苦丁茶(Ilex kudingcha)，属于冬青科冬青属苦丁茶种常绿乔木，主要分布在我国两广地区和福建等地(Li et al, 2013)。其含有茶多酚、黄酮、多糖、生物碱以及多种微量元素等药效成分(车彦云等, 2017)。茶多糖是一种复合多糖，作为一种天然活性物质已被证实具有防治心血管疾病、抗氧化、降血脂、抗病毒以及降血糖等保健及药用功效(Zhu et al, 2014)。随着对苦丁茶有效成分的研究，苦丁茶多糖得到了越来越多研究者的重视(Xu et al, 2015)。目前，提取多糖的传统方法有热水浸提(谢旻皓等, 2015)、酸提法(许春平等, 2014)、醇提取法(Zha et al, 2014)、水浴回流法(孙小梅等, 2014)以及超声波提取法(Li et al, 2015)等。其中：酸提法的提取时间和温度控制较严格，提取条件不易掌控；热水浸提、水浴回流等提取法容易导致多糖物质产生氧化、分解等反应，极大地影响多糖类物质的生物活性。这些方法都存在溶剂消耗大、环境污染、操作繁琐、提取率低等缺点。超临界CO2流体萃取技术(Sharif et al, 2014; de Melo et al, 2014)是一种新型的绿色提取技术，广泛应用于食品、化工、生物、中药等研究中(Sahena et al, 2009)。该技术能够防止多糖物质被氧化，使其生物活性得到最大限度保留，并且操作简便，在萃取过程中无试剂残留、无污染以及低耗等。目前尚未见有超临界CO2萃取苦丁茶多糖的相关报道，因此使用超临界CO2萃取工艺改革传统的苦丁茶多糖提取工艺具有重要意义。

本研究对超临界CO2萃取广西苦丁茶中多糖的工艺条件进行了分析，采用苯酚-硫酸法对苦丁茶多糖含量进行测定，考察了萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂以及夹带剂浓度对多糖得率的影响，通过设计正交实验方案，对其提取工艺进行了优化，旨在为苦丁茶的质量标准制定、应用以及药物开发提供参考依据。

SWOT Analysis and Counter Measures of Electric Power Design Enterprises Participating in PPP Projects TIAN Jie(141)

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器：泰尔超临界CO2萃取系统Thar-SFE-5000；Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)；F160型粉碎机( 北京中兴伟业)；SQP型(精度0.01 mg)电子天平(德国Sartorious公司)；CAP225D型(精度0.1 mg)电子天平(德国Sartorious公司)；气体CO2(99.99%，购于广西柳州富斯特工业气体有限责任公司)。材料：苦丁茶(购于广西太华医药有限公司，产地为广西崇左)。

1.2 方法

1.2.1 单因素实验设计(Orosz et al, 2016) 根据实验条件以及影响超临界CO2萃取的各因素的重要性，选取萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂、萃取夹带剂用量5个因素进行单因素实验，考察苦丁茶多糖的萃取得率。实验萃取温度分别选择35、40、45、50、55、60 ℃；萃取压力分别为20、25、30、35、40、45、50 MPa；萃取时间分别为30、60、90、120、150 min以及夹带剂分别选择甲醇、95%甲醇、50%甲醇、无水乙醇、95%乙醇、50%乙醇；夹带剂(95%乙醇)用量选择分别为2.0、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0 mL·min-1。

思不在广，贵在深。贫困不是新生事物，也不是一国一地独有，更不是阵痛小疾，具有长期性、艰巨性和复杂性。总书记着眼国内聚焦发展，放眼世界规划长远，适时提出了“一带一路”倡议和“人类命运共同体”理念，以一国之减贫实践推动全世界之减贫进程，以中国之减贫模式倡树全球之减贫事业，为全人类消除贫困、饥痛贡献了中国智慧和中国力量。他呼吁：“让我们携起手来，为共建一个没有贫困、共同发展的人类命运共同体而不懈奋斗！”

