光合碳同化中的关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)是一种双功能酶，其羧化活性催化1,5-二磷酸核酮糖(ribulose-1,5-bisphosphate, RuBP)和CO2反应起始光合反应的碳反应过程，加氧活性催化RuBP和O2反应起始光呼吸[1-2]，Rubisco羧化/加氧活性的高低主要依赖于CO2/O2[3]，羧化反应产生2分子的磷酸甘油酸进入Calvin循环，而加氧反应产生一分子的磷酸乙醇酸和一分子的磷酸甘油酸，磷酸乙醇酸进入光呼吸代谢最终产生磷酸甘油酸[4-5]。整个光呼吸过程中，两分子的磷酸乙醇酸经过光呼吸甘氨酸氧化后在线粒体中释放一分子的CO2和一分子的NH3，CO2的释放导致四分之一的碳损失从而降低了光合效率[6]。虽然Rubisco是植物体中含量最丰富的酶，但其催化效率却很低[7]。在大多数的C3植物中，一个分子的RuBP被氧化的同时有2.1～2.6个分子的RuBP被羧化[8]。光呼吸可使C3植物的净光合速率降低25%～30%[9-10]，所以在光呼吸过程中碳和能量的损失对C3植物尤其是禾本科作物的产量造成很大的影响，且在高温、干旱和强光等逆境条件下影响更大[11]，因此光呼吸被认为是耗能的过程，抑制光呼吸可以提高植物的净光合速率，进而有效提高植物生物量或作物产量[10]。

目前提高光合速率主要有以下几种途径：一是改造C3植物的Rubisco，由于CO2和O2竞争的是Rubisco的同一活性位点[12]，因此通过直接改造Rubisco活性位点的方式来提高Rubisco的羧化效率可行性不高[13-14]。2014年，针对Rubisco的改造取得了突破性的进展，研究者敲除了烟草(Nicotiana tabacum)Rubisco大亚基编码基因，同时将蓝藻Se7942的Rubisco小亚基以及组装伴侣蛋白RbcX或羧化酶蛋白CcmM35转入烟草，结果发现2种转基因烟草都可以进行光合作用，且其Rubisco同化CO2的速率高于野生型烟草[15]，这为改造Rubisco提高植物的光合效率提供了新思路；二是向C3植物中引入C4植物的CO2浓缩机制相关酶，C4植物可通过“CO2泵”将空气中的CO2输入到维管束鞘细胞中，提高Rubisco周围的CO2浓度，起到抑制光呼吸提高光合速率的作用[16]。虽然提高温室中CO2浓度可以显著提高植物的光合效率[17]，但在大田条件下提高空气CO2浓度却难以实现。有研究者认为可以将C4植物中CO2浓缩相关酶基因转入C3植物，以期在C3植物中实现CO2浓缩机制[18]。但由于C4植物中CO2浓缩机制涉及多种酶以及C3植物和C4植物叶片结构的差异等，通过转化一种或几种CO2浓缩相关基因以提高C3植物光合速率难以现实[19]；三是通过直接改造C3植物的光呼吸代谢途径。细菌或蓝藻只需利用乙醇酸脱氢酶(glycolate dehydrogenase，GDH)、乙醛酸醛连接酶(glyoxylate carboligase，GCL)和羟基丙二酸半醛还原酶(tratronic semialdehyde reductase，TSR)这3种酶就可以将乙醇酸代谢，最终生成甘油酸并释放出CO2[20]。Kebeish等[21]将大肠杆菌gdh、gcl以及tsr基因转入拟南芥(Arabidopsis thaliana)，在拟南芥叶绿体中成功构建了一条代谢乙醇酸并将CO2直接释放到叶绿体中的支路，并发现转基因植株生长更快，生物量也高于野生型植株，同时含有更多的可溶性糖，表明植株的光呼吸受到抑制可以提高光合速率，这为改造光呼吸提高植物光合效率提供了一条新的途径。Maier等[22]将乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase，GO)、苹果酸合成酶(malate synthase，MS)以及过氧化氢酶(catalase，CAT)转入拟南芥，同样提高了转基因植株的光合速率及植株干重等，虽然所用基因不同，但这2种光呼吸改造的原理一致，都是直接将乙醇酸在叶绿体中代谢并释放CO2，提高叶绿体内部的CO2/O2，从而起到抑制光呼吸提高光合的作用。

