浮游植物是海洋中最重要的初级生产者，约占全球初级生产力的50%，其群落结构变化不仅影响到海洋初级生产力、食物网、元素生物地球化学循环与气候调节等多个过程，还可导致藻类灾害增多，对海洋生态安全和社会经济造成损害（Roemmich et al，1995；Field et al，1998；Sabine et al，2004）。因此，研究浮游植物群落结构的变化规律具有重要的生态学意义。浮游植物按照粒径的大小可以分为3大类：小型浮游植物（20～200 μm）、微型浮游植物 （2～20 μm） 和微微型浮游植物 （0.2～2 μm） （Sieburth et al，1978，More noet al， 2012； Aiken et al， 2009； 傅 明 珠 等 ，2010）。不同粒级结构的浮游植物在不同海域的贡献率不同，例如，小型浮游植物在高营养盐的近岸海域对初级生产力的贡献率较高（Agawin et al，2000；Magazzú et al，1995；李涛 等，2007；董燕红等，2009），而微型和微微型浮游植物在部分寡营养海域贡献率高达80%（Takahash et al，1983；Hallegraeff et al，1984；李佳俊等，2016）；粒级结构组成的差异会进而对生物地球化学循环过程以及食物网结构形成影响（Ridgwell et al，2005；Sarthou et al，2005；Sunda et al，2002），因此，浮游植物粒度组成比例的研究十分重要。

绿色矿山评价指标众多，包括定性和定量指标。本文采用层次分析法(AHP)与模糊综合评价法相结合方式，将定量指标与定性指标一起进行多级模糊综合评价。

逐级过滤法和特征色素分析法是获得浮游植物粒径组成的主要途径（Roy et al，2011）。逐级过滤法是将水样用不同孔径的膜进行逐级过滤，通过检测不同膜中的叶绿素a（Chl a）浓度，获得不同粒级浮游植物的生物量。此法现场需3次过滤，检测设备简单，在我国多个海域都有应用（孙军等，2003；李超伦等，1998；黄邦钦等，2006；傅明珠等，2010）。然而，浮游植物的形态多种多样，有些微型和微微型浮游植物是以链状或者群体形式存在（如中肋骨条藻），过滤时会截留在较大孔径的滤膜上，导致低估微型和微微型浮游植物的生物量，高估小型浮游植物的生物量（孙军等，2003）。特征色素法是利用浮游植物特征色素进行粒级分类的一种方法（Vidussi et al，2001；Uitz et al，2006）。特征色素法现场操作简单只需一次过滤，不仅可以进行粒级分类，还可以提供浮游植物功能类群的信息（Moreno et al，2012），目前得到广泛应用。该方法的计算公式是通过对全球范围内大量现场浮游植物数据进行多元线性回归分析获得，因此在不同海区间使用时，需要验证与适度调整。

利用高效液相色谱（HPLC）测定浮游植物特征色素已经得到了广泛的应用，该方法重复性好、仪器相对便宜，且能够满足大部分现场样品检测（Jeffrey et al，2006）。但HPLC法仍存在3个不足，影响了色素定性定量的准确性：1）光谱特征相同或类似的色素，使用HPLC很难区分（Roy et al，2011），极有可能出现假阴性或假阳性。在定量分析时，浓度较低的色谱峰极易被其同分异构体、色素降解物和邻近的高浓度色谱峰干扰（Dolan，2002；Hooker et al，2009）；2）无法分辨共流出组分中的不同色素（Jeffrey et al，1994；Garrido et al，1998；Airs et al，2001），共流出的未知色素组分往往被错认为已知色素（Frassanito et al，2008；Alvarez et al，2013）；3）检测器灵敏度不够，有些含量较低的重要特征色素，例如指示微型浮游植物的别藻黄素（Allo）和微微型浮游植物的玉米黄素（Zea），浓度往往在HPLC方法的检出限附近（Uitz et al，2009），定量准确度低。超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-MS/MS）结合了液相和质谱的优点，在多反应监测模式下，色谱分离的组分经过二级质谱选择，检测准确度明显高于HPLC，同一时间洗脱出的不同组分可以分别被提取，不会互相干扰；灵敏度高于HPLC，可以检测痕量色素成分（Roy et al，2011）。Zhang等（2016）在前人研究基础上，建立了14种特征色素的UHPLC-MS/MS定量检测法，大大缩短了色素检测时间，提高了检测的准确度，灵敏度比传统HPLC方法提高了10～1 000倍。

