于对一卡通的充值功能，学校高层还可以对一开通实施三方软件的管理办法，包括对支付宝、微信等支付功能的拓展，使学生能够使用一开通进行话费充值、公交卡充值等。

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膨润土浸水自由膨胀后，结构变得十分蓬松，由于压汞试验中要求试样脱湿干燥，即使通过液氮冻干的方法处理，也难免对孔隙结构造成扰动。而核磁共振技术以水分子作为测定媒介，可以捕捉孔隙内部氢质子的共振信号，从而能推测饱和状态下的试样孔隙分布状况。因此，选择核磁共振方法具有明显的优势。自由膨胀后的试样孔隙分布特征如图7所示。

[26] Bonizzi G， Karin M. The two NF-κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity[J]. Trends Immunol， 2004， 25(6)：280-288.

当代社会，处于物和资本统治之下的个体往往自发的、本能的以自身物质需求的满足为价值顶点，这种狭隘的价值追寻本质上而言与动物的生存本能无异。 集体主义能够有效地引导个体超越自发本能，在对他人和社会的积极奉献中丰富自我，构建更为高远的价值追寻。

[27] Honda K， Yanai H， Takaoka A， et al. Regulation of the type I IFN induction： a current view[J]. Int Immunol， 2005， 17(11)：1367-1378.

另外，选用TI公司生产的TPS43000作为PWM控制器，来搭建硬件电路原理图。最后实验表明：硬件电路成功的实现了2.5～3.5 V低电压到5 V的升压转换。实验表明本设计可行。

[28] Smith E J， Marié I， Prakash A， et al. IRF3 and IRF7 phosphorylation in virus-infected cells does not require double-stranded RNA-dependent protein kinase R or IκB kinase but is blocked by Vaccinia virus E3L protein[J]. J Biol Chem， 2001， 276(12)：8951-8957.

先定义一个二叉链表Bitree变量T，然后在命令行中提示用户输入先序遍历得到的字符序列，用‘#’代表空，接着根据用户输入的结点序列构造二叉链表，最后层次遍历输出tree.dot文件。代码如图12所示。

[29] Sun F， Zhang Y B， Liu T K， et al. Fish MITA serves as a mediator for distinct fish IFN gene activation dependent on IRF3 or IRF7[J]. The Journal of Immunology， 2011， 187(5)：2531-2539.