本研究基于光呼吸代谢途径改造原理，以集胞藻PCC6803为试验材料，扩增获得乙醇酸脱氢酶基因gdh，将其与水稻(Oryza sativa)Rubisco小亚基叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide of rice Rubisco small subunit， RCTP)融合，并进一步将融合基因RCTP-gdh连入携带有eGFP的瞬时表达载体，提取水稻原生质体，通过PEG介导法[23-24]将重组瞬时表达载体转入水稻原生质体，以激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位。以期为进一步利用集胞藻PCC6803 gdh基因改造C3植物光呼吸奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以水稻中花11为材料进行基因组DNA的提取及原生质体的分离，集胞藻PCC6803基因组DNA由中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所米华玲研究员提供，瞬时表达载体P322-d1-eGFP来自华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室。

患病羊在发病过程中会表现出较为严重的腹泻症状，这时可利用磺胺类药物或者抗菌素对其实施具体治疗。具体而言，就成年羊来讲，可利用百分之十的黄安嘧啶注射液20到30毫升左右对其实施肌肉注射操作；就羔羊而言，也可以利用此类药物10到15毫升进行注射，并应以天为单位，2次/d。倘若患病羊表现出腹痛症状，则可利用百分之十的安乃近4到6毫升，对其实施肌肉注射操作，同时，利用鞣酸蛋白2到5克对其实施灌服操作。

进一步以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，以gdh-PstI-F和gdh-SacI-R为引物，通过PCR扩增获得一条大小约1.5 kb的特异片段(图3)，与预期的集胞藻PCC6803 gdh编码框大小相吻合。

乙醇酸脱氢酶蛋白需定位到叶绿体内才可能起到催化乙醇酸的作用，故需在gdh的上游加上叶绿体转运肽序列。以Pst I分别酶切目的基因gdh和Rubisco小亚基转运肽RCTP，以RCTP上游引物和gdh下游引物从酶切产物中筛选扩增获得一条约1.7 kb的片段(图4)。

Where: Fi is the i-th foot bolt′s axial pulling force; Li is distance which is from the i-th foot bolt′s axis to frame bolt group′s centroid.

1.2 水稻Rubisco小亚基转运肽的克隆

外源基因需定位到叶绿体才可能达到改造光呼吸代谢的目的，故需要克隆叶绿体转运肽序列。以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增得到一条大小约150 bp的片段(图2)，将该片段连接到T载体后测序，结果获得147 bp的水稻Rubisco小亚基叶绿体定位信号片段。

1.3 集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶的克隆

将RCTP和gdh的PCR扩增产物回收，以Nco I和Pst I双酶切处理RCTP片段，以Pst I和Sac I双酶切处理gdh片段，将两者混合后连接。以连接产物为模板，以RCTP的上游引物和gdh的下游引物筛选扩增融合基因RCTP-gdh。

1.4 PCR筛选融合基因RCTP-gdh

根据集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶基因(sll0404)序列设计特异引物扩增其开放阅读框(open reading frame，ORF)。上游引物为gdh-PstI-F：5′-T A T T C T G C A G A T G G C C A T T T T C T C C C C C G T CA-3′，下游引物为gdh-SacI-R：5′-C C A T G A G C T C C A A T A A A T T T C C T C C A T T T TC-3′，下划线处分别为Pst I和Sac I的酶切位点。

对王而言，林也是个棘手的学生，他画了一幅惹起很大争议的习作：《席方平》，下笔避开传统苏俄绘画中列宾、苏里柯夫的褐色而展现了血淋淋的红色。很难简单地推断林这样做的含义仅仅是在作技法上的探求，还是另有用意，试图表现他理解的民族文化中传统的苦难。

