我国自1970年开始水稻花药培养研究以来，历经40多年的发展，在花药培养方法、诱导手段、取材世代、群体规模、花粉植株主要性状表现及遗传机理等方面研究上不断完善，花药培养育种基础理论不断充实，花药培养育种技术体系日趋完善。水稻花药培养（简称花培）育种是当今水稻生物技术育种中较为成熟、实用、有效的育种技术，它具有加速缩短育种周期、排除显隐基因的干扰、提高选择效率、加速有效性状转移等优势[1-2]，在水稻遗传育种研究中被广泛应用。花培育种与常规育种手段和杂交稻育种手段相结合，已经育出了40余个花培品种及恢复系、不育系等，为品种改良创造了大量的种质资源，创造了巨大的社会效益和经济效益[3]。花培技术与常规杂交育种、远缘杂交育种以及诱变育种技术相结合，发展形成了一套新的育种技术体系，在传统农业向高技术农业的转化中发挥着重要的作用，是一种快速有效的育种途径。结合辽宁省水稻花培育种实践和育种现状，笔者概述了水稻花药培养技术的基础研究及其在育种中的应用情况，对水稻花药培养研究与应用的发展趋势和工作方向作一些初步探讨，以期发挥水稻花培育种的技术优势，为其更好地应用于北方粳稻育种提供参考。

1 影响水稻花药培养效率的主要因素

1.1 基因型

基因型对水稻花药培养力影响很大，是影响水稻花药培养力的关键因素。水稻不同种、亚种、品种间花药培养力有明显差异。赵成章等[4]研究表明，爪哇稻＞粳籼杂种＞粳稻＞籼籼杂种＞籼稻。韦鹏霄等[5]研究表明，粳粳杂种＞粳稻品种＞粳籼杂种＞糯稻品种＞籼粳杂种＞籼籼杂种＞籼稻品种＞栽野杂种＞野生稻。张林等[6]研究表明，粳稻的出愈率和最高出愈率均大于籼稻，分化率差异不大，亚种中都存在出愈率和分化率高和低的品种，出愈率和分化率无相关。即使同为粳或籼稻杂交稻，由于基因型的差异不同品种的花培效率也有很大区别[7]。苗立新等[8-9]研究表明，不同基因型的愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力有明显差异，杂种F1的愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力介于双亲之间而偏向母本。花药培养力的两个性状即愈伤组织诱导率和绿苗分化率是由有核基因控制的数量性状，并且这两个性状是独立遗传的[10]。水稻花药培养力受多基因控制的数量性状，随基因型的差异变化很大[11]。邹礼平等[12]研究表明，花药培养性状是可遗传的，对于愈伤组织诱导率和白苗分化率，基因的加性效应和非加性效应同等重要，而对于绿苗分化率和绿苗生产率则以加性效应为主，这2个性状的狭义遗传力均较高，通过合理配组提高花药培养能力是可能的。殷丽青等[13]研究表明，籼粳正反交对花药培养力的影响可能主要是细胞质基因差异。李欣等[14]研究表明，母本细胞质对杂种F1的培养力是有较大影响的，因此选择培养反应好的品种作母本配组对提高杂种F1的花药培养力是有效的。江树业等[15]研究表明，组合中若有培养力较高的粳稻血缘品种，绿苗分化率高，培养力也高，培养效率也较好。王建平等[16]研究表明，利用广亲和品种与其他粳籼品种杂交的F1或其本身，花药培养效率都较好。

1.2 取材时期

相同基因型材料的花粉发育时期与愈伤诱导和绿苗分化存在极为密切的关系。普遍认为花粉细胞处于单核中晚期的幼穗具有最大诱导愈伤组织的能力，而单核初期和双核期花粉愈伤组织诱导率显著降低。实践中，研究人员总结出依据植株和颖花形态并结合镜检结果来综合判断花粉发育时期的方法[7，11，17]，基本可以满足育种需要。具体指标：① 穗苞大而不破、剑叶与其下一叶的叶枕间距离5～7 cm时，一般材料幼穗中部花粉处于单核期；② 颖壳颜色呈浅绿色、大小接近成熟颖壳、硬度适中，花粉多处于单核期；③ 花丝加花药长度介于颖壳大小的1/3～1/2，花粉发育处于单核期。不同组合的最适叶枕距有明显差异，密穗型品种为5 cm左右，早熟或特早熟类型品种约3 cm左右，半矮生型品种10 cm左右[17]，这种标准的可靠性因品种（组合）的不同而有差异。