纵观彭绍升的这篇传记，其中包含着几乎所有清初隐遁遗民都会面临的四重尖锐而激烈的矛盾冲突：“殉节而死”与“不死苟活”、“出应世务”与“栖隐土室”、“与世交接”与“杜门避居”、“受赠馈遗”与“坚却不受”。面对一重重尖锐而复杂的矛盾冲突，该何去何从，这几乎成为易代之际士大夫道德操守的试金石，就在这一次次的冲突、纠结和抉择中，考量着每一位当事者的道德底线，也自然成为衡量士人志节操守的道德准绳和标签。在清初散文史上，以遗民志士为传主的传记散文中，这些道德维度的评判便逐渐形成传记写作中相对固定的“范式”。

本研究基于UHPLC-MS/MS新方法，检测了黄海夏季表、中、底3层浮游植物现场样品；并依据UHPLC-MS/MS法测得的黄海浮游植物特征色素数据，分析了黄海夏季浮游植物粒级的空间分布特征。研究目的在于探讨UHPLC-MS/MS法应用在我国海域浮游植物特征色素分析及粒级分类中的可行性。

1 研究区域和方法

1.1 研究区域与采样方法

2015年8月17-28日，搭乘国家基金委夏季航次对黄海47个站点水体的浮游植物色素展开了取样调查，采样站位见图1。由CTD采水器获取表、中、底3层水样。在弱光下使用直径25mm的GF/F滤膜（Whatman）过滤500 mL海水，滤膜对折，吸干水分，用铝箔纸包裹，放入冻存管，存于液氮罐中，用于色素测定。

1.2 特征色素分析

表层Chl a浓度变化范围为0.21～15.52 mg/m3（图4A1），高值区出现在山东半岛东侧近岸海域、苏北浅滩近岸和长江口附近海域（E1：12.14 mg/m3；I2：12.34 mg/m3；K1：15.52 mg/m3），低值区出现在黄海中部黄海冷水团区域（Chl a浓度＜1 mg/m3）。在Chl a浓度大于1 mg/m3的近岸区域，小型浮游植物是Chla的主要贡献者，贡献率达79.43%（图4A2）；在Chl a浓度小于1 mg/m3的冷水团区域，微型（45.18%）和微微型（30.91%）浮游植物是Chl a的主要贡献者（图4A3、A4）。

某起 110KV的断路器出现操作机构的拒动，经检查后可以发现，断路器处于合闸的状态，监视运行的红灯也处于亮的状态，可以手动把断路器进行多次的分闸与合闸，使传动机械可以顺利的完成分闸与合闸，使操作机构保证正常的储能。进行分闸与合闸的线圈检查时，要检查线圈外观是否发生严重的锈蚀情况，可以手动在2个分闸线圈，保证铁心不会发生卡死的动作。将2个分闸线圈进行拆除解体的检查，可能发现主分闸的线圈电阻处于 4.3Ω，在线圈的内部已经出现严重的膨胀和变形，导致铁心卡死，完全无法动作，而副分线圈的电阻是74.6Ω，当副分线圈的内部发生严重的膨胀变形时，动铁心也发生卡死，无法正常动作。

  

图1 采样站位

1.3 浮游植物粒级分析

综上所述，两种方法在检测近岸海域实际样品时，检测结果整体吻合度较高，虽然UHPLCMS/MS具有更高灵敏度，但两种色素检测方法均适用于黄海色素测定。

乙腈、甲醇（LC-MS级）购自Merck公司；乙酸铵（LC级）购自Sigma公司。色素标准品（包括 Chl a、Chl b、Allo、Zea、19’-丁酞基氧化岩藻黄素（But-fuco）、19’-己酞基氧化岩藻黄素（Hex-fuco）、硅甲藻黄素（Diad）、岩藻黄素（Fuco）、多甲藻素（Peri）、青绿素（Pras）、叶黄素（Lut）、新黄素（Neox）和紫黄素（Viol））购自丹麦水资源与环境研究所；内标8’-Apo-beta-carotenal（Apo）购自ChromaDex公司。