1.2.2 正交实验设计 根据单因素实验的结果，以苦丁茶多糖得率为实验的考察指标。实验从中选择合适的萃取温度、萃取压力、萃取时间以及夹带剂用量进行四因素三水平的正交实验(Zhao et al, 2013)。因素水平表见表1。

 

表 1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

  

水平Level因素FactorsA萃取温度Extraction temperature(℃)B萃取压力Extraction pressure(MPa)C萃取时间Extraction time(min)D夹带剂流量Cosolvent flow rate(mL·min-1)14535603.0250401203.5355451504.0

式中，C为苦丁茶多糖的质量浓度，m为苦丁茶的质量(g)，V为经超临界萃取所得总苦丁茶多糖样品溶液的体积(mL)。

2.1.1 萃取压力对萃取率的影响 采用95%乙醇作为夹带剂，在萃取实验温度为40 ℃、夹带剂流量为2.0 mg·mL-1、萃取时间为60 min的条件下，分别测定不同萃取压力下对苦丁茶多糖萃取率的影响(图1)。由图1可知，苦丁茶多糖的萃取率随着萃取压力的增高而升高，当压力超过40 MPa时，苦丁茶多糖的萃取率变化不大，甚至有下降的趋势。当增大萃取压力时，使得萃取过程中超临界CO2的密度增加，溶质和溶剂之间的传质效率得到了提高，从而增大了苦丁茶多糖的溶解度，提高了萃取率。当萃取压力升高到一定程度时，目标萃取物的萃取率并无明显变化，并且，压力过高使得萃取成本增高，同时高压力不安全因素也增多。根据方差分析，萃取率在低于或高于40 MPa时具有显著差异(P<0.05)。因此，选取萃取压力为35、40、45 MPa进行正交实验。

2.1.3 萃取时间的影响 图3结果显示，随着萃取时间的增加，苦丁茶多糖的萃取率不断增高，在萃取时间为120 min后，萃取率增加缓慢。由于萃取时间越长，CO2流体能更充分地接触苦丁茶物料，萃取越完全，并提高了萃取率。但当萃取达到一定时间后，萃取率无明显变化，此外萃取时间过长也可能导致多糖产生不稳定性而影响提取率，过长时间的萃取还会带来过高的萃取成本。因此，在本研究中，根据此单因素实验，选择60、120、150 min萃取时间进行正交实验分析。

2.1.4 夹带剂的影响 由于糖类化合物的羟基较多、分子量较大且极性较大，所以很难用低极性溶剂进行萃取，因此为了提高提取率可在萃取过程中加入极性较高、选择性好、安全的夹带剂对多糖进行提取。本研究分别选择甲醇、95%乙醇、50%甲醇、无水乙醇、95%乙醇、50%乙醇作为夹带剂，考察夹带剂在萃取过程中对多糖提取率的影响，结果如图4所示。流量为2.0 mL·min-1时，95%乙醇作为萃取夹带剂具有较高提取率，因此，选择95%乙醇作为苦丁茶多糖萃取的夹带剂。

1.2.3 苦丁茶多糖测定 采用苯酚-硫酸法(黄敏桃等, 2014)对苦丁茶多糖进行测定：精密称取无水葡萄糖纯品12.45 mg，超纯水定容于50 mL容量瓶中作为标准溶液，分别吸取0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 mL，置10 mL棕色容量瓶中，随后再分别加入1.0 mL的6%苯酚溶液， 轻摇混匀后再加入7.0 mL硫酸，混匀后于室温下放置30 min，以超纯水定溶，混匀，于482 nm波长下测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

以横坐标为葡萄糖含量(mg·mL-1), 纵坐标为吸光度值做曲线，得到标准曲线回归方程为A=0.049 9 C-0.001 5 (n=7), r=0.999 1。由标准曲线方程计算萃取得到的苦丁茶样品中多糖的质量浓度C，并计算萃取率(李加兴等, 2013)。