1.5 瞬时表达载体RCTP-GDH-eGFP-d1的构建

由cyanobase数据库(http://genome.microbedb.jp/cyanobase)搜索获得glcD核苷酸序列(http://genome.microbedb.jp/cyanobase/GCA_000009725.1/genes/sll0404)，由图1可知，其ORF共1 479 bp，编码492个氨基酸，保守结构域分析表明，含有FAD结合域(51～187 aa)、FAD关联的氧化酶活性(222～464 aa)以及乙醇酸氧化酶亚基(glycolate oxidase subunit, GlcD，51～463 aa)，预测其编码产物为GlcD；DNAStar分析表明，该蛋白理论等电点为4.79，分子量为53.03 kDa。虽然注释为乙醇酸氧化酶亚基，但Eisenhut等[19]研究表明，GlcD的表达蛋白具有依赖于NAD+的乙醇酸脱氢酶活性而不是乙醇酸氧化酶的活性，表明在集胞藻PCC6803中，GlcD确实具有乙醇酸脱氢酶的活性，故为表述方便，统一以gdh表示本研究中的集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶基因。

1.6 融合蛋白RCTP-GDH-eGFP的定位分析

水稻原生质体的制备以及PEG介导的质粒转化参考Chen等[23]和Tang等[24]的方法，并略做改进。水稻种子浸种催芽后以木村B营养液培养10 d，将根部以上3.0～3.5 cm部分切成约0.5 mm的小段，在25℃下将材料浸入酶解液[10 mmol·L-1 MES，pH值 5.7，0.5 mol·L -1甘露醇，20 mmol·L-1 KCl，10 mmol·L-1 CaCl2， 0.1%BSA，1.5%纤维素酶R10，0.75% 果胶酶(R10)]避光酶解4～4.5 h，室温下继续以W5(2 mmol·L-1 MES，pH值5.7，154 mmol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1 KCl，125 mmol·L-1 CaCl2)处理1 h，100×g离心8 min收集原生质体，以适量MMG溶液(4 mmol·L-1 MES，0.6 mol·L-1 甘露醇，15 mmol L-1 MgCl2)重悬原生质体。

质粒转化原生质体：将100 μL原生质体悬浮液、120 μL PEG4000溶液[40% PEG4000(w/v)]，0.4 mol·L-1甘露醇，100 mmol·L-1 CaCl2]和10～20 μg质粒DNA温和混匀，室温放置20 min，缓慢加入2倍体积的W5溶液终止转化，300×g离心5 min后，弃上清，缓慢加入1 mL W1溶液(4 mmol·L-1 MES，pH值5.7，0.5 mol·L-1甘露醇，4 mmol·L-1KCl)并温和混匀。黑暗中放置18 h或24 h后离心(200×g, 5 min)收集原生质体。以激光共聚焦显微镜LSM780在488 nm下观察eGFP。

MAX3232是Maxim公司推出的一款低功耗、高速率的电平转换芯片，工作电压范围为3～5.5 V.外部仅需两个0.1 μF、两个1 μF的小尺寸电荷泵电容，即可实现TTL与RS-232之间的转换.此外，MAX3232具有高速率的数据传输，在120 Kbps的速率下，依然可以保证电平转换的可靠性、稳定性.MAX3232外设图如图4所示，它可以同时完成两个串口的电平转换.

2 结果与分析

2.1 集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶的生物信息学分析

将PCR筛选获得的片段回收，以Nco I和Sac I分别酶切处理回收片段及瞬时表达载体，连接后转入大肠杆菌感受态细胞DH10B，提取质粒酶切检测阳性克隆。

Ⅰ级(有意识或嗜睡)31例;Ⅱ级(困倦或朦胧)53例;Ⅲ级(轻度昏迷)156例,(昏迷)90例,Ⅳ级(深度昏迷),20例。

  

图1 集胞藻PCC6803 glcD蛋白的保守结构域分析Fig.1 Conserved domain analysis of Synechocystis sp. PCC 6803 glcD protein

2.2 水稻Rubisco小亚基转运肽及拟南芥乙醇酸脱氢酶基因的克隆

采用CTAB法[25]提取水稻基因组DNA，根据GenBank中水稻Rubisco小亚基(ACCESSION Num: AF017364)序列设计引物扩增转运肽序列，引物序列如下，RCTP-NcoI-F：5′-A T A C C A T G G A T G G C C C C C T C C G T G A TG-3′，RCTP-PstI-R：5′-C C T A C T G C A G C T G C A T G C A C C T G A T C CT-3′，下划线处分别为Nco I和Pst I的酶切位点。