1.3 低温预处理

低温预处理是花培育种中的必要环节，能明显提高水稻花药愈伤组织诱导率和绿苗分化率，提高花药培养效率。关于低温处理的时间，许多学者进行了研究，张连平等[18]认为10℃下低温预处理8 d效果好于4 d，超过10 d后培养效果反而下降。季彪俊等[19]认为，籼稻原产热带，对低温较敏感，预处理时间不宜过长，在8～10℃下处理7～10 d为最佳。不同基因型小孢子对低温的耐受力不同，因而所需的处理温度、处理时间也不同，不同材料之间存在不同的“温时比”。在育种实践中，一般8～10℃下预处理7～10 d可以获得较好的培养效果。

1.4 基本培养基

培养基是影响花药培养效果的重要因素。应用于花药培养的基本培养基种类很多，在诱导培养基中，通用、改良N6和M8培养基对各种类型材料（籼、粳、籼粳交后代）具有普遍适用性；N6对粳稻具有特殊效果；SK3对籼粳交后代有较好效果[20]。分化培养基一般常用的有MS培养基、M8培养基等。季彪俊等[19]认为，在培养偏粳、粳籼交基因型材料时，SK3、N6培养基上诱导出的愈伤组织结构致密，绿苗分化率高，成活率也较高，但后代植株多偏粳型或中间型。王伍梅等[21]研究发现，N6培养基可以作为粳稻或籼粳交后代的诱导培养基，M8培养基可以作为籼稻或籼粳交后代组合的愈伤诱导培养基。同一基因型材料在不同的培养基中进行培养，表现出不同的培养效果，培养基与基因型的互作效应也是明显的[22]。

粳稻的花药培养相对于籼稻更容易获得较大绿苗群体，为了使花药培养技术更好地在北方粳稻育种中发挥作用，应在以下几个方面加强研究：① 进一步优化水稻花药培养关键技术，通过选择多个基本培养基、调节激素配比和外源添加物来改善培养条件，采取适当的方法提高绿苗移栽成活率和花培后代单倍体的加倍率，提高花药培养效率，构建高效水稻花药培养体系；② 加强对水稻花培育种基础研究，对水稻花药培养力进行遗传分析，采用分子标记手段，将控制花培能力的有关数量性状基因组合在一起，从根本上解决花培效率低的问题；③ 利用花培群体，加强花培后代的遗传方面研究，探究花培植株在产量性状、米质性状、抗病性状、耐盐性状及特定性状（如糯型、香型、有色米）的遗传规律等，对于常规育种和花药培养育种具有指导意义。

1.5 外源生长刺激物质

水稻花培技术结合常规育种手段，在新品种选育和特异新种资创制研究方面应用广泛并取得了较好的效果。黑龙江省农业科学院采用水稻花培技术育成了合江 21 号和龙粳 1、3、4、7、8、10、12、13等品种以及大批新种质，又利用这些种质作亲本育成了龙粳系列、龙花系列及龙选等大批材料。中国农业科学院作物科学研究所采用水稻花培技术成功选育出中花8号、10号、11号、12号、13号等中花系列品种[2]；辽宁省盐碱地利用研究所采用水稻花培技术与常规育种相结合成功选育出花粳15、花粳45和盐粳22等品种，并创制了大批新种资，作为中间材料应用于育种研究中。浙江省嘉兴市农科院利用浙北粳稻资源也育成了花育1号。在抗病育种中，杂交技术与水稻花培技术相结合往往易于获得高抗、优质的新品种，如龙粳8号即是结合水稻花培技术选育成功的寒地优良品种。孙岩松等[28]研究表明，经水稻花药培养入选的产量鉴定新品系的选择效率为16.94%，是同期常规新品系选择效率1.49倍，经花药培养育成审定品种的选择效率为0.93%，是同期常规育成审定品种选择效率3.22倍。此外，水稻花药培养技术还可以为水稻分子标记构建永久性的作图群体[2，3，20]。

教学之初，发现每每我教授新单词时，孩子们会用笔在书上写些什么，走进一看原来他在ruler 旁写汉字“路了”，在pencil旁备注“盆手儿”。最初遇到这些情况，我都会及时制止并严厉教导不可以这样备注读音。但是，在后来的教学反思时，我意识到不可以一味地封杀这种方法。对于孩子们来说，这种方法确实是最适合他们的，能帮助学生迅速地读会单词并在遗忘时快速回忆起读音。这其实也是知识的迁移，只是我们作为老师需要引导他们进行有效的正迁移。