由于布置的预习作业相对于以往的其他形式的作业来说，教师并未重视预习成果的检查。学生毕竟是未成年人，在一定程度上往往存在着惰性心理，如果教师对其预习情况不闻不问，不进行督促性的评价和检查，久而久之，学生在心理上就会淡化预习的概念，就会以无所谓的态度来对待语文预习。因此，这样就会导致预习流于形式。

  

注： 萃取温度40 ℃；夹带剂(95%乙醇)流量2.0 mL·min-1； 萃取时间60 min。Note: Extraction temperature 40 ℃; Cosolvent flow rate (95% ethanol) 2.0 mL·min-1; Extraction time 60 min.图 1 萃取压力对苦丁茶多糖提取率的影响Fig. 1 Effects of extraction pressure on polysaccharide extraction rate

2.1.2 萃取温度对萃取率的影响 在萃取压力为40 MPa，提取时间为60 min，夹带剂(95%乙醇)流量为2.0 mL·min-1的条件下，考察不同萃取温度(35、40、45、50、55、60 ℃) 对苦丁茶多糖萃取率的影响(图2) 。图2结果显示，苦丁茶多糖的萃取率随温度增高而升高，当温度高于50 ℃时，过高的温度使得CO2的密度降低溶解能力也随之下降，从而使得苦丁茶多糖的溶解度发生下降，同时过高的温度会导致苦丁茶多糖的不稳定性增加，使得其提取含量受到一定影响。根据此单因素实验，选择正交实验的萃取温度为45、50、55 ℃。

  

注： 萃取压力40 MPa； 夹带剂(95%乙醇)流量2.0 mL·min-1；萃取时间60 min。Note: Extraction pressure 40 MPa; Cosolvent flow rate (95% ethanol) 2.0 mL·min-1; Extraction time 60 min.图 2 萃取温度对苦丁茶多糖提取率的影响Fig. 2 Effects of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

苦丁茶多糖萃取率(%)=C×V/m×100。

  

注： 萃取压力40 MPa； 夹带剂(95%乙醇)流量2.0 mL·min-1； 萃取温度40 ℃。Note: Extraction pressure 40 MPa; Cosolvent flow rate (95% ethanol) 2.0 mL·min-1; Extraction temperature 40℃.图 3 萃取时间对苦丁茶多糖提取率的影响Fig. 3 Effects of extraction time on polysaccharides extraction rate

选取2017年2月～2018年8月进行冠脉PCI术的心房颤动患者72例作为研究对象，以随机分配法将其划分为实验组与对照组。其中，实验组男20例，女16例，平均年龄（60.3±5.8）岁，存在高血压与高脂血症疾病各16例，8例存在糖尿病，充血性心衰与甲状腺功能异常各4例，2例存在外周血管性疾病；对照组男19例，女17例，平均年龄（60.5±5.6）岁，16例存在高血压，15例有高脂血症，8例存在糖尿病，5例有充血性心衰，4例为甲状腺功能异常，存在外周血管性疾病者2例。对两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

本课题组开发的香辣香菇风味酱根据GB/T 20903-2007标准属于复合调味料项下的风味酱[5]。由于尚未制定相应的国家限量标准，因此参照NY/T 1886-2010《绿色食品复合调味料》中酸价、过氧化值、氨基酸态氮、Pb的限量标准[6]，参照 Q/XXS 0003S-2017企业标准中的水分限量标准对香菇酱调味品进行质量检查[7]。此外，还根据国家食品测定标准对香菇酱中的灰分、pH、脂肪进行测定。

2.1.5 夹带剂流量的影响 用萃取压力40 MPa、萃取温度50 ℃、提取时间90 min，分别设置夹带剂流量在2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0 mL·min-1时进行实验，考察夹带剂流量对萃取苦丁茶多糖萃取率的影响(图5)。方差分析表明，苦丁茶多糖得率与3.0～4.0 mL·min-1的夹带剂流量差异显著(P<0.05)。因此，根据此单因素实验，选择3.0、3.5、4.0 mL·g-1的夹带剂流量进行正交实验分析。