付出终有回报。社会各界也给予华南公司众多的支持和荣誉，公司获得了中国驰名商标企业、中国病患护理示范单位、全国百强家庭服务业企业、国家一级资质企业、全国家庭服务行业先进单位、中国家庭服务业协会病患护理专业委员会基地、中国物业服务十大优秀品牌企业、长三角健康服务业示范企业、中国物业管理协会标准化委员会委员、AAA级重合同守信用企业、物业行业AAA级诚信企业、江苏省文明单位、江苏省服务业名牌企业、江苏省就业先进集体、扬州市百强重点企业等，并通过了ISO9001质量体系、ISO14001环境体系、OHSAS18001职业健康安全体系等三大国际权威体系认证。

  

注：M：分子量标准DL2000；1～2：PCR扩增产物。Note: M: DL2000 DNA marker. 1～2: PCR products.图2 水稻Rubisco小亚基转运肽的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of rice Rubisco small subunit transit peptide

  

注：M：分子量标准DL2000；1～2：PCR扩增产物。Note: M: DL2000 DNA marker. 1-2: PCR products.图3 PCR扩增集胞藻PCC6803 gdh基因Fig.3 PCR amplification of glycolate dehydrogenase in Synechocystis sp. PCC 6803

2.3 融合基因RCTP-gdh的获得

限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；用于原生质体分离的纤维素酶R10和果胶酶R10购自日本Yakult Honsha有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

  

注：M：分子量标准 DL5000；1～2：PCR扩增产物。Note:M: DL2000 DNA marker. 1-2: PCR products.图4 PCR筛选融合基因RCTP-gdhFig.4 Screen of fusion gene RCTP-gdh by PCR

2.4 瞬时表达载体RCTP-GDH-eGFP-d1的构建

  

注：eGFP：eGFP荧光；Chlorophyll：叶绿素自发荧光；Bright：亮视野下图像；Merged：eGFP荧光与叶绿素自发荧光和亮视野下图像的叠加图像。下同。Bars=5 μm。Note: eGFP: eGFP fluorescence. Chlorophyll: Chlorophyll autofluorescence. Bright: Bright-field image. Merged: Superposition of eGFP, chlorophyll and bright-field signals. The same as following. Bars=5 μm.图6 18 h时融合蛋白RCTP-GDH-eGFP的亚细胞定位分析Fig.6 Subcellular targeting analysis of fusion protein RCTP-GDH-eGFP after transformed for 18 hours

将PCR筛选片段和瞬时表达载体P322-d1-eGFP分别以Nco I和Sac I进行双酶切，连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，提取质粒DNA进行酶切检测，在所检测的4个样品中均可以切下预期大小的片段(图5)，表明融合片段已成功连接到瞬时表达载体P322-d1-eGFP，将菌液送上海生工生物工程有限公司测序，结果表明融合片段序列与水稻Rubisco小亚基转运肽及集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶序列完全吻合，表明已获得融合片段RCTP-gdh，将该载体命名为RCTP-GDH-eGFP-d1。

  

注：M：分子量标准DL2000；1～4：重组载体RCTP-GDH-eGFP-d1的酶切检测分析。Note: M: DL2000 DNA marker. 1-4: Enzymes digestion analysis of recombinant vector RCTP-GDH-eGFP-d1.图5 重组瞬时表达载体RCTP-GDH-eGFP-d1的酶切分析Fig.5 The digestion analysis of recombinant transient expression vector RCTP-GDH-eGFP-d1