2 水稻花培技术在水稻育种中的应用

2.1 在常规稻育种中的应用

外源激素种类及配比在愈伤组织的诱导与绿苗分化过程中起着非常关键的作用，不同基因型材料对培养基中激素种类及配比水平的反应是有差别的。一般籼稻比粳稻要求更高的激素水平，对籼稻和籼粳杂交的组合，诱导培养基中以1～2 mg/L的2,4-D配合2～5 mg/L的NAA效果较好，而绿苗分化则要求更低浓度的生长素[2]。张志雄等[23]在M8诱导培养基中加入适当的NAA、2,4-D、6-BA、激动素，结果表明NAA、2,4-D附加不同的细胞分裂素处理的花药培养力均高于2,4-D或2,4-D配KT处理的花药培养力；附加激动素可提高绿苗的分化率，但对愈伤组织的诱导反而有抑制作用。冯双华等 [22]认为在N6诱导培养基中添加1.5 mg/L 2,4-D与1.5 mg/L NAA比单一添加2.0 mg/L 2,4-D的绿苗分化率要高；在MS分化培养基中添加2.0 mg/L 6-BA比添加2.0 mg/L激动素的绿苗分化率要高。合理使用和配比2,4-D、6-BA、KT和NAA等激素可以提高水稻的花药培养力。段敏等[24]以粳粳交F2代为试验材料，结果表明，M8＋6%麦芽糖＋2 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L KT＋1 mg/L NAA＋100 mg/L脯氨酸＋500 mg/L谷氨酰胺＋100 mg/L水解酪蛋白为诱导培养基效果较好，2种材料的花药诱导率分别为5.56%和12.74%；分化培养基中KT∶6-BA为1∶4时可促进愈伤组织萌发出更多的绿点，绿点率可达47.42%，建立了一套适用于本生态区粳稻育种材料的花药培养体系。

2.2 在杂交稻育种中的应用

水稻籼粳杂交育种已成为当今水稻超高产育种研究的重要手段和方法，国内外超高产育种大多采取籼粳亚种间杂交的技术路线。籼粳交常规育种存在早代结实率低，后代疯狂分离，采用回交、复交的方法选育时间长，育种规模大等问题。水稻花培育种技术在籼粳杂交育种上具有缩短育种周期，变异类型多，提高籼粳杂交后代结实率，打破不利性状的连锁关系，提高选择效率等优势。籼粳杂交后代作为一种籼粳中间型材料在花药培养技术中得到了广泛应用和研究。李竹英等[33]研究结果表明：籼粳交花药培养力与亲本呈正相关，单交、回交及各世代培养力顺序为 B1F1＞F2＞F1；花培后代不仅具有与相应常规后代同样丰富的遗传类型，而且使某些隐性基因在早世代充分表达；利用籼粳交选育粳稻新品种时，应以粳稻作轮回亲本，从B1F1或B1F2中选株进行花培，效果较佳。王建平等[16]通过对6个籼粳杂交组合F1进行花药培养发现，花培出愈率主要受核基因控制，母性效应不显著，品种的广亲和性对于提高籼粳亚种间杂交F1出愈率有明显的正效应。张再君等[34]研究结果表明：秋光是一个培养力很高的品种，以秋光作为母本的粳籼交组合的花药培养可以得到较高的培养力；培养力高低的一般趋势是粳（籼）广亲和＞籼（粳）广亲和＞粳/广亲和＞粳＞粳/粳＞粳/籼。张楷正等[35]利用水稻籼粳交偏籼后代的10份材料进行了花药培养效果研究，结果表明：不同株系间培养效果存在较大差异，出愈率和绿苗分化率之间没有必然联系；N6、SK3培养基对籼粳交偏籼后代材料的培养效果明显优于通用培养基，N6又稍优于SK3培养基。施利利等[36]以津稻291/IRBB60籼梗杂交F1、反交F1及其亲本的花药为外植体，对影响花药培养效果的因素进行研究，结果表明，在SK3基本培养基中添加2 mg/L 2,4-D，1 mg/L NAA和1 mg/L KT比添加2 mg/L 2,4-D的愈伤诱导率高0.67%～2.78%；在诱导培养基中添加水解酪蛋白能明显提高正交F1的愈伤诱导率；MS＋1 mg/L NAA＋2 mg/L 6-BA＋0.55 mg/L KT 分化培养基得到了较高的绿苗分化率；正交F1的愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力显著地高于反交F1。郭书巧等[37]研究结果表明：M8＋2 mg/L 2.4-D＋1 mg/L NAA＋0.2 mg/L KT为最佳诱导培养基，籼粳杂交F1花药愈伤组织诱导率达4.1%～4.5%；培养基中添加水解酪蛋白或酵母提取物，能明显提高诱导率，增幅达 20.5%～27.3%；M8＋2.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L KT为最佳分化培养基，籼粳杂交F1的愈伤组织绿苗分化率达14.3%～25.0%。然而，由于引入了籼稻的成分，籼粳杂交将同时存在花药培养率低、绿苗群体较小的缺陷。在以选育粳稻品种为目标时，在选材方面首先考虑到籼粳交后代能正常抽穗成熟，用花培绿苗率高、育种目标性状突出的粳稻品种作轮回亲本进行回交，以B1F1或B1F2或B2F1代进行花培，绿苗生产率也较高，接种规模较小，后代结实率提高，因而容易选到符合育种目标的材料[33]。