2.2 正交实验结果与分析

根据2.1的单因素试验结果，选定萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂流量进行四因素三水平的正交试验，结果见表2。 由表2可知，影响苦丁茶多糖萃取得率最显著的因素是萃取温度，其次为萃取压力、萃取时间、夹带剂流量，各因素不同水平影响次序为A2>A3>Al，B2>B3>B1，C3>C2>Cl，D2>D3>Dl，A2B2C3D2为极差分析得到的最优萃取条件组合，即萃取温度50 ℃、萃取压力40 MPa，夹带剂流量3.5 mL·min-1、萃取120 min。在最佳工艺条件下对苦丁茶进行3次萃取平行试验，平均萃取得率为7.05%。

  

注： 萃取压力40 MPa； 夹带剂流量2.0 mL·min-1； 萃取温度40 ℃； 萃取时间60 min。Note: Extraction pressure 40 MPa; Cosolvent flow rate 2.0 mL·min-1; Extraction temperature 40 ℃; Extraction time 60 min.图 4 夹带剂对苦丁茶多糖提取率的影响Fig. 4 Effects of cosolvent on polysaccharides extraction rate

  

注： 萃取压力40 MPa； 萃取时间90 min； 萃取温度40 ℃。Note: Extraction pressure 40 MPa; Extraction time 90 min; Extraction temperature 40 ℃.图 5 夹带剂流量对苦丁茶多糖提取率的影响Fig. 5 Effects of cosolvent flow rate on polysaccharides extraction rate

3 讨论与结论

萃取压力(Wen et al, 2015)对于目标萃取物的萃取具有重要影响，萃取压力是影响苦丁茶多糖超临界CO2萃取过程中溶解度的一个重要参数。

 

表 2 正交实验设计结果Tbale 2 Result and analysis of orthogonal test

  

实验号Test numberABCD萃取率Extraction rate (%)111115.36212226.06313336.63421235.68522317.03623126.78731326.53832136.39933215.86k15.485.826.336.45k26.726.556.427.01k36.416.386.946.86R0.930.730.610.56

萃取温度对于苦丁茶多糖提取率也具有一定的影响(Dent et al, 2013)。在超临界萃取过程中夹带剂起到助溶作用(Daporto et al, 2014)，能够更有效地将目标物提取出来。本研究通过单因素实验得到的结果，确定了萃取温度、萃取压力、萃取时间以及夹带剂用量四个主要影响因素进行四因素三水平的正交实验，探索出了苦丁茶多糖超临界CO2流体萃取的最佳提取工艺，建立了一种超临界CO2流体萃取法从苦丁茶中提取多糖的方法。相较于传统的提取方法，超临界CO2流体萃取能够在低温下萃取苦丁茶多糖并能够最大限度保留多糖的生物活性；在整个萃取过程中唯一使用的有机试剂为夹带剂(95%乙醇)，能够与CO2流体混溶提高了多糖的在CO2流体中的溶解度，并能够在萃取结束后对夹带剂进行回收，无有机试剂残留、无污染以；此外，超临界CO2流体萃取苦丁茶多糖操作简便、低耗、生产周期短。

本研究建立的苦丁茶多糖超临界CO2流体萃取法工艺条件稳定可行，具有较好重现性，苦丁茶多糖的萃取得率达7.05%，优于施思等(2010)和于淑池等(2015)的报道，与传统的热水浸提相比萃取得率提高了将近两倍，可为苦丁茶多糖的有效提取以及苦丁茶的药用价值以及保健作用的深入开发提供新的参考依据。

综上所述，超临界CO2流体萃取具有提取温度低、萃取率高、萃取周期短、低耗以及污染小等优点，适用于苦丁茶多糖的提取。

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