 

表1 色素名称、缩写、英文名称、代表浮游植物类群和浮游植物粒级百分比计算公式（Uitz et al，2006）

  

色素名称 英文名称（缩写） 代表的主要浮游植物类群叶绿素 a Chlorophyll a（Chl a） 共有叶绿素b Chlorophyll b（Chlb） 绿藻（青绿藻）别藻黄素 Alloxanthin（Allo） 隐藻19’-丁酞基氧化岩藻黄素 19’-butanoyloxyfucoxanthin（But-fuco） 定鞭藻和金藻19’-己酞基氧化岩藻黄素 19’-hexanoyloxyfucoxanthin（Hex-fuco） 定鞭藻岩藻黄素 Fucoxanthin（Fuco） 硅藻玉米黄素 Zeaxanthin（Zea） 蓝藻和原绿球藻多甲藻素 Peridinin（Peri） 甲藻计算公式诊断色素加权总和 weighted sum of diagnostic pigments（wDP） 0.35[But-fuco]+1.41[Fuco]+1.27[Hex-fuco]+1.41[Peri]+0.60[Allo]+0.86[Zea]+1.01[Chl b]小型浮游植物百分比microphytoplankton proportion factor（mPF）（1.41[Fuco]+1.41[Peri]）/wDP微型浮游植物百分比nanophytoplankton proportion factor（nPF）（1.27[Hex-fuco]+0.35[But-fuco]+0.60[Allo]）/wDP微微型浮游植物百分比picoophytoplankton proportion factor（pPF）（0.86[Zea]+1.01[Chl b]）/wDP

2 结果与讨论

2.1 UHPLC与UHPLC-MS/MS实际样品检测结果比较

调查期间，整个调查海域Chl a平均浓度为1.87 mg/m3，变化范围为 0.13～15.52 mg/m3。Chl a浓度空间分布呈现由近岸到离岸、由表层至底层逐渐递减的趋势（图4）。近岸浮游植物以大粒径的小型浮游植物为主，黄海冷水团海域以小粒径的微型和微微型浮游植物为主。

和谐课堂教学实施过程，是信息技术支持下的小学数学问题导向式和谐课堂教学的具体应用阶段，分为教师讲解、学生讨论、教师总结三个阶段。

 

表2 UHPLC和UHPLC-MS/MS海水样品检测结果对比

  

注：浓度范围和平均浓度均以提取液中的浓度计；平均浓度是UHPLC和UHPLC-MS/MS两种方法均可以检测到的样品的平均浓度值。

 

UHPLC UHPLC-MS/MS UHPLC UHPLC-MS/MS Peri 18 25 9.9-1831.3 0.5-1584.2 359.2 314.2 12.6 Fuco 25 25 7.4-210.7 8.4-227.9 57.1 59.1 11.7 Viol 3 25 1.1-2.6 0.1-2.75 2 2.3 10.8 Pras 9 25 2.1-15.3 0.2-15.2 5.5 5.1 12.6 Hex-fuco 21 25 5.4-209.0 0.2-178.5 52.2 54.6 17.6 Diad 19 21 4.8-177.8 2.1-160.5 48.6 45.8 16.9 Allo 19 25 1.7-16.5 0.1-22.1 7 6.9 12.0 Zea 17 25 1.2-16.0 0.2-18.9 7 7.3 9.9 Chl b 16 25 4.1-32.8 0.8-28.2 13.8 11.7 21.8 Chl a 25 25 14.7-946.8 13.8-889.2 237.2 238 6.8 Lut 0 25 - 0.01-1.3 - -色素 可检测的样品数 浓度范围/mg·m-3 平均浓度/mg·m-3 平均标准偏差/%