3 讨论

虽然水稻花培技术已成为水稻育种的成熟技术手段，但仍存在不少技术难题与理论问题，材料间差异大的问题至今没有大的突破，水稻花培技术存在的成苗率低、单倍体率较高、后代群体规模有限、后代变异不足等问题还没有彻底解决。由于水稻花培存在明显的基因型差异，每一个环节都会对花药培养效率造成影响，所以，今后在水稻花培育种研究上重点是采用综合技术措施来提高花药培养力和单倍体的加倍率以及花培后代的变异率，提高水稻花培育种效率。

3.1 水稻花培亲本圃的构建和接种材料的创制

材料的基因型是影响水稻花药培养力的关键因素，充分利用常规育种，积累丰富的育种材料，配制优异的组合作为花培的基础材料，这是成功的关键。对具有高培养力的特异种质资源的筛选、引进和利用，对于水稻花培育种至关重要。花培育种的亲本选配既要考虑亲本的农艺性状、品质性状又要考虑其花药培养力，避免花药培养取材的盲目性。这就需要对水稻种资的农艺性状、品质性状、花药培养力等性状进行鉴定归纳，筛选或引入培养力高的特异种质材料，构建水稻花培育种亲本圃。通过优化配组，选择综合性状好且花药培养力高的材料作为花培的主要亲本；综合性状优良而花药培养力低的材料以及综合性一般而花药培养力高的材料作为花培的次要亲本，选择合适的花培亲本以及杂交配组方式，一般采用单交、复交和回交配组方式。在花培育种实践中，常采用F1的花药为培养对象，由于选材盲目性大，再生植株后代中有利用价值的材料相对较少，且变异类型较少。采用F1材料培养，理论上在花培后代中能获得最丰富的遗传重组类型，然而，在花药培养成苗率低、绿苗群体有限的情况下，可能会导致部分遗传类型缺失。从育种角度考虑，依据培养对象的遗传基础，灵活选择取材世代（F1～F3代）进行花培，使培养的基础材料的农艺性状接近于育种目标，增加优良基因型的频率和花培后代的入选率。此外，在工作量允许的情况下，采用多组合、较大接种量的策略，确保足够的花培绿苗群体规模。

一些学者对培养基中添加附加物如水解乳蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、MET、S-3307、苯乙酸等进行了试验研究，在水稻花药培养上也起到较好的效果。陆燕鹏等[25]用脯氨酸、丙氨酸对不同育性的光温敏核不育水稻进行处理，试验结果表明，在不育期附加500 mg/L的脯氨酸对花培有较大的促进作用，脯氨酸处理不育性期比可育性期的出愈率高，而丙氨酸的结果则相反。分化培养基中加入MET可以提高分化率、培育壮苗，提高移栽成活率[1，26]，实践中一般以 2～3 mg/L 为宜[8-9]。 冯英等[27]认为低浓度水平的S-3307可以明显提高水稻花药愈伤组织的诱导率和分化率。

3.2 优化关键技术，加强水稻花培育种基础研究和后代遗传研究

(1)网络平台交流。为了帮助那些既想陪伴留守子女顺利成长，又要在城市中完成繁重工作的打工父母实现跨时空的家庭教育，农村小学教师、监护人应与家长对接，通过微信或者QQ创建在线交流平台，各个班级应建立家长微信群或者QQ群，并且加强建设和管理，实时了解孩子校内校外的生活学习进展，了解更多更专业的育儿知识。