2.5 融合蛋白RCTP-GDH-eGFP的叶绿体定位分析

分离水稻原生质体，通过PEG介导法将重组瞬时表达载体RCTP-GDH-eGFP-d1转入水稻原生质体，18 h后通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白RCTP-GDH-eGFP的定位。由图6可知，融合蛋白RCTP-GDH-eGFP可以定位到叶绿体且呈斑点状(图6-d，箭头所指黄色斑点)，但细胞质中仍有部分融合蛋白同样也呈现斑点状(图6-d，箭头所指绿色斑点)，说明融合蛋白易于形成聚合物。同时叶绿体中仅有部分融合蛋白，仍有较多融合蛋白保留在细胞质中，说明融合蛋白的转运效率可能较低。

为了进一步验证RCTP-GDH-eGFP的转运效率，以RCTP-eGFP为对照，同时延长转化后的孵育时间至24 h。结果发现相比RCTP-eGFP，24 h时更多的融合蛋白RCTP-GDH-eGFP在细胞质中大量积累且已分辨不出斑点状(图7-h)，而叶绿体中由于转运进入的RCTP-GDH-eGFP量较少，故仍呈现较明显的斑点状(图7-h，箭头所示)，同期RCTP-eGFP蛋白则更多地定位于叶绿体，只有少量仍滞留在细胞质中，表明RCTP-GDH-eGFP蛋白的转运效率低于RCTP-eGFP的转运效率。

  

Note: Bars=2 μm.图7 24 h时融合蛋白RCTP- eGFP与RCTP-GDH-eGFP的亚细胞定位分析Fig.7 Subcellular targeting analysis of fusion protein RCTP- eGFP and RCTP-GDH-eGFP after transformed for 24 hours

3 讨论

如何提高植物的光合效率一直是近年来研究的重点，2007年，Kebeish等[21]首次通过改造光呼吸代谢途径显著提高了植物的光合效率，其过程为将细菌甘油酸途径的3个基因gdh、gcl和tsr转入拟南芥，从而使光呼吸代谢产物乙醇酸直接在叶绿体中代谢并释放出CO2，提高了叶绿体中CO2浓度，抑制光呼吸速率，提高了光合速率，同时还发现，即使转入单独的gdh基因也可以起到一定的提高光合效率的效果，表明gdh在该代谢途径中起着关键作用。针对光呼吸代谢途径的改造，Maier等[22]利用GO、MS和CAT将乙醇酸直接在叶绿体中代谢并释放CO2，虽然同样提高了植株的光合速率，但这种改造方法存在明显的缺陷，即GO氧化乙醇酸转变为乙醛酸的过程中会产生H2O2，H2O2会直接对叶绿体尤其是叶绿素产生伤害，尤其是在干旱和高温等逆境胁迫下可能会产生大量的H2O2[26-27]，此外叶绿体自身也是活性氧的一个主要来源，一旦叶绿体内H2O2的含量超过CAT的催化能力将直接对植物产生伤害[28]。大肠杆菌中的GDH由D、E和F 3个亚基组成，理论上只有将3个亚基均转入植物中才可能发挥正常的生理功能，相比单基因的研究，多基因表达载体的构建、转基因植株中多基因的正确表达以及多个亚基的正确组装更困难，实际应用难度较大。集胞藻PCC6803可通过单亚基的乙醇酸脱氢酶直接将乙醇酸代谢，其作用和大肠杆菌中的GDH相同[20]，故可以考虑改用集胞藻PCC6803中的乙醇酸脱氢酶进行光呼吸代谢途径。虽然cyanobase数据库将集胞藻PCC6803中的乙醇酸脱氢酶注释为乙醇酸氧化酶亚基，但该基因具有乙醇酸脱氢酶的活性，而不是乙醇酸氧化酶活性[20]，因此利用集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶进行C3植物光呼吸代谢途径的改造将进一步简化遗传转化程序，效果更佳。