中层Chl a浓度明显低于表层，变化范围为0.13～7.31 mg/m3，呈现明显的近岸到离岸递减的趋势，Chl a浓度高值区出现山东半岛南侧和苏北浅滩近岸海域 （G4：5.28 mg/m3；I2：7.31 mg/m3），低值区出现在离岸区域（Chl a浓度＜1 mg/m3） （图4B1）。在Chl a浓度大于1 mg/m3的区域，小型浮游植物依然是Chl a的主要贡献者，但贡献率略小于表层（68.74%） （图4B2）；与表层不同，在离岸区域，小型（53.13%）和微微型（32.83%）浮游植物是Chl a的主要贡献者（图4B3、B4）。

  

图2 UHPLC和UHPLC-MS/MS实际样品色素浓度检测结果比较

为了确定色素浓度与UHPLC法和UHPLCMS/MS法检测结果差异的关系，进一步研究了色素浓度与两种方法检测结果标准偏差（RSD）的关系（图3）。由图3可见，76%的两种方法均可检测到的色素，两种方法检测结果的RSD＜20%，说明两种检测方法的整体差异不明显。两种方法检测结果RSD＞30%的占可检测到的色素的8%，均出现在色素浓度小于20 mg/m3时，这说明两种方法检测结果差异主要出现在色素浓度较低的时候。在低浓度时，两种方法检测结果产生较大差异的原因可能有两方面：1）仪器偏差，不同的仪器，检测原理不同，检测灵敏度不同，检测结果之间会存在一定的偏差，浓度越低，产生的差异一般越大；2）色素含量较低时，UHPLC检测定量准确度有可能受基线噪音、邻近色谱峰、未知色素组分和同分异构体的干扰，定量准确度受到一定影响 （Dolan，2002；Hooker et al，2009；Uitz et al，2009）。

  

图3 UHPLC和UHPLC-MS/MS检测结果标准偏差与检测浓度的关系

粒级测定采用色素分类法（Uitz et al，2006）。选取了7种特征色素用来表征不同的浮游植物类群及其粒级结构（表1）；浮游植物生物量使用Chl a来表示；不同粒级浮游植物比例分别以小型浮游植物贡献率（mPF），微型浮游植物贡献率（nPF）和微微型浮游植物贡献率（pPF）来表示，计算公式见表1。

2.2 黄海浮游植物Chla和粒级结构的空间分布特征

随机选取了25个站位的表层样品，分别使用UHPLC和UHPLC-MS/MS两种仪器检测样品特征色素含量，并对10种色素的检测结果进行对比分析（表2）。发现：1）UHPLC-MS/MS法可检测到的色素种类明显多于UHPLC法，例如：UHPLCMS/MS法在25个样品中均检出Lut，但UHPLC法均未检出；2）UHPLC-MS/MS法检测下限明显低于UHPLC法，例如：UHPLC-MS/MS法检测到的Peri的浓度最小值是0.5 mg/m3，而UHPLC法检测到的Peri的最小浓度是9.9 mg/m3。在所有的色素中，Viol、Pras、Allo、Zea、Chl b 和 Lut含量均较低，提取液中色素平均浓度小于10 mg/m3，说明一些重要的诊断特征色素在自然样品中含量较低（Uitz et al，2009）。两种方法检测到样品浓度范围上限值和样品平均浓度差别不明显，平均标准偏差（RSD）除Chl b外均小于20%。

浮游植物色素样品分别采用Waters Acquity UPLC和Thermo Fisher 1250 pump-TSQ Quantum Access MAX UHPLC-MS/MS进行测定，具体步骤参考Zhang等（2016）的方法。

  

图4 黄海夏季Chl a浓度及浮游植物粒级结构的空间分布特征

为了进一步研究两种方法检测结果的吻合度，我们选取两种方法均可以检测到的色素样本，对比分析了检测结果（图2）。结果表明，两种方法检测到的实际样品色素浓度总体吻合度较高，差异不明显。在色素浓度小于20 mg/m3时，UHPLCMS/MS与UHPLC检测结果相比，少数样品检测结果偏高，例如Hex-fuco和Allo；另外也有少数色素检测结果偏低，如Fuco和Chl b。