3.3 加强籼粳交后代的花药培养的研究

水稻花培技术应用于杂交水稻具有独特的作用和成效，可加速提纯或选育不育系、保持系和恢复系，还可“定向”从优良杂交稻组合育出“似亲”或“超亲”的花培纯系，“固定”杂种优势以持续多代用于生产，在籼型杂交稻中进行了较多研究。周元昌等[29]研究认为，花培对培矮64S的遗传纯化是有效的，花培后代育性稳定。刘建平等[30]利用花培技术育成粳稻光温敏核不育系1647S在15 h长光照的条件下表现不育性稳定，综合性状优良。张能义等[31]从组合N5047S/浙农大40和N5047S/102428分别获得84个和35个花培系，构建成了2个DH群体，在长日下这2个DH群体育性发生明显分离，其中28份为光敏核不育系，短日下各花培系都可育；从N5047S/102428组合中筛选出1个花培系浙农大13S，经人工气候箱鉴定表现为光敏核不育特性。李欣等[32]对7个籼型光敏雄性不育系及其杂交F1进行花培的研究发现，光敏不育水稻虽然雄性不育，但其愈伤诱导率、绿苗产量均高于常规籼稻品种以及籼/籼、籼/粳杂交F1；光敏雄性不育系的花培后代植株中，单倍体、二倍体、多倍体的出现频率与常规品种花培后代相似。邹礼平等[12]对14个光、温敏不育系的花培结果表明，不同基因型花培能力差异很大，白苗分化率普遍较高，短日可育条件下光敏核不育水稻的花培能力高于长日不育条件下的花培能力。光温敏核不育水稻花培后代育性虽然有差异，但表现还是基本稳定的，不育性的表现不随世代育性敏感期内温度的变化而发生“漂移”。

3.4 结合其他育种技术，充分发挥水稻花培育种技术优势

在粳稻种质创新方面，采用籼粳亚种间杂交、地理或生态远缘杂交、复交育种等杂交方式结合水稻花药培养技术可以实现杂交后代快速纯合和尽早选择，创制出一系列特异的中间材料。水稻花培育种工作中，应当改变以往的仅以选育品种为最终目标，将创制新种质资源或特异中间材料作为水稻花培育种工作重点，将创制出的特异的中间材料应用于水稻育种中。

水稻花药培养育种具有缩短育种周期、排除显隐基因的干扰、提高选择效率、加速有效性状转移等优势，但由于其关键技术未获得实质性突破，导致绿苗群体规模小，后代变异类型少，有利用价值材料少。现阶段，水稻育种要求高产、优质、多抗、适应性强相结合，这就要求更多数优良基因的聚合，从花培DH后代中直接选出各方面性状优良的品种的难度越来越大，近年来，基本没有花培品种通过审定推广，这些严重制约着水稻花培育种研究与应用的发展。应当采用辩证的角度对待水稻花药培养工作，不盲目夸大其作用，也不能妄自认为水稻花培没有前途，这项技术还需要不断地研究完善。随着水稻育种目标的多元化，高产型、优质型、抗病型、耐盐碱型、特种米（香型、糯型、有色米）等品种类型进一步细化，水稻花药培养技术结合其他育种技术，在新品种选育及育种中间材料的创制研究方面具有更广阔的空间，在水稻育种中将会发挥更大的作用。

花药培养在杂交稻育种应用方面，前人也做了大量的研究，并取得了一系列成果，但很多技术难题并没有解决，而且很多成果是建立在杂交籼稻基础上的，针对北方杂交粳稻的研究很少或不深入，相关研究水平趋待进一步提高。笔者认为，花培技术在北方杂交粳稻研究中应用方向，主要应在以下方面加强：① 用花培后代来研究杂交水稻主要农艺性状、品质性状、光温敏核不育性、恢复性、杂种优势等的遗传机理研究；② 通过花培技术筛选变异丰富的中间材料，作为杂交水稻亲本选育的桥梁亲本；③ 转育或选育光温敏不育系、不育系提纯等方面。

对照组中，男性患者27例，女性患者23例，年龄区间为41.15～78.52岁，平均年龄为（59.63±1.17）岁。心功能诊断结果：Ⅰ级患者21例，Ⅱ级患者15例，Ⅲ级患者10例，Ⅳ级患者4例。观察组中，男性患者31例，女性患者19例，年龄区间为42.22～79.63岁，平均年龄为（60.25±1.31）岁。心功能诊断结果：Ⅰ级患者22例，Ⅱ级患者14例，Ⅲ级患者9例，Ⅳ级患者5例。两组受试者基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

C、D泊位主要装卸货种为柴油，其他危险品均为少量采用瓶装运输（如乙炔、油漆等），按装卸丙类危险品的二级码头进行消防设计。

我一努力，那根竹竿就被我伸了出去。我真是一个很有天分的人，有救星了，一切都仿佛是天意，我伸出去的那根竹竿不偏不倚，竟然扑棱到了一个人的腿。

花药培养中获得变异体的频率较高，选用优异的基础材料，在培养基或培养条件中附加选择压力，产生定向突变如耐盐碱突变体、抗稻瘟病突变体等并加强目的性状的筛选，这是花培育种与诱变育种结合的一个发展方向。

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