利用外源基因改造光呼吸代谢途径的前提是目的蛋白能够顺利转运进入叶绿体，虽然对于叶绿体蛋白的转运已有了较深刻的认识，但目前的研究重点主要集中于转运蛋白和转运肽等，对成熟蛋白在转运过程中作用的研究较少[29]。Xia等[30]研究表明，Rubisco小亚基前体蛋白(precursor of the small subunit of Rubisco，preSSU)可以与组氨酸蛋白激酶基因、转运蛋白复合体、转录和翻译相关蛋白及复合体、信号转导相关基因和光合合成相关基因6种不同类型的蛋白发生互作，说明叶绿体蛋白的转运需要除转运肽以外更多的因子协调参与。前期研究也发现，叶绿体转运肽并不能将所有融合蛋白转运至叶绿体，说明叶绿体蛋白的转运不仅与转运肽有关[31]，还与成熟蛋白序列密切相关[32-34]，但成熟蛋白如何影响叶绿体蛋白的转运机制目前尚无相关报道，因此在应用目的蛋白进行光呼吸遗传改良试验之前，有必要对目的蛋白的叶绿体定位进行研究。为进一步验证转运肽是否可以顺利将目的蛋白GDH转运进叶绿体基质，本研究构建了瞬时表达载体RCTP-GDH-eGFP并转化水稻原生质体，结果表明水稻Rubisco小亚基转运肽可以顺利地将目的蛋白GDH转运至水稻叶绿体，但不论是转运至叶绿体的还是滞留在细胞质的融合蛋白都趋向于聚集在一起而呈现斑点状。Lee等[31]在研究拟南芥Rubisco小亚基转运肽时发现，氨基酸突变后的转运肽在将GFP蛋白定位到叶绿体中时也呈现斑点状，与本研究结果一致。Lee等[35]和Smith[36]进一步深入研究发现，丙酮酸脱氢酶转运肽E1α-亚基转运肽(E1α-TP)后面连接19个氨基酸的成熟蛋白序列会造成转运至叶绿体的蛋白呈现斑点状[35]，而后面连接4个氨基酸残基时则不会出现斑点状[36]，说明这种斑点状蛋白可能是由于转运肽连接的成熟蛋白不同引起的。Lin等[37]也观察到叶绿体蛋白呈斑点状，推测可能是蛋白含量过高引起的，进一步表明这种斑点现象是由于表达蛋白之间的互作引起的，当将互作关键结合域去掉后这种斑点状现象就消失了，故极有可能是外源蛋白与其他蛋白之间发生了互作而呈现的一种现象。本研究还发现，目的蛋白的转运效率低于GFP的转运，进一步表明叶绿体蛋白的转运不仅与转运肽密切相关，还与被转运蛋白密切相关，即使相同转运肽的情况下，转运蛋白的不同也可能导致转运效率不同。综上，在进一步应用集胞藻PCC6803 gdh改造C3植物光呼吸中，可以考虑使用光诱导型的启动子来启动gdh的表达[38]，使目的基因只有在光照的条件下才启动表达，以期解决目的蛋白转运效率较低而在细胞质中聚集的现象。此外，除了使用传统的遗传转化法将目的基因整合到植物核基因组，还可以尝试通过叶绿体转化的方法将目的基因直接整合到叶绿体基因组[39]，使目的蛋白直接在叶绿体中表达，可省去目的蛋白从细胞质转运到叶绿体的过程，这尤其适用于一些不能有效转运到叶绿体的目的蛋白。本研究为利用外源gdh等基因改造C3植物的光呼吸代谢途径奠定了理论基础，为进一步实际应用多基因表达系统调控植物光呼吸代谢尤其是C3作物的光呼吸代谢，提高作物光合速率开辟了新的思路和方向。

4 结论

本研究初步探讨了融合蛋白RCTP-GDH-eGFP的叶绿体定位效率，结果表明RCTP-GDH-eGFP可以定位到水稻叶绿体，但其转运效率低于RCTP-eGFP的转运效率而更多地滞留在细胞质中，同时融合蛋白易于聚集而呈斑点状，有可能是融合蛋白易于与其他未知蛋白互作等原因造成的。因此，外源蛋白的叶绿体定位效率不仅与叶绿体定位信号有关，也可能与外源蛋白本身有关，如外源蛋白的表达量、空间结构以及是否有互作蛋白等，但准确的结论仍需要进一步研究。本研究结果为利用或改造集胞藻PCC6803乙醇脱基因调控植物光呼吸代谢途径，进一步利用多基因表达系统改良C3作物的光呼吸代谢途径，抑制光呼吸提高光合效率，提高作物产量等奠定了一定的理论基础。

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