开水冲服，每日2次。1岁以内每次6克（半袋），1～3岁每次6～12克（半袋至1袋），4～7岁每次12～18克（1～1.5袋），8～12岁每次24克（2袋）。

底层Chl a浓度明显低于表层、中层，变化范围为0.14～8.04 mg/m3，Chl a浓度高值区主要出现在苏北浅滩和山东半岛近岸区域（E1：2.32 mg/m3；I2：8.04 mg/m3） （图4C1）。浮游植物粒级结构与中层类似，在Chl a浓度大于1 mg/m3的区域，小型浮游植物是Chl a的主要贡献者，贡献率为65.43%（图4C2）；在Chl a浓度小于1 mg/m3的区域，小型（58.10%）和微微型（32.53%）游植物是Chl a的主要贡献者（图4C3、C4）。

与之前的研究结果比较，黄海浮游植物Chl a浓度与粒级结构空间分布特征基本相似。Chl a浓度从近岸到黄海中部，逐渐降低；浮游植物的粒级结构在近岸以小型浮游植物为主，在黄海中部冷水团区域，微型和微微型浮游植物的比例明显升高（Fu et al，2009；黄邦钦等，2006；孙晓霞等，2012）。然而，Chl a的绝对浓度与粒级结构的贡献率存在一定差异（表3）。本次调查离岸、近岸Chl a浓度平均值分别是0.69和2.92 mg/m3，略高于Fu等（2009）在2006年夏季的调查结果0.57和2.21 mg/m3；粒级结构与孙晓霞等（2012）和Fu等（2009）的研究相比，小型浮游植物贡献率偏高，微型和微微型浮游植物贡献率偏低。这可能是受到调查时间、站位以及分析方法差异的影响。由于不同年份环境因子也可能发生较大变化，粒级结构也会发生变化（Aiken et al，2009），例如，南黄海春季不同年份Chl a的绝对浓度与粒级结构的贡献率存在明显差异（表3），因此Chl a绝对浓度与粒径贡献率的可比性不高。

 

表3 黄海Chl a和浮游植物粒级结构比较

  

季节 研究区域 采样时间 Chl a范围（均值）/mg·m-3 Micro/% Nano/% Pico/% 参考文献夏季离岸 2015年8月17-28日 0.13-2.83（0.69） 37 29 34 本研究近岸 0.34-15.5（2.98） 69 14 17离岸 2011年8月12-29日 黄东海平均0.63 22 51 27 孙晓霞等，2012近岸 28 62 10离岸 2006年7月14日-8月6日 0.09-2.82（0.57） 9 43 48 Fu et al，2009近岸 0.35-12.12（2.21） 33 36 31春季整体 2011年4月6-25日 平均1.71 75.3 14.7 10 孙晓霞等，2012离岸 2007年4月4-26日 0.24-3.95（1.12） 34 26 40 Fu et al，2009近岸 0.37-3.16（1.00） 25 45 30整体 2000-2001年4-5月 平均0.7 15.7 57.1 27.1 黄邦钦等，2006

本研究采用的色素分类法虽然是一个较为准确的方法，但它是按浮游植物种群平均粒径来划分粒级，同一种群粒径分布往往十分广泛，例如，硅藻通常被划分为小型浮游植物，但是也存在相当比例的硅藻物种粒径范围属于微型浮游植物（Uitz et al，2009）。另外，一些指示浮游植物粒级的色素并不具有排他性，例如，Fuco虽然是硅藻的主要特征色素，但也存在于有些甲藻和定鞭藻（微型浮游植物）中（Uitz et al，2009），因此，容易高估小型浮游植物的贡献率（Roy et al，2011；Uitz et al，2009）。本研究的结果体现出了这一缺陷，与历史数据相比，我们结果中的小型浮游植物贡献率明显偏高。然而，逐级过滤法也存在一定程度上高估小型浮游植物，低估微型和微微型浮游植物的情况（孙军等，2003）。因此，需要进一步对比评估两种研究方法的差异。

3 结论

通过对比UHPLC和UHPLC-MS/MS两种色素检测方法，发现两种方法的整体吻合度较高，均适用于黄海色素样品的检测。色素分类法获得的Chl a浓度和浮游植物粒级结构在整体空间分布特征上与逐级过滤法基本相似，但Chl a绝对浓度以及粒径贡献率存在一定的差别，需要进一步研究产生差异的原